CN114874319B

CN114874319B - 一种用于急性肾损伤检测的cryab抗体及其应用

Info

Publication number: CN114874319B
Application number: CN202210742315.8A
Authority: CN
Inventors: 娄强; 李晓东; 孙笑莹; 梁晗; 侯贝贝
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2042-06-27
Also published as: CN114874319A

Abstract

本发明中公开了一种用于急性肾损伤检测的CRYAB抗体，所述CRYAB抗体的抗原为αB‑晶状体蛋白的第67‑149位氨基酸序列，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述CRYAB抗体为小鼠抗人CRYAB多克隆抗体。本发明同时提供该CRYAB抗体在制备用于急性肾损伤检测试剂盒中的应用。本发明中以αB‑晶状体蛋白为抗原制备的小鼠抗人CRYAB多克隆抗体作为急性肾损伤的检测标志物，可以有效的对肾损伤程度进行分级，且显著提高检测效率。

Description

一种用于急性肾损伤检测的CRYAB抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于急性肾损伤检测的CRYAB抗体及其应用。

背景技术

急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是由于不同原因引起的临床常见、发病率和死亡率极高的肾脏疾病，急性肾损伤最早出现在近端肾小管上皮细胞，并表现为各种形式的细胞死亡。迄今尚无有效治疗急性肾损伤的药物，临床治疗手段多采用支持治疗，比如透析等辅助治疗手段。因此，早期诊断和早期治疗是最好的防治急性肾损伤的策略。

目前可用于早期检测急性肾损伤的工具缺乏敏感性和特异性，主要采取病人组织HE染色来用于区分不同程度的肾损伤，但是HE染色过程复杂且费时较长，因此，开发有效的生物标志物将有助于对损伤进行分级，并且检测具有慢性肾疾病发展风险的那些患者。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的缺乏用于早期检测急性肾损伤的生物标志物的问题，提供一种用于急性肾损伤检测的CRYAB抗体及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于急性肾损伤检测的CRYAB抗体，所述CRYAB抗体的抗原为αB-晶状体蛋白的第67-149位氨基酸序列，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，所述CRYAB抗体为小鼠抗人CRYAB多克隆抗体。

本发明同时提供上述CRYAB抗体在制备用于急性肾损伤检测试剂盒中的应用。

本发明所具有的有益效果：本发明中以αB-晶状体蛋白的第67-149位氨基酸序列为抗原制备的小鼠抗人CRYAB多克隆抗体，该多克隆抗体应用于急性肾损伤的检测试剂盒中，可以有效的对肾损伤程度进行分级，且显著提高检测效率。

附图说明

图1为实施例1中重组质粒构建成功的电泳验证图；

图2为实施例2中小鼠抗人CRYAB多克隆抗体的抗原结合位点验证的免疫印迹图；

图3为实施例4中CRYAB蛋白标准品浓度与OD450值关系的标准曲线；

图4为实施例4中Pearson相关性分析CRYAB表达强弱与肾损伤程度的关系图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1小鼠抗人CRYAB多克隆抗体的制备

PCR扩增编码αB-晶状体蛋白第67-149位氨基酸序列(CRYAB核心抗原)的基因片段，如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，长度为249bp。利用KpnI和NotI双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-CRYAB-His-Ampicillin，对重组质粒构建的验证如附图1所示，DNA Marker来源于TAKARA公司(货号DL2000)。将构建成功的重组质粒转染293F细胞，纯化上清中表达的CRYAB抗原蛋白，获得蛋白浓度为5.29mg/mL。免疫6-8周龄BALb/c小鼠，免疫剂量为100μg/次/只，共免疫三次，每次免疫间隔两周。首次免疫采用完全福式佐剂与蛋白比例1：1混匀后腹腔注射，再次免疫采用不完全福式佐剂与蛋白比例1：1混匀后腹腔注射，末次免疫采用纯蛋白腹腔注射。获得小鼠抗人CRYAB多克隆抗体，浓度为200μg/mL。

