CN114910567B

CN114910567B - 一种检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法及其应用

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Publication number: CN114910567B
Application number: CN202110169107.9A
Authority: CN
Inventors: 张议; 王玲兰; 朱婧; 谭典; 罗琼枝; 田静; 陆才洋; 朱颖熹
Original assignee: Hunan Qianjin Xiangjiang Pharmaceutical Co ltd; Qianjin Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hunan Qianjin Xiangjiang Pharmaceutical Co ltd; Qianjin Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-02-07
Filing date: 2021-02-07
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2041-02-07
Also published as: CN114910567A

Abstract

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及一种检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法及其应用。所述方法包括通过高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法中，采用流动相A和流动相B进行洗脱；所述流动相A包括0.03‑0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为乙腈。本发明通过对高效液相色谱法中的各项条件进行了优化，得以检测非那雄胺合成中的潜在遗传毒性杂质，尤其是结构非常类似的DDQ和DDHQ。同时，本发明提供的方法检测方法灵敏度高，准确度高，耐用性好，稳定性好。

Description

一种检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及一种检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法及其应用。

背景技术

药物中含量很低的遗传毒性杂质，都可能会引起人体基因发生突变或染色体断裂和重排，进而引发肿瘤。基因毒性杂质主要来源于原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂和反应副产物。此外，药物在合成、储存或者制剂过程中也可能会降解产生基因毒性杂质。因此在药物中对基因毒性杂质的监管要求越来越高。杂质如果控制不当，可能会导致临床隐患，由此对分析方法提出了很高的要求。

非那雄胺(N-(1,1-二甲基乙基)-3-氧-4-氮杂-5-甾-1-烯-17-酰胺)是一种合成的4-N-杂甾体化合物，具有竞争和特定抑制作用的II型5α-还原酶抑制剂，通过激素调节机制缩小前列腺体积，缓解症状，增加尿流率，并延缓疾病进展。适用于治疗和控制良性前列腺增生症(BPH)、以及预防泌尿系统事件，可使肥大的前列腺缩小，改善尿流及改善前列腺增生有关的症状。

非那雄胺的结构式如下：

非那雄胺合成路线长、工艺难度大、立体结构复杂，易产生潜在遗传毒性杂质。现有技术中已知的非那雄胺分离检测方法，尚不能很好地将各种潜在遗传毒性杂质同时进行分离和检测。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法及其应用。通过对高效液相色谱的方法中各项参数进行优化，可以准确区分非那雄胺中DDQ和DDHQ这两种遗传毒性杂质。

第一方面，本发明提供一种检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法，包括：通过高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法中，采用流动相A和流动相B进行洗脱；所述流动相A包括0.03-0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为乙腈。

进一步地，所述流动相A为0.03-0.06mol/L磷酸二氢钾溶液，pH为3～5；所述流动相B 30％～80％乙腈。

进一步地，所述流动相A和所述流动相B的流速为0.9-1.1ml/min，优选为1ml/min。

进一步地，所述高效液相色谱法中，检测波长为220～210nm，优选为220nm。

进一步地，所述洗脱的洗脱程序如下：

进一步地，所述高效液相色谱法中，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；和/或，柱温为30～40℃；和/或，进样量为15～20μL。

本发明进一步提供所述方法在非那雄胺质量控制中的应用。

进一步地，所述质量控制为检测非那雄胺中的遗传毒性杂质，所述遗传毒性杂质为卤化物。

进一步地，所述卤化物为2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌、4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈，结构式如下：

进一步地，所述检测非那雄胺中遗传毒性杂质为，分别对2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌和4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈进行定量检测。

本发明具备如下有益效果：

现有技术中，对药物基因毒性杂质的检测，往往选用液质联用技术或者气质联用技术进行才能满足其灵敏度和选择性要求，而本发明经研究发现采用本发明的HPLC法可实现非那雄胺中遗传毒性杂质(2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌、4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈)的高灵敏度、准确性的检测。而当换用其他类似流动相或洗脱程序后，检测效果均不理想(难以区分2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌、4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈)。

本发明对2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌、4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈的检测限分别为0.56ng、0.60ng；定量限分别为1.12ng、1.19ng，线性范围分别为55.88ng/ml～1117.60ng/mL(r＝1.000)；59.60ng/ml～1192.00ng/ml，(r＝1.000)，且方法耐用性好。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的专属性测试典型色谱图；

