CN110100182A - α-B晶状体蛋白在诊断新生儿脑损伤中的作用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于诊断新生儿脑损伤的方法，包括分析从新生儿获得的组织或体液样品中α‑B晶状体蛋白水平的步骤。该方法特别适用于诊断低出生体重的早产儿或新生儿。

Description

α-B晶状体蛋白在诊断新生儿脑损伤中的作用

背景技术

新生儿保健面临许多挑战。新生儿需要特殊的医疗护理和保护，特别是当由于早产而发生出生并发症时。早产新生儿易患几种高危因素，其中一些与影响大脑发育有关。

早产或早产出生是指胎龄小于37周的儿童的出生。早产儿有较高的风险患严重疾病，以及发育迟缓或听力和视力问题。

根据世界卫生组织的数据，早产儿的数量每年都在增加，目前约有十分之一的婴儿早产。例如，在德国，每年估计有63000名婴儿早产，其中有8000名婴儿在妊娠30周前出生。早产的原因仍然难以捉摸。研究已经确定了几个风险因素，但没有明确的原因。

早产并发症是全世界5岁以下儿童死亡的最常见原因。由于医疗保健，特别是新生儿重症监护的改善，近年来早产儿的存活率急剧增加，因此目前约90％的早产儿存活。不幸的是，没有长期困难和残疾的生存机会较低。

许多早产儿因早产而患有脑损伤。对发育中的大脑的这种损伤可能导致破坏性的神经系统后果。这些损伤的严重程度与胎龄和出生体重呈负相关，早产儿长期神经功能缺损的风险远高于正常妊娠期出生的婴儿。

大约50％的极低出生体重新生儿(1500g以下)患有缺氧缺血性损伤。脑室周围白质软化(PVL)和脑室内出血(IVH)是早产儿最常见的脑损伤类型。

PVL是导致脑瘫和认知缺陷的主要已知原因，并且还与视觉功能障碍和癫痫有关(Serdaroglu G,Tekgul H,Kitis O,Serdaroglu E,S.:Correlative value ofmagnetic resonance imaging for neurodevelopmental outcome in periventricularleukomalacia.Dev Med Child Neurol.2004Nov；46(11):733-9；B,M,-Samija R,M,J,Solak M.:Neurodevelopmental outcome inchildren with periventricular leukomalacia.Coll Antropol.2008Jan；32Suppl 1:143-7；Deng W,Pleasure J,Pleasure D.:Progress in periventricularleukomalacia.Arch Neurol.2008Oct；65(10):1291-5.doi:10.1001/archneur.65.10.1291.)。IVH可导致生发基质和脑室下区受伤。PVL可以单独发生或与IVH一起发生。目前没有治疗PVL或IVH的方法。

PVL和IVH的早期检测是一个尚未解决的问题，因为只有头部超声才能识别出严重的损伤，这是目前最常用的诊断方法。尽管扩散加权磁共振成像(DWI)在识别PVL方面更有效，但它很少用于早产儿接受MRI，除非他们的发育过程特别困难。

因此，尽管所有努力都集中在早产儿的存活上，PVL和IVH可能会被忽视，并且将会错过干预损伤级联反应的潜在时间窗口。因此，需要生物标志物能够快速区分处于损伤风险中的婴儿。

到目前为止，尽管迫切需要生物标志物来筛查婴儿的脑损伤并监测疾病的进展，但研究中只有少数生物标志物用于患有PVL和IHV的早产儿和足月儿。迄今为止鉴定的一些最有希望的IVH生物标志物是S100β和激活素。它们可能有助于脑损伤的早期检测，但不幸的是，这些生物标志物的水平也受到其他因素的影响，如胎龄和胎儿宫内生长受限，不幸的是，这导致不可靠的诊断结果。