实施例2小鼠抗人CRYAB多克隆抗体的抗原结合位点验证

PCR扩增编码αB-晶状体蛋白全长(CRYAB抗原蛋白全长)的基因片段，如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列，长度为528bp。同时，采用PCR分别扩增编码CRYAB蛋白N端、核心区、C端、C端+核心区的基因片段，然后构建以下重组质粒：pEBG-CRYAB全长(含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的1-528位核苷酸)、pEGB-CRYAB N端(含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第1-198位)、pEGB-CRYAB核心区(含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第199-447位核苷酸)、pEGB-CRYAB C端(含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第448-528位核苷酸)、pEGB-CRYAB C端+核心区(含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第199-528位核苷酸)。上述重组质粒分别被转染进HK2细胞后，进行蛋白表达，分别表达出CRYAB蛋白全长(1-175位氨基酸)、N端疏水区(1-66位氨基酸)、蛋白核心区(67-149位氨基酸)、C端亲水区(150-175位氨基酸)、C端亲水区+蛋白核心区(67-175位氨基酸)；分别提取上述表达的细胞蛋白与小鼠抗人CRYAB多抗进行免疫印迹分析，以鉴定实施例1制备的小鼠抗人CRYAB多抗的抗原识别位点。具体步骤如下：

首先，细胞蛋白提取：收集细胞(本实施例以35mm培养皿为例)，收集培养液1000g离心5分钟，弃上清，1×PBS洗涤细胞并收集于同一离心管中1000g离心5分钟，弃上清。加入100μL蛋白裂解液，充分覆盖所有贴壁细胞，用干净的刮棒将细胞及裂解液刮于一侧并移入上述离心管，裂解片刻，15000g离心5分钟收集上清备用。

蛋白浓度测定及免疫印迹分析：配制BSA蛋白标准品终浓度依次为0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.05,0.025,0mg/mL。根据A液(1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16％酒石酸钠，0.4％氢氧化钠和0.95％碳酸氢钠混合调PH值至11.25)、B液(4％硫酸铜)50:1的比例混合配制工作液，将工作液按照每孔200μL加于96孔板中，并分别加入标准品及样品(稀释10倍)各10μL(各个样品测量3复孔)，60℃暖箱孵育1小时后，取出冷却5分钟，采用GENios plate-reader检测595nm波长吸光度值，绘制标准曲线并计算蛋白浓度(μg/μL)。将蛋白在95℃变性10分钟，在12％SDS-PAGE凝胶中电泳分离(恒压模式，电压150V，时间55分钟)。活化PVDF膜浸润于甲醇中数秒后转移入1×转膜缓冲液(190mM甘氨酸，2mM Tris碱，SDS 0.1％，200mL甲醇)中。恒流模式(电流300mA)转膜120分钟。在室温，用5％封闭试剂在TBST(Tris缓冲盐水和吐温)中进行封闭。在封闭步骤后，将膜在4℃用抗CRYAB一级抗体(1:1000，实施例1制备的小鼠抗人CRYAB多克隆抗体),HSP70一级抗体(1:1000,4873s,Cell SignalingTechnology)，HSP90一级抗体(1:1000,8165s,Cell Signaling Technology)温育。温育后，将膜用TBS-T洗涤三次，每次洗涤10分钟。随后，将1:5000的与过氧化物酶缀合的IgG山羊抗兔二级抗体(1:3000,7074,Cell Signaling Technology)或过氧化物酶缀合的IgG山羊抗大鼠二级抗体(1:3000,7077,Cell Signaling Technology)与膜在室温温育60分钟，并且将膜再次洗涤3次。使用商购的Super Signal West Pico化学发光试剂盒检测CRYAB等蛋白的量，并且扫描获得的条带进行图像灰度分析。

免疫印迹分析结果如附图2所示：小鼠抗人CRYAB抗体只与CRYAB蛋白的全长、核心区及C端+核心区结合，而不与C端或N端区域结合，说明实施例1制备的小鼠抗人CRYAB抗体的抗原结合位点存在于CRYAB蛋白的核心区。

实施例3小鼠抗人CRYAB多克隆抗体效价测定

将5μg/mL CRYAB重组蛋白抗原(实施例1制备)加入96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，PBST洗涤3次，每次5min；然后每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，于37℃封闭2h；以抗体制备免疫前血清为阴性对照，用PBS稀释实施例1中制备的小鼠抗人CRYAB多克隆抗体，稀释比例分别为1：1000，1：10000，1：100000，每孔加入100μL，37℃孵育2h，PBST洗涤3次，每次5min；每孔加入100μL经PBS 10000倍稀释的羊抗鼠HRP标记二抗，37℃孵育2h，PBST洗涤3次，每次5min；加入100μL TMB显色底物液，37℃避光孵育15min，终止反应后于酶标仪上读OD450值，以样品吸光度/阴性吸光度>＝2.1的抗体最高稀释度判为阴性。计算出小鼠抗人CRYAB多克隆抗体效价为1：10000。