图2为本发明实施例1提供的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)线性图；

图3为本发明实施例1提供的4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈(DDHQ)线性图；

图4为本发明实施例1提供的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)检测限图谱；

图5为本发明实施例1提供的4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈(DDHQ)检测限图谱；

图6为本发明实施例1提供的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)定量限图谱；

图7为本发明实施例1提供的4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈(DDHQ)定量限图谱；

图8为本发明实验例1提供的最大吸收波长PDA扫描图谱；

图9为本发明实验例1提供的流动相B改用甲醇后的的系统适用性检测结果；

图10为本发明实验例1提供的实施例1所示方法的系统适用性检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明具体实施方式中所用的主要仪器与试剂如下：

Waters e2695型高效液相色谱仪(沃特世科技有限公司)、Wondasil C18，(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱(GL Sciences株式会社)、MS105DU和ME105DU型电子天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)、PB-10型pH计(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。

磷酸二氢钾为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈为色谱纯(TEDIA)；2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(湖北葛店人福药业有限责任公司)、4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈(湖北葛店人福药业有限责任公司)。

实施例1

本实施例提供一种采用HPLC色谱法检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂Wondasil C18，(150mm×4.6mm，5μm)；以0.04mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，乙腈为流动相B，按下表1所示流程进行线性梯度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；检测波长为220nm；进样量为20μL。

表1梯度表

本实施例对上述检测方法进行了专属性、精密度、溶液稳定性、准确度、线性范围、定量限、检测限和耐用性的验证，具体步骤如下：

1、专属性

分别取DDQ、DDHQ各15mg，精密称定，分别置于50mL量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得杂质母液。分别精密量取DDQ、DDHQ杂质母液，加50％乙腈稀释10倍，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取DDQ、DDHQ对照品储备液，加50％乙腈稀释50倍，摇匀，作为对照品母液。再分别精密量取对照品母液，加50％乙腈稀释10倍，摇匀，作为对照品溶液。

系统适用性溶液：取非那雄胺约80mg，精密称定，置于20mL量瓶中，加50％乙腈适量使溶解，再精密量取DDQ、DDHQ对照品母液各2ml，加50％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

系统适用性要求：DDQ、DDHQ、非那雄胺依次出峰，各峰间的分离度均应大于1.5。

混合杂质定位溶液：分别取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D约10mg置于100ml容量瓶中加50％的乙腈稀释至刻度，然后稀释5倍得到混合杂质定位溶液。

杂质E、杂质F定位溶液：分别取杂质E约0.1mg和杂质F约0.4mg置于不同液相小瓶中，加50％乙腈1.5ml溶解，然后稀释10倍得杂质E、F定位溶液。

其中，DDQ为2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌；DDHQ为4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈；

杂质A为N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾-17β-甲酰胺，来源为湖北葛店人福药业有限责任公司；

杂质B为3-氧代-4-氮杂-5α-雄烯-1-烯-17β-羧酸甲酯，来源为上海启太生物科技有限公司；

杂质C为N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂雄甾-1,5-二烯-17β-甲酰胺，来源为上海启太生物科技有限公司；

杂质D为N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-雄甾5-烯-17β-甲酰胺，来源为湖北葛店人福药业有限责任公司；

杂质E为5,6,7,8,9-脱氢-10-去甲基非那雄胺，来源为QCC；

杂质F为[(N-叔丁基)氨基]羰基-17β-(丙酰基)非那雄胺，来源为QCC；

供试品溶液：取非那雄胺约80mg，置于20ml容量瓶中，加50％的乙腈稀释至刻度。

取空白溶剂、混合杂质定位溶液、杂质E定位溶液、杂质F定位溶液、对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果参见图1，从图1中可以看出空白溶剂、非那雄胺、杂质A、B、C、D、E、F均不干扰DDQ、DDHQ检测，专属性符合要求。样品具体保留时间见表2。

表2定位结果表

注：杂质A和杂质C出峰时间相同。

2、溶液稳定性

取专属项下的对照品溶液和加标供试品溶液在室温下放置，于0、8、12、24、36h，分别精密量取20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。DDQ和DDHQ的对照品溶液的配置方法见实施例1中专属项的检测，加标供试品的配置方法如下：分别取非那雄胺80mg、专属项下的对照品母液DDQ和DDHQ各2ml置于20ml容量瓶中，加入50％的乙腈稀释至刻度。

结果与0h相比，对照品溶液中DDQ、DDHQ峰面积变化率最大分别为-9.1％、-1.1％；加标供试品溶液中DDQ、DDHQ峰面积变化率最大分别为-7.6％、-3.3％，均在10％以内，溶液稳定性符合要求。具体各时间点峰面积测试结果见表3和表4。