此外，有关PVL生物标志物的报道很少见。通过对早产儿的尸检研究发现早期PVL的免疫标志物：人β-淀粉样蛋白前体蛋白(β-APP)可能是弥漫性轴索损伤的标志物(AraiY,Deguchi K,Mizuguchi M,Takashima S.:Expression of beta-amyloid precursorprotein in axons of periventricular leukomalacia brains.PediatrNeurol.1995Sep；13(2):161-3)，而且fractin可能是凋亡标志物。

发明内容

本发明涉及一种用于诊断新生儿(特别是早产儿)脑损伤的方法。该方法涉及分析新生儿样品中αB-晶状体蛋白(也称为α-B晶状体蛋白，CryAB)的水平，其可以作为新生儿脑损伤风险和严重程度的生物标志物。

在又一方面，本发明涉及αB-晶状体蛋白特异性抗体，其用于诊断和/或预后新生儿脑损伤的方法中。

附图说明

图1：比较在足月出生的婴儿(左)和早产婴儿(右)中，αB-晶状体蛋白水平(CryAB)未升高的婴儿数量(白色)和αB-晶状体蛋白水平升高的婴儿数量(黑色)。

图2：所有αB-晶状体蛋白水平(CryAB)升高的婴儿中具有超声诊断的脑损伤(阴影区域)的婴儿数量的示意图。

具体实施方式

发明人确定需要新的生物标志物用于预测和诊断新生儿的脑损伤，特别是用于诊断出血性脑损伤或缺血性脑损伤。令人惊讶地发现，αB-晶状体蛋白的水平可以作为预后和/或诊断脑损伤的生物标志物，特别是新生儿(特别是早产儿)的出血性脑损伤和缺血性脑损伤。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于诊断和/或预后新生儿脑损伤的方法，该方法包括以下步骤：

a)分析来自新生儿的样品中αB-晶状体蛋白的水平；并且可选地

b)将αB-晶状体蛋白的水平与参考值进行比较。

通常，αB-晶状体蛋白是眼睛晶状体中的结构蛋白。它也是小热休克蛋白家族的一员。

在患有中风的成年患者中，目前认为αB-晶状体蛋白与几种其他多肽一样，也可能在脑细胞保护中起作用，这在临床研究中尚未得到证实。

然而，新生儿αB-晶状体蛋白出现在眼睛晶状体之外以及其在组织和体液中的水平尚未得到详细研究。特别是，新生儿中αB-晶状体蛋白水平在多大程度上对事件反应，例如与出生相关的事件，或与脑功能发育相关的事件，或与对大脑的潜在损害相关的事件，是完全不为人知的。因此令人惊讶地发现，在新生儿中(甚至在非眼科组织中也)可以发现相关的α-B-晶状体蛋白水平，并且这些水平似乎对经常与早产相关的大脑的损伤有反应或与之相关。

根据本发明的诊断方法的主要益处之一是它为决定对新生儿进行的进一步诊断和/或治疗干预提供了基础。进一步的诊断可以包括，例如，扩散张量成像(DTI)，这种技术允许扫描白质的两个关键区域中的微观结构问题，其与儿童认知和运动发育的问题显著相关。在αB-晶状体蛋白水平升高的情况下可能有用的治疗干预和新生儿重症监护室(NICU)考虑因素包括但不限于，中线头部定位，延迟需要过度处理的手术(如腰椎穿刺)，避免碳酸氢钠输注和近红外光谱监测脑氧合。

如本文所用，表述“新生儿”和“新生婴儿”(或“刚出生的婴儿”)可互换使用。

人αB-晶状体蛋白具有以下蛋白质序列(Seq ID No.1)：

已发现本发明人鉴定的方法适用于预测新生儿的脑损伤。特别地，该方法适用于早产新生儿的脑损伤的诊断，其对于发生脑损伤具有特别高的风险。

在本发明的上下文中，早产新生儿是在完成37周妊娠之前出生的婴儿。因此，在一实施方案中，本发明涉及一种用于诊断新生儿脑损伤的方法，其中新生儿出生时的胎龄为37周或更短，特别是少于37周。在本发明的一具体实施方案中，新生儿出生时的胎龄为35周或更短。在另一实施方案中，新生儿出生时的胎龄为32周或更短。