实施例4不同程度肾损伤患者血清肌酐水平与CRYAB表达强弱的关系分析

测量不同程度肾损伤患者(大出血、造影剂、外伤、器官移植、休克、动脉搭桥术等原因引起的肾脏缺血再灌注损伤病人的肾组织)的血清肌酐来评估肾功能。血清肌酐检测如下，配置200μL工作液0.96％氢氧化钠：0.83％苦味酸＝1:1，37℃水浴3分钟，加入20μL标准品(442μmol/L)或样品，计时20秒读取510nm吸光度值A1，再计时60秒读取第二次吸光度值A2，计算ΔA＝A2-A1，按照[(ΔA_样品-ΔA_空白)/(ΔA_标准-ΔA_空白)]×标准品浓度的公式计算样品血清肌酐。检测表示：不同程度肾损伤患者血肌酐水平分别为96、148、183、266、292和381μmol/L。通常60～110μmol/L血肌酐被认为处于正常水平。

配制CRYAB蛋白标准品并按以下浓度加入96孔板：2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0ng/ml。另外将上述不同程度肾损伤患者的尿液经PBS 2倍稀释后，在96孔板上过夜包被，每孔加入100μL稀释后的尿液；以抗体制备免疫前血清为阴性对照。4℃包被过夜，PBST洗涤3次，每次5min；然后每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，于37℃封闭2h；用PBS 1:2000稀释实施例1中制备的小鼠抗人CRYAB多克隆抗体，每孔加入100μL，37℃孵育2h，PBST洗涤3次，每次5min；每孔加入100μL经PBS 10000倍稀释的羊抗鼠HRP标记二抗，37℃孵育2h，PBST洗涤3次，每次5min；加入100μLTMB显色底物液，37℃避光孵育15min，终止反应后于酶标仪上读OD450值。采用CRYAB蛋白标准品浓度与OD450值制作标准曲线如附图3所示。Pearson相关性分析CRYAB表达强弱与血清肌酐水平的关系如附图4所示：图中Pearson相关系数r＝0.9896，P值(双尾)＝0.0002。说明患者体内CRYAB表达越强，检测到患者体内血清肌酐水平越高，其肾损伤程度也越高；即CRYAB表达强弱与肾损伤程度高度相关。

综上，本发明中以αB-晶状体蛋白核心区(67-149位氨基酸)为抗原制备的小鼠抗人CRYAB多克隆抗体可应用于急性肾损伤的检测中，能有效的对肾损伤程度进行分级，且显著提高检测效率。

本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 河南大学

<120> 一种用于急性肾损伤检测的CRYAB抗体及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 83

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Glu Met Arg Leu Glu Lys Asp Arg Phe Ser Val Asn Leu Asp Val Lys

1 5 10 15

His Phe Ser Pro Glu Glu Leu Lys Val Lys Val Leu Gly Asp Val Ile

20 25 30

Glu Val His Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Phe Ile

35 40 45

Ser Arg Glu Phe His Arg Lys Tyr Arg Ile Pro Ala Asp Val Asp Pro

50 55 60

Leu Thr Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Asp Gly Val Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Gly Pro Arg

<210> 2

<211> 249

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

gagatgcgcc tggagaagga caggttctct gtcaacctgg atgtgaagca cttctcccca 60

gaggaactca aagttaaggt gttgggagat gtgattgagg tgcatggaaa acatgaagag 120

cgccaggatg aacatggttt catctccagg gagttccaca ggaaataccg gatcccagct 180

gatgtagacc ctctcaccat tacttcatcc ctgtcatctg atggggtcct cactgtgaat 240

ggaccaagg 249

<210> 3

<211> 528

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

atggacatcg ccatccacca cccctggatc cgccgcccct tctttccttt ccactccccc 60

agccgcctct ttgaccagtt cttcggagag cacctgttgg agtctgatct tttcccgacg 120

tctacttccc tgagtccctt ctaccttcgg ccaccctcct tcctgcgggc acccagctgg 180

tttgacactg gactctcaga gatgcgcctg gagaaggaca ggttctctgt caacctggat 240

gtgaagcact tctccccaga ggaactcaaa gttaaggtgt tgggagatgt gattgaggtg 300

catggaaaac atgaagagcg ccaggatgaa catggtttca tctccaggga gttccacagg 360

aaataccgga tcccagctga tgtagaccct ctcaccatta cttcatccct gtcatctgat 420

ggggtcctca ctgtgaatgg accaaggaaa caggtctctg gccctgagcg caccattccc 480

atcacccgtg aagagaagcc tgctgtcacc gcagccccca agaaatag 528

Claims

1.一种CRYAB抗体的抗原，其特征在于，所述CRYAB抗体的抗原为 aB-晶状体蛋白的第67-149位氨基酸序列，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。