CN114846018A - 制备尿苷5’-二磷酸(udp)、其盐或其水合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备本发明的尿苷5'‑二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，包括以下步骤：(步骤1)用酸将化学式2a表示的尿苷5'‑单磷酸(UMP)的盐去离子，从而制备化学式2a表示的UMP；(步骤2)将化学式2a表示的UMP与叔胺、碳二亚胺类缩合剂和咪唑反应，从而制备化学式2b表示的尿苷‑5'‑磷酰咪唑化物；和(步骤3)将化学式2b表示的尿苷‑5'‑磷酰咪唑化物与单磷酸化试剂和叔胺反应，从而制备化学式3a表示的UDP、其盐或其水合物。因此，本发明可以通过不使用离子交换树脂进行去离子来简化工艺，并且可以通过在没有单独的生产设备的情况下以相对简单的工艺进行大量生产而在商业上有效地使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备尿苷5'-二磷酸(以下称为UDP)的方法，该化合物是制备多聚磷酸二核苷化合物中使用的中间体化合物。
背景
通常，下式1表示的化合物P1,P4-二(尿苷5'-)四磷酸(以下称为“UP4U”)或其盐，用作角膜和结膜上皮疾病(伴随干眼症或干泪症)的治疗剂，并且由于诱导咳痰作用，是一种有望开发为祛痰剂或肺炎治疗剂的化合物。
[式1]
国际未审查专利公开第1999/05155号报道了一种制备UP4U的方法，其通过在极性非质子有机溶剂和疏水胺中溶解尿苷、尿苷5'-单磷酸(以下称为UMP)、UDP或尿苷5'-三磷酸(以下简称UTP)及其各自的盐和尿苷核苷酸化合物，用单磷酸化试剂或二磷酸化试剂作为磷酸化试剂使所得溶液进行磷酸化，并使用碳二亚胺、活性羰基或活性磷作为活化剂。
此外，韩国未审查专利申请第10-2018-0091672号(于2018年8月16日公开)报道了一种高收率制备高纯度UP4U的方法，该方法通过在水(一种环境友好溶剂)的存在下将碳二亚胺类缩合剂和金属离子与作为起始材料的由下式2a、3a和4a表示的核苷磷酸化合物反应来制备。
[式2a]
[式3a]
[式4a]
J.Org.Chem.1987,52,1794-1801报道了一种通过将尿苷与二磷酸化试剂反应来合成UDP的方法，该方法收率低，需要用离子交换树脂单独纯化，因此难以商业化生产。
此外，合成通讯(Synthetic Communications)36：3393-3399，2006报道了一种通过将UMP转化为尿苷-5'-磷酰咪唑化物(uridine-5'-phosphoroimidazolide)并与磷酸和三烷基胺盐反应来合成UDP的方法。但这种制备方法收率低，产生大量副产物，因此需要用阴离子交换树脂和快速蛋白质液相色谱(FPLC)进行额外纯化，难以商业化生产。
因此，出于上述原因，需要一种通过有效纯化能够商业合成UDP的制备方法以经济地合成UDP。
[相关技术参考]
(专利文献1)国际未审查专利公开第1999/05155号
(专利文献2)韩国未审查专利申请第10-2018-0091672号
(非专利文献1)合成通讯36,3393-3399,2006(于2006年11月23日公布)
(非专利文献2)J.Org.Chem.1987,52,1794-1801
发明详述
技术问题
本发明的目的在于提供一种制备尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，该方法经济且适合大规模生产，同时提高纯度和收率。