另一风险群体是出生体重低或极低的新生儿。在本发明的上下文中，低出生体重是指出生体重小于3000kg，特别是小于2800g，更特别是小于2500g。极低出生体重指的是出生体重低于1500g。

因此，在一方面，本发明涉及一种诊断新生儿脑损伤的方法，其中新生儿的出生体重小于3000g。在一具体实施方案中，新生儿的出生体重小于2800g。在一更具体的实施方案中，新生儿的出生体重小于2500g，更特别是小于2000g。在另一实施方案中，新生儿的出生体重小于1500g。

该方法适用的另一个风险群体是在出生期间或之前发生并发症的新生儿。因此，在另一方面，本发明涉及一种用于诊断或预测由于产时并发症或产后并发症引起的脑损伤的方法。这些并发症包括伴有血管疾病的母体糖尿病(maternal diabete)，胎盘血循环减少，胎儿的先天性感染，胎盘出血过多，母体血压过低，脐带事故，产程延长和胎位异常。

另一风险群体是其母亲在怀孕期间(特别是在出生前不久和/或甚至在出生期间)患有疾病的新生儿。因此，在一方面，本发明涉及一种用于诊断新生儿脑损伤的方法，其中母亲在怀孕期间患有疾病。在本发明的一具体实施方案中，母亲在怀孕期间患有炎性疾病。

新生儿可能遭受不同类型的脑损伤。到目前为止，诊断和预后只能通过对新生儿头部进行超声波检查或者复杂且昂贵的MRI(DWI)分析来实施，该超声波检查只能检测某些特定和严重类型的脑损伤。

本发明人惊奇地发现αB-晶状体蛋白是适用于不同类型脑损伤的指示剂。换句话说，与例如超声波分析相反，该生物标志物不限于特定的脑损伤。因此，在一具体实施方案中，本发明涉及一种用于诊断新生儿脑损伤的方法，其中脑损伤是弥漫性脑损伤，炎性脑损伤，缺血性脑损伤或出血性脑损伤。

在一实施方案中，脑损伤是缺血性脑损伤或出血性脑损伤。在一具体实施方案中，该方法用于诊断和预后脑室周围白质软化，脑室内出血或脑瘫。

待分析的样品是从新生儿获得的任何合适的样品。优选地，样品是体液样品。更优选地，样品是血液样品，脊髓液样品，尿液样品或痰液样品。更优选地，样品是血液样品或源自血液样品，例如血浆或血清。例如，血液样品可以是脐带血或其血浆部分。或者，血液样品可以从任何其他血管通路获得。

为了提供快速且合理快速的分析，其允许在必要时进行医学和药学干预，优选在出生后的最初几小时内采集样品。优选地，在出生后的头两个小时内，更优选在出生后的第一个小时内，特别是在切割脐带后的第一个小时内取样。如上所述，如果发现αB-晶状体蛋白水平升高，特别是如下文所述的水平高于参考值，这可表明指示进一步的诊断程序和/或治疗性发明，并且可以毫不延迟地启动。

αB-晶状体蛋白的分析可以用任何合适的分析方法进行，该分析方法允许至少检测αB-晶状体蛋白。优选地，该方法允许定性和定量分析αB-晶状体蛋白。理想地，该方法允许快速分析αB-晶状体蛋白，优选定性和定量分析αB-晶状体蛋白。

由于健康新生儿样品中αB-晶状体蛋白的浓度相当低，因此优选分析方法足够敏感，以允许确定αB-晶状体蛋白水平低至0.1ng/ml，或者低至0.05ng/ml，或甚至低于0.05ng/ml。在优选的实施方案中，分析方法是基于抗体的方法或质谱法。