表3对照品溶液稳定性结果表

表4供试品溶液稳定性结果表

3、准确度

对照品母液配制同专属性项下。

本底溶液：取本品(非那雄胺)约80mg，精密称定，置于20mL量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为本底溶液。

DDQ准确度供试品溶液：取本品(非那雄胺)约80mg，精密称定，置于20mL量瓶中，再精密量取DDQ对照品母液1mL、2mL、3mL置于同一该20mL量瓶中，得含DDQ 300ng/mL(50％)、600ng/mL(100％)、900ng/mL(150％)的供试品溶液；每个浓度平行配制3份。

DDHQ准确度供试品溶液：取本品约80mg，精密称定，置于20mL量瓶中，精密量取DDHQ对照品母液1mL、2mL、3mL置于该20mL量瓶中，得含DDHQ 300ng/mL(50％)、600ng/mL(100％)、900ng/mL(150％)的供试品溶液；每个浓度平行配制3份。

精密量取对照品溶液、本底溶液和加标供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。本底溶液中DDQ和DDHQ均未检出，DDQ回收率在80.5％～108.9％之间，平均回收率为98％，RSD为10％，小于15％；DDHQ回收率在97.6％～99.3％之间，平均回收率为99％，RSD为1％，小于15％，准确度符合要求。具体测试结果见表5。

表5准确度结果

4、线性与范围

对照品储备液配制同专属性项下。

线性储备液：分别精密量取DDQ、DDHQ对照品储备液各5mL，分别置于50ml量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，作为线性储备液。

200％浓度：精密量取线性储备液2mL，置于50mL量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，作为线性1；

100％浓度：精密量取线性储备液2mL，置于100mL量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，作为线性2；

50％浓度：精密量取线性储备液1mL，置于100mL量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，作为线性3；

20％浓度：精密量取线性储备液1mL，置于250mL量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，作为线性4；

10％浓度：精密量取线性储备液0.5mL，置于250mL量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，作为线性5；

精密量取上述线性1溶液～线性5溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程及相关系数。

结果DDQ线性相关系数r为1.000，大于0.990，Y轴截距与100％浓度响应值的比值为5.7％，小于20.0％，在55.88ng/mL～1117.60ng/mL范围内呈线性；DDHQ线性相关系数r＝1.000，大于0.990，Y轴截距与100％浓度响应值的比值为1.2％，小于20.0％，在59.60ng/mL～1192.00ng/mL范围内呈线性；线性符合要求。具体参见表6、表7及图2、图3。

表6 DDQ线性与范围结果

表7 DDHQ线性与范围结果

5、定量限与检测限

取对DDQ、DDHQ对照品溶液逐级稀释成一系列浓度的溶液进行测定，精密量取20μL注入高效液相色谱仪，按信噪比S/N≥3作为检测限，按信噪比S/N≥10作为定量限，定量限溶液连续进样六针。结果DDQ、DDHQ检测限分别为0.56ng(7ppm)、0.60ng(7ppm)，信噪比分别为8.9、51.9，均大于3；DDQ、DDHQ定量限为1.12ng(14ppm)、1.19ng(15ppm)，信噪比分别为24.5、135.4，均大于10，RSD分别为7.6％、3.4％，均小于10.0％；检测限与定量限符合要求。检测限具体结果数据见表8(图4和图5为检测限图谱)。定量限具体结果数据见表9(图6和图7为定量限图谱)。

表8检测限结果表

名称	S/N	峰面积	检测限(ng)	检测限(ppm)
					DDQ	8.9	647	0.56	7
DDHQ	51.9	2872	0.60	7

表9定量限结果表

6、不同条件下的准确度

按照专属性项下配制对照品溶液和溶液稳定性项下加标供试品溶液，精密量取上述溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。试验条件按照下表10变化，照外标法计算杂质含量。结果见表11，在一定试验条件范围内测定值与理论值(DDQ、DDHQ均为150ppm)的差值均在理论值的±10％范围内，但是超过一定范围后，其准确度降低，且标准条件下的准确度最高(实施例1的检测条件)。

表10试验条件表

具体测试结果见表11。

表11不同条件的准确度表(ppm)