技术方案
为了经济地合成昂贵的UDP，本发明可以提供一种能够商业化合成UDP的制备方法，该方法以UMP作为起始原料合成尿苷-5'-磷酰咪唑化物，与单磷酸化试剂和叔胺反应合成粗UDP，然后在不用离子交换树脂纯化的条件下进行高效纯化。
根据本发明的式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的制备方法可以包括：
(步骤1)用酸将式2a表示的尿苷5'-单磷酸(UMP)的盐去离子，从而制备式2a表示的UMP；
(步骤2)将式2a表示的UMP与叔胺、碳二亚胺类缩合剂和咪唑反应，从而制备式2b表示的尿苷-5'-磷酰咪唑化物；和
(步骤3)将式2b表示的尿苷-5'-磷酰咪唑化物与单磷酸化试剂和叔胺反应，从而制备式3a表示的UDP、其盐或其水合物。
[式2a]
[式2b]
[式3a]
步骤1
上述步骤1中式2a表示的尿苷5'-单磷酸(UMP)的盐可以是UMP金属盐。所述UMP金属盐可以选自下组：锂、钠、钾、镁、钙、钡、铈、铁、镍、铜、锌和硼，并且可以优选为锂、钠或钾的碱金属盐和钙或镁的碱土金属盐。
在一个实施方式中，上述步骤1的去离子过程中使用的酸可以是硝酸、硫酸或盐酸。在这种情况下，酸的用量可以为以1摩尔当量的UMP计的0.8至1.2摩尔当量，优选0.9至1.1摩尔当量。
在一个实施方式中，上述步骤1的反应溶剂可以采用醇和水的混合溶剂，醇和水的混合比例可以在4:1至10:1的范围内，优选在6:1至8:1的范围内。反应中使用的醇的种类可以是甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇，它们可以单独使用，也可以组合使用其两种或更多种。用作上述步骤1中的反应溶剂的醇优选为甲醇或乙醇。
上述步骤1的反应温度可以在10℃至40℃的范围内，优选在20℃至30℃的范围内。此外，上述步骤1的反应时间可以在10至60分钟的范围内，优选在20至40分钟的范围内，但不限于此。
在一个实施方式中，当所述UMP金属盐为UMP钠盐时，上述步骤1的反应可以如以下反应式1所示。
[反应式1]
根据上述步骤1，UMP金属盐可以在醇和水的混合溶剂中用酸去离子，而不需要使用离子交换树脂，因此可以很容易地转化为UMP游离酸。
在上述步骤1中，可以不使用离子交换树脂制备式2a表示的尿苷5'-单磷酸(UMP)，从而减少反应步骤和反应时间，从而尽可能减少杂质的产生。
步骤2
上述步骤2可以为通过使用根据上述步骤1得到的UMP游离酸制备尿苷-5'-磷酰咪唑化物的步骤。
上述步骤2的碳二亚胺类缩合剂可以为R1-N＝N-R2表示的化合物(其中R1和R2相同或不同，各自独立地为具有1至6个碳原子的直链、支链或环链烷基，其中所述烷基可以任选地被烷基胺基取代)，并且可以作为缩合反应中的反应助剂而添加。
上述步骤2中的碳二亚胺类缩合剂可以为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳亚胺(EDCI)或其盐、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)等，它们可以单独使用，也可以组合使用其两种或更多种。在这种情况下，碳二亚胺类缩合剂的用量可以为以1摩尔当量的UMP计的1至3摩尔当量，优选1.5至2.5摩尔当量。
上述步骤2中的叔胺可以为三甲胺、三乙胺或三丁胺，它们可以单独使用，也可以组合使用其两种或更多种。优选地，上述步骤2中的叔胺可以为三丁胺。在这种情况下，叔胺的用量可以为以1摩尔当量的UMP计的1至2摩尔当量，优选1.4至1.6摩尔当量。