在一具体实施方案中，使用基于抗体的测定，优选ELISA测定进行该分析。或者，可以使用标准化蛋白质印迹或斑点免疫印迹测定进行该分析。

在本发明的另一实施方案中，使用质谱法进行该分析。最优选地，质谱法允许检测和定量αB-晶状体蛋白。在一实施方案中，质谱法是直接MS法。在优选的实施方案中，该方法与色谱方法结合。在另一优选的实施方案中，用LC/MS，优选HPLC/MS方法进行该分析。用于α-B-晶状体蛋白检测和定量的合适方法的实例提供于Rothbard JB,Zhao X,Sharpe O,Strohman MJ,Kurnellas M,Mellins ED,Robinson WH,Steinman L.,J Immunol.2011,Apr1；186(7)中。

关于质谱分析法，特别是LC/MS或HPLC/MS分析法，本发明还涉及纯化的αB-晶状体蛋白用作评估中的标准。优选地，所述纯化的蛋白质包含SEQ ID NO.1。更优选地，所述纯化的蛋白质由SEQ ID No.1组成。

发现大于0.1ng/mL(优选大于0.5ng/mL)的αB-晶状体蛋白的水平表明新生儿脑损伤的风险增加。特别地，令人惊讶地发现αB-晶状体蛋白的水平指示新生儿潜在脑损伤的风险和严重性。

通常，αB-晶状体蛋白的水平等于或低于αB-晶状体蛋白的ELISA测定的检测极限。本发明人发现新生儿样品中高达0.1ng/ml的αB-晶状体蛋白水平，优选高于0.5ng/mL的αB-晶状体蛋白适合作为参考值，并且在大多数情况下不指示脑损伤。高于0.1ng/ml，优选高于0.5ng/mL的水平表明存在脑损伤的风险，与增加的水平相关的风险增加。

另一方面，本发明涉及抗体或抗体片段用于诊断或预后方法以预测新生儿脑损伤，如上所述。

优选地，抗体适合于在基于抗体的测定(例如ELISA或斑点免疫印迹)中检测αB-晶状体蛋白。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在本发明的一实施方案中，抗体是多克隆抗体。在另一实施方案中，抗体是单克隆抗体。

抗体可以与可检测的化合物偶联。在本发明的一实施方案中，抗体与荧光染料偶联。在替代实施方案中，抗体与能够产生可检测信号的酶(例如辣根过氧化物酶)偶联。在另一替代实施方案中，可检测化合物是亲和标签，例如生物素。

实施例

在该初步研究中，从52名早产儿(出生时小于35周妊娠期)的血浆中分析αB-晶状体蛋白浓度，并与从40名足月婴儿中采集的样品进行比较。因此，我们开发了αB-晶状体蛋白的基线浓度作为健康对照。

早产儿的血浆样品在第1天在出生后第一个小时内从脐带血中采集，然后在第3天与常规抽血一起重复。在健康足月婴儿中，获得脐带血和在第3天在标准新生儿筛查时的样品。

所有婴儿都接受了详细的临床评估，包括早产儿头部超声检查和新生儿眼底检查。将血液样品储存在EDTA管中，置于冰上运输并在1小时内处理。将管在4℃下以3500g离心5分钟。血浆级分分离并等分到在处理前储存在-80℃的单独管中。如果血液样品的体积允许，则还筛选炎性细胞因子，即IL-6，IL-15-α和TNF-α，它们与白质损伤和脑瘫相关。

最初，根据制造商的方案，使用αB-晶状体蛋白特异性ELISA试剂盒(StressmarqInc)评估αB-晶状体蛋白的血浆水平。为了简化血样采集和处理，该方法从ELISA改为使用新生儿筛查卡上的干血斑，通过液相色谱串联质谱进行分析，该技术可以从单个干血斑中快速测定和定量CryAB。