实施例2

本实施例按照实施例1的检测方法，调整流动相为50％～80％乙腈溶液，或者90％的乙腈溶液，其溶剂化效应均比较小，且DDQ和DDHQ的分离度均大于1.5。

对比例1

本对比例按照实施例1的检测方法，调整流动相为20％乙腈溶液，将非那雄胺及其杂质在此流动相进行溶解，发现非那雄胺析出，因此无法进行检测。

对比例2

本对比例按照实施例1的检测方法，将流动相B改为100％的甲醇，发现DDQ与溶剂峰的保留时间很接近(如图9所示)，影响杂质的检测。

当流动相为甲醇时，为进一步提高溶剂与杂质DDQ的分离度，按照对比例1的方法进行检测，将流动相改为20％～30％的甲醇，发现非那雄胺及其杂质在此流动相下析出，无法检测。

当流动相改为60％～80％的甲醇溶液时，DDQ与溶剂峰的保留时间更接近，影响杂质的检测。

实验例1

本实验例针对实施例1和对比文件2(流动相B改为100％甲醇的技术方案)进行了对比。

一、溶剂的选择

分别采用甲醇和乙腈作为流动相B，测量溶液稳定性结果如下：

表12对照品溶液稳定性结果表(流动相B为甲醇)

表13供试品溶液稳定性结果表(流动相B为甲醇)

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表14对照品溶液稳定性结果表(流动相B为乙腈)

表15供试品溶液稳定性结果表(流动相B为乙腈)

从上表中可以得出结论：使用甲醇作为流动相B，DDQ对照品溶液和供试品溶液稳定性(S_变化率＜10％)只有12h；而使用乙腈作为流动相B，DDQ、DDHQ对照品溶液和供试品溶液稳定性均可达24h。

因此使用乙腈作为流动相B优于甲醇，为避免溶剂化效应，配样溶剂也从50％甲醇更换为50％乙腈。

二、检测波长的选择

取系统适用性溶液，精密量取20μL注入液相色谱仪，使用PDA检测器于190nm～400nm范围内扫描，记录色谱图，得到如下表和图8所示结果：

表16吸收波长扫描结果

	最大吸收波长(nm)
		DDQ	193.2
DDHQ	216.7

结果显示：DDQ最大吸收波长193.2nm波长靠近溶剂末端吸收、专属性较差，故检测波长选择220nm，与DDHQ最大吸收波长216.7nm接近，且DDQ处于波谷位置专属性较好。

当用280nm的波长进行检测时，检测方法如实施例1的检测限和定量限，经计算DDQ和DDHQ的检测限和定量限分别为15ppm和25ppm，均比实施例1高，降低了检测灵敏度。

三、液相方法选择

本实验例进一步使用本发明实施例1的方法和对比例2(流动相B改用甲醇)进样检测系统适用性溶液，得到如图9(对比例2)和图10(实施例1)所示结果，结果显示：对比例2方法中DDQ保留时间较短(4.673min)与溶剂干扰峰较为接近分离，影响检测，而本发明实施例1所示方法的DDQ保留时间后移至7.447min，避开溶剂干扰峰，专属性较好。

综上所述，本发明实施例1所示方法和对比例2所示相比，检测波长选择波峰/波谷位置，杂质干扰较小，流动相可以避开溶剂中杂质干扰，专属性更好。

并且本发明实施例1所示方法可同时检测DDQ和DDHQ，检测限分别为7ppm、7ppm，定量限分别为14ppm、15ppm(参照实施例1中的记载)。本发明同时使用乙腈代替甲醇，可以防止甲醇与DDQ和DDHQ反应，造成结果不准确，且稳定性更好，150ppm浓度下的供试品溶液、对照品溶液均可在室温放置24h。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，包括：通过高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法中，采用流动相A和流动相B进行洗脱；所述流动相A包括0.03-0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为50~80%乙腈，或90%乙腈，或纯乙腈；

所述高效液相色谱法中，色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；

所述洗脱的洗脱程序如下：

时间流动相A 流动相B

0 min 70% 30%

45 min 20% 80%

55 min 70% 30%

60 min 70% 30% ；

所述遗传毒性杂质为2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌，和/或，4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A为0.03-0.06mol/L磷酸二氢钾溶液，pH为3~5。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流动相A和所述流动相B的流速为0.9-1.1ml/min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述流动相A和所述流动相B的流速为1ml/min。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，检测波长为220~210nm。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，检测波长为220nm。

7.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，柱温为30~40℃；和/或，进样量为15~20μL。

8.权利要求1-7任一项所述方法在非那雄胺质量控制中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测非那雄胺中遗传毒性杂质为，分别对2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌和4,5-二氯-3,6-二羟基邻苯二甲腈进行定量检测。