上述步骤2中的咪唑的用量可以为以1摩尔当量的UMP计的1至3摩尔当量，优选1.5至2.5摩尔当量。
上述步骤2中的反应溶剂可以为醇和水的混合溶剂。在这种情况下，醇和水的混合比例可以在4:1至10:1的范围内，优选6:1至8:1。反应中使用的醇的种类可以是甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇，它们可以单独使用，也可以组合使用其两种或更多种。用作上述步骤2中的反应溶剂的醇优选为甲醇或乙醇。
上述步骤2的反应温度可以在60℃至80℃的范围内，优选在65℃至75℃的范围内。此外，上述步骤2的反应时间可以在30至120分钟的范围内，优选在60至90分钟的范围内，但不限于此。
在一个实施方式中，步骤2作为制备上式2b表示的尿苷-5'-磷酰咪唑化物的步骤，可以由以下反应式2表示。
[反应式2]
步骤3
上述步骤3中使用的单磷酸化试剂可以是磷酸(如磷酸(H3PO4))的叔胺盐Bu3NH·H2PO4等。上述步骤3的单磷酸化试剂的用量可以为以1摩尔当量的尿苷5'-磷酰咪唑化物计的1至10摩尔当量，优选2至4摩尔当量。
上述步骤3中对叔胺的描述可以与上述步骤2中的描述基本相同，因此不再赘述。上述步骤3中使用的叔胺的种类可以与上述步骤2中使用的叔胺的种类相同或不同。在这种情况下，上述步骤3的叔胺的用量可以为以1摩尔当量的尿苷5'-磷酰咪唑化物计的1至10摩尔当量，优选2至4摩尔当量。
在一个实施方式中，上述步骤3中单磷酸化试剂与叔胺的摩尔当量比可以为1:1。
上述步骤3的反应溶剂可以为甲醇、乙醇、异丙醇等醇类，丙酮，乙腈，N,N'-二甲基甲酰胺，或类似的。它们可以单独使用，也可以组合使用其两种或更多种。在一个实施方式中，上述步骤3的反应溶剂可以为甲醇或丙酮。
上述步骤3的反应温度可以在20℃至50℃的范围内，优选在30℃至40℃的范围内。此外，上述步骤3的反应时间可以在30至180分钟的范围内，优选在60至120分钟的范围内。
在一个实施方式中，如以下反应式3所示，上述步骤3可以通过将尿苷-5'-磷酰咪唑化物与单磷酸化试剂和叔胺反应来进行。通过上述步骤3，可以得到上式3a表示的UDP的粗UDP。
[反应式3]
纯化过程：步骤4-1至4-3
在一个实施方式中，根据本发明的式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的制备方法可以进一步包括在进行上述步骤3后，纯化上述步骤3得到的粗UDP以获得式3a表示的UDP的步骤。
具体地，本发明的式3a表示的UDP、其盐或其水合物的制备方法在进行上述步骤3之后还可以包括：
(步骤4-1)通过吸附纯化和洗脱式3a表示的UDP制备式3a表示的UDP；
(步骤4-2)将式3a表示的UDP转化为其金属盐并固化；和
(步骤4-3)将UDP的金属盐转化为式3a表示的UDP、其盐或其水合物。
步骤4-1
在上述步骤4-1中，式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)可以由上述步骤3中得到的粗UDP制备。在这种情况下，式3a表示的UDP可以通过吸收纯化和洗脱来制备。在上述步骤3中合成粗UDP时，可能会使用过量的叔胺和磷酸化试剂来完成反应，在此过程中可能会残留许多紫外检测不到的磷酸副产物，因此可以在上述步骤4-1中去除。
在一个实施方式中，上述步骤4-1的吸附纯化和洗脱中可以使用吸附剂，吸附剂可以是活性炭。
在一个实施方式中，用于洗脱的洗脱液可以选自下组：稀盐酸、氯化钠水溶液、碳酸铵水溶液、稀氨水和氢氧化钠水溶液，优选稀氨水。洗脱液的浓度可以在0.5至2.5mol/L的范围内，优选1.0至2.0mol/L。
在一个实施方式中，上述步骤4-1可以通过将粗UDP溶解在水中，吸附到活性炭上，通过过滤去除杂质，洗脱吸附的活性炭来进行。例如，将粗UDP溶解在水中并加入少量稀盐酸直到在pH 2～3时完全溶解后，可用活性炭吸附粗UDP。此时，待稀释的水的体积(mL)可以为以UDP重量(g)计的40至60倍，优选45至55倍。此时，所使用的活性炭的量(重量)可以为以UDP重量计的3至7倍，优选4至6倍。
步骤4-2
上述步骤4-2中的UDP的金属盐(以下称为UDP金属盐)可以是二价阳离子金属盐。
在一个实施方式中，UDP金属盐可以为下式3b表示的UDP钙盐。
[式3b]
在一个实施方式中，上述步骤4-2可以通过将钙化剂加入到在上述步骤4-1中洗脱的式3a表示的UDP中而转化为式3b表示的UDP钙盐，并且通过结晶得到固体的过程进行。
在一个实施方式中，上述步骤4-2的UDP金属盐为UDP钙盐的反应可以由以下反应式4表示。
[反应式4]
在一个实施方式中，当上述步骤4-2中使用钙化剂时，钙化剂可以是氯化钙、醋酸钙、碳酸钙、硫酸钙或磷酸钙，优选氯化钙或碳酸钙。在这种情况下，钙化剂的用量可以为以1摩尔当量的UDP计的2至6摩尔当量，优选3至5摩尔当量。
上述步骤4-2的结晶可以使用醇溶剂进行，醇溶剂的例子可以包括甲醇、乙醇、异丙醇等，优选甲醇。在结晶过程中，甲醇的量(体积)可以为以UDP洗脱液体积计的0.2至0.4倍，优选0.25至0.35倍。
步骤4-3
在上述步骤4-3中，通过上述步骤4-2得到的固相UDP金属盐可以转化以制备式3a表示的UDP。
在一个实施方式中，上述步骤4-3可以包括将上述步骤4-2中得到的固化的UDP金属盐去离子转化为式3a表示的UDP的步骤。此时，上述步骤4-3还可以包括将氢氧化钠加入到通过去离子得到的式3a表示的UDP中，得到式3a表示的UDP的钠盐的步骤。
具体地，上述步骤4-3可以通过用酸将上述步骤4-2得到的固相的式3b表示的UDP钙盐转化为UDP游离酸，再加入氢氧化钠再次转化为UDP钠盐的过程来进行。上述步骤4-3可由以下反应式5表示。
[反应式5]
在上述步骤4-3的去离子中使用的酸可以是硫酸、盐酸、硝酸和磷酸等强酸，优选硫酸或盐酸。在这种情况下，酸的用量可以为以1摩尔当量的UDP钙盐计的0.8至1.2摩尔当量，优选0.9至1.1摩尔当量。
上述步骤4-3的反应温度可以在10℃至40℃的范围内，优选在20℃至30℃的范围内。此外，上述步骤4-3的反应时间可以在30至90分钟的范围内，优选在50至70分钟的范围内。
在上述步骤4-3中，可以使用氢氧化钠转化为UDP钠盐，其中反应可以在pH4至pH5，优选pH 4.4至pH 4.6的范围内进行。
上述步骤4-3中得到钠盐的反应可以使用结晶溶剂，其中用作结晶溶剂的甲醇的体积(mL)可以为以UDP钙盐重量(g)计的5-13倍，优选8-10倍。
有利效果
根据本发明，作为地夸磷索(diquafosol)前体的UDP可以通过简化的工序大量生产，从而可以商业化使用。在本发明中，可以通过用活性炭而不是离子交换树脂来纯化粗UDP，且不使用离子交换树脂进行去离子过程来简化该过程。此外，通过转化为难溶性的UDP金属盐并在纯化后固化该金属盐可以高收率获得高纯度UDP，因此可以在没有单独的生产设备的情况下通过相对简单的工艺来大规模生产UDP用于商业用途。
附图的简要说明
图1为实施例1的步骤2中合成的尿苷-5'-磷酰咪唑化物的核磁共振分析(1HNMR)结果图。
图2为实施例2的步骤4-3中合成的UDP钠盐的1H NMR结果图。
图3为实施例1的步骤2中合成的尿苷-5'-磷酰咪唑化物液相色谱(HPLC)分析结果图。
图4为实施例1的步骤3中合成的粗UDP的HPLC结果图。
图5为实施例2的步骤4-1中得到的UDP的HPLC结果图。
图6为实施例2的步骤4-2得到的UDP钙盐的HPLC结果图。
图7为实施例2的步骤4-3得到的UDP钠盐的HPLC结果图。
实施发明的方式
为了更好地理解本发明，将通过优选实施例详细描述本发明。然而，提供以下实施例仅用于说明本发明的目的，因此本发明不限于此。
此外，除非另有说明，下文提及的试剂和溶剂均购自Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇)和TCI。使用Bruker DPX 400测量1H NMR数据，使用Agilent Technologies 1200(安捷伦科技1200)系列测量HLPC数据。
本发明中使用的HPLC条件如下，在反应后或反应混合物中测定纯度。
检测器：紫外吸收分光光度计(波长：260nm)
色谱柱：YMC-Pack Pro C18(4.6mm X 250mm，5μm)
流动相：将40g磷酸二氢钾溶解在1L水中
流速：0.800至1.200mL/min
[表1]
| 时间 | 流速 |
| 0.00 | 0.800 |
| 10.00 | 0.800 |
| 10.50 | 1.200 |
| 30.00 | 1.200 |
样品：10mg/流动相10mL
注射量：10μL
实施例1：粗尿苷5'-二磷酸(UDP)的合成
(步骤1)尿苷5'-单磷酸(UMP)的合成
将20g(54.3mmol)UMP钠盐加入到250mL三颈圆底烧瓶中，并加入80mL乙醇(EtOH)、10mL纯净水和2.9mL(54.3mmol)硫酸。室温搅拌30分钟后过滤，用5mL乙醇和0.63mL纯净水混合洗涤，滤液原位用于下一步反应。
(步骤2)尿苷-5'-磷酰咪唑化物的合成
将19.4mL(81.5mmol)三丁胺、16.8mL(108.6mmol)N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和7.4g(108.6mmol)咪唑依次加入到含有17.6g(54.3mmol)UMP的步骤1的滤液中，温度升至70℃并在70℃下搅拌1小时。反应结束后，将反应液冷却至10℃或以下，并在10℃或以下搅拌30分钟后，滤出生成的固体。将400mL丙酮加入单独的1L三颈圆底烧瓶中，将先前过滤的滤液反向缓慢滴加其中。加入8.38g(59.7mmol)NaClO4·1H2O，在室温下搅拌30分钟使其结晶，然后将得到的固体过滤，用25mL丙酮洗涤，用氮气干燥。
纯度97.0％(HPLC)
1H NMR(D2O,400MHz):δ3.95(m,1H),4.04(m,1H),4.09(m,2H),4.19(m,1H),5.80(m,2H),7.03(m,1H),7.21(t,1H),7.58(d,1H),7.84(s,1H)
(步骤3)粗尿苷5'-二磷酸(UDP)的合成
将16g(42.8mmol)尿苷-5'-磷酰咪唑化物和160mL丙酮加入250mL三颈圆底烧瓶中。将80mL丙酮、5.87mL(85.5mmol)的85％磷酸和20.4mL(85.5mmol)三丁胺加入单独的250mL三颈圆底烧瓶中，搅拌10分钟，然后反向滴加其中。添加6.29g(42.8mmol)氯化钙二水合物，将温度升至40℃并在40℃搅拌1至2小时。反应结束后，加入12.57g(85.5mmol)NaClO4·1H2O，在室温下搅拌1小时，之后将得到的固体过滤，用丙酮40mL洗涤，干燥。将100mL甲醇和50mL纯化水加入干燥的材料中，并将浆料在室温下搅拌1小时。将得到的固体过滤，用40mL丙酮洗涤，用氮气干燥。
产量21.92g，UDP含量62.6％，UDP纯度88.8％(HPLC)
实施例2：
(步骤4-1)尿苷5'-二磷酸(UDP)的纯化
对于上述实施例1步骤3中得到的粗尿苷5'-二磷酸(UDP)，在2L锥形瓶中加入16g粗UDP(UDP 10g，49.5mmol)和1L纯化水，边搅拌边缓慢加入6N盐酸直至pH达到2.5。澄清溶解后，加入活性炭100g，在室温下搅拌30分钟进行吸附。过滤后，杂质随滤液除去，用1L纯化水洗涤以除去杂质，用1.4N氨水洗脱纯化UDP。
洗脱液0.6L，纯度95.3％(HPLC)
(步骤4-2)尿苷5'-二磷酸(UDP)钙盐的合成
将29.1g(198mmol)氯化钙二水合物加入0.6L在步骤4-1中洗脱的UDP(49.5mmol)溶液中，并向其中加入240mL甲醇。在室温下搅拌1小时后，所得固体过滤得到UDP钙盐，并用氮气干燥。
产率96％，含量80％，纯度94.9％(HPLC)
(步骤4-3)尿苷5'-二磷酸(UDP)钠盐的合成
将12.3g(27.9mmol)UDP钙盐和30mL纯化水加入250mL三颈圆底烧瓶中并在室温下搅拌。缓慢滴加稀硫酸直至pH达到2.5，室温下搅拌1小时。所得固体通过过滤除去，将5N氢氧化钠水溶液缓慢滴加到滤液中直至pH达到4.5。将所得溶液反向滴加到100mL甲醇中并在室温下搅拌1小时，然后将所得固体过滤以获得UDP钠盐，并用氮气干燥。
产率86.6％，含量99.1％，纯度99.0％(HPLC)
1H NMR(D2O,400MHz):δ4.14(m,2H),4.19(m,1H),4.30(m,2H),5.89(m,2H),7.91(d,1H)
上述步骤1至4-3的反应结果如下表2所示。
[表2]
| 物质 | 产率 | 纯度 | 含量 | |
| 步骤1 | 尿苷5'-单磷酸 | 等量 | - | - |
| 步骤2 | 尿苷-5'-磷酰咪唑化物 | 91％ | 97.0％ | - |
| 步骤3 | 粗尿苷5'-二磷酸 | 65％<sup>1</sup> | 88.8％ | 62.6％ |
| 步骤4-1 | 尿苷5'-二磷酸 | 82％<sup>1</sup> | 95.3％ | - |
| 步骤4-2 | 尿苷5'-二磷酸钙盐 | 96％<sup>1</sup> | 94.9％ | 80.0％ |
| 步骤4-3 | 尿苷5'-二磷酸钠盐 | 87％<sup>1</sup> | 99.0％ | 99.1％ |
1实际产量×UDP含量/100
对比实验实施例1：粗尿苷5'-二磷酸(UDP)的合成
(步骤A)尿苷-5'-磷酰咪唑化物的合成：现有制备方法试验
将N,N'-二甲基甲酰胺(20mL/g)和TEA(6.6摩尔当量)加入UMP游离酸(1摩尔当量)中并搅拌10分钟。然后，依次加入咪唑(4摩尔当量)、2,2'-二硫代联吡啶(1.6摩尔当量)和三苯基膦(1.6摩尔当量)。在25℃反应3小时后，加入丙酮(140mL/g)和NaClO4(4摩尔当量)，冷却至4℃，搅拌30分钟，过滤并干燥。
产率84.2％，纯度94.1％(HPLC)
(步骤B)粗UDP的合成：现有制备方法试验
将N,N'-二甲基甲酰胺(34mL/g)、磷酸(4摩尔当量)和三丁胺(4摩尔当量)加入到上述步骤A中合成的尿苷-5'-磷酰咪唑化物(1摩尔当量)中并搅拌10分钟。然后，加入ZnCl2(0.7摩尔当量)并在25℃下搅拌15小时。通过HPLC分析反应溶液以确定反应溶液中UDP、UMP、UP3U、UP2U和UMP-IMD的纯度。其结果如下表3所示。
[表3]
本发明实施例1步骤1～3的合成工艺结果与对比实验实施例1的现有文献工艺相比的结果见表4。结果证实本发明的合成工艺大大提高了产品的产率和纯度。
[表4]
1实际产量×UDP含量/100
实验实施例1：尿苷-5'-磷酰咪唑化物的合成：缩合剂的影响
将88％乙醇(4.5mL/g)、三丁胺(TBA，1.5摩尔当量)、缩合剂(2摩尔当量)和咪唑(2摩尔当量)依次加入到UMP游离酸(1摩尔当量)中，然后升温至70℃，在70℃下反应1小时。
通过HPLC分析反应溶液以确定反应溶液中UMP、尿苷-5'-磷酰咪唑化物和UP2U的纯度。其结果如下表5所示。
[表5]
根据上述[表5]的结果，在尿苷-5'-磷酰咪唑化物的合成中，根据缩合剂的种类不同，反应性和二聚体的生成也不同。结果确定了当使用DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)时，尿苷-5'-磷酰咪唑化物的转化率最好且二聚体的形成最少。
实验实施例2：尿苷-5'-磷酰咪唑化物的合成：叔胺的影响
将88％乙醇(4.5mL/g)、叔胺(1.5摩尔当量)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC，2摩尔当量)和咪唑(2摩尔当量)依次加入到UMP游离酸(1摩尔当量)中，然后升温至70℃，在70℃反应1小时。三乙胺(TEA)、三丁胺(TBA)和二异丙基乙胺(DIPEA)分别用作叔胺。
通过HPLC分析反应溶液以确定反应溶液中UMP、尿苷-5'-磷酰咪唑化物和UP2U的纯度。其结果如下表6所示。
[表6]
由上述[表6]的结果确定在尿苷-5'-磷酰咪唑化物的合成中，使用TEA、TBA、DIPEA作为叔胺时目标UMP-IMD的纯度为95％或以上。
实验实施例3：粗UDP的合成：单磷酸化试剂和叔胺的摩尔当量的影响
向三颈圆底烧瓶中加入与丙酮(15mL/g)对应的摩尔当量的85％磷酸和三丁胺，搅拌10分钟。然后，依次加入尿苷-5'-磷酰咪唑化物(1摩尔当量)和氯化钙二水合物(1摩尔当量)，升温至30℃反应1小时。
通过HPLC分析反应溶液以确定反应溶液中UDP、UMP和UP3U的纯度。其结果如下表7中所示。
[表7]
从上述[表7]的结果确认了在UDP合成中使用1～10摩尔当量的单磷酸化试剂和TBA时的反应性和二聚体相关物质(UP3U)的生成。结果确认了当使用2摩尔当量或更多的单磷酸化试剂和TBA时，可以合成85％或更多的UDP，并且随着摩尔当量的增加，UDP的纯度增加，未反应的和副反应减少。然而，自磷酸的摩尔当量大于TBA的摩尔当量之后，确认了在酸性环境中进行反应时产品纯度降低。
Claims (13)
1.一种制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(步骤1)用酸将式2a表示的尿苷5'-单磷酸(UMP)的盐去离子，从而制备式2a表示的UMP；
(步骤2)将式2a表示的UMP与叔胺、碳二亚胺类缩合剂和咪唑反应，从而制备式2b表示的尿苷