分析结果显示在下面的表1和2中。

对于成熟婴儿，27名婴儿中只有一名(3.7％)的αB-晶状体蛋白水平增加，而对于早产儿队列，52名新生儿中有13名(25％)检测到αB-晶状体蛋白水平升高(见图1)。超声检查或神经发育检查证实，这13名早产儿中有10名存在脑损伤(见图2)。有趣的是，对于具有最高的αB-晶状体蛋白水平的10号早产儿，超声检查未能显示脑损伤，但神经发育检查显示潜在的白质损伤。在3个月大时，该患者在腿部运动中表现出显著延迟的运动发育；时间线和症状都是与(弥漫性)脑室周围白质软化(PVL)相关的发育迟缓的典型标志物(参见Fetters,L；Chen,Yp；Jonsdottir,J；Tronick,Ez(April 2004)."Kicking coordinationcaptures differences between full-term and premature infants with whitematter disorder".Human movement science.22(6):729–48.))。因此，假设所有没有超声发现的αB-晶状体蛋白水平升高的病例随后将被证实为先前未鉴定的脑损伤。

另一方面，有4名患者通过超声确定，脑出血评分为1至2(缩写为ICH°I-II)，而αB-晶状体蛋白水平没有升高。对于这些婴儿，假设破坏性事件发生在出生前至少24小时，因此在取样时不再存在增加的αB-晶状体蛋白水平。

下表提供了确定的新生儿αB-晶状体蛋白水平的概述。缺失值表明不能确定α-B血红蛋白水平。

表1：在足月新生儿中测定的αB-晶状体蛋白水平

表2：在早产新生儿中测定的αB-晶状体蛋白水平

序列表

<110> 苏珊娜·潘格拉茨-菲雷尔

<120> α-B晶状体蛋白在诊断新生儿脑损伤中的作用

<130> PNG16P01PC

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 175

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Asp Ile Ala Ile His His Pro Trp Ile Arg Arg Pro Phe Phe Pro

1 5 10 15

Phe His Ser Pro Ser Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu His Leu

20 25 30

Leu Glu Ser Asp Leu Phe Pro Thr Ser Thr Ser Leu Ser Pro Phe Tyr

35 40 45

Leu Arg Pro Pro Ser Phe Leu Arg Ala Pro Ser Trp Phe Asp Thr Gly

50 55 60

Leu Ser Glu Met Arg Leu Glu Lys Asp Arg Phe Ser Val Asn Leu Asp

65 70 75 80

Val Lys His Phe Ser Pro Glu Glu Leu Lys Val Lys Val Leu Gly Asp

85 90 95

Val Ile Glu Val His Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly

100 105 110

Phe Ile Ser Arg Glu Phe His Arg Lys Tyr Arg Ile Pro Ala Asp Val

115 120 125

Asp Pro Leu Thr Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Asp Gly Val Leu Thr

130 135 140

Val Asn Gly Pro Arg Lys Gln Val Ser Gly Pro Glu Arg Thr Ile Pro

145 150 155 160

Ile Thr Arg Glu Glu Lys Pro Ala Val Thr Ala Ala Pro Lys Lys

165 170 175

Claims (8)

1.一种用于诊断新生儿脑损伤的方法，所述方法包括：

a)分析来自所述新生儿的样品中α-B晶状体蛋白的水平；并且可选地

b)将α-B晶状体蛋白的水平与参考值进行比较。

2.根据权利要求1所述的诊断方法，其中所述样品是血液、血浆、血清、痰液、脊髓液或尿液样品。

3.根据权利要求1或2所述的诊断方法，其中所述新生儿是在37周或更短的胎龄出生的早产儿。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的诊断方法，其中所述新生儿的出生体重小于2800g。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的诊断方法，其中所述样品在出生后1小时内从所述新生儿中采集。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所诊断的所述脑损伤是炎性脑损伤、缺血性脑损伤或出血性脑损伤。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所诊断的所述脑损伤是脑室周围白质软化或脑室内出血。

8.一种抗α-B晶状体蛋白的抗体，其用于预测新生儿脑损伤的诊断或预后方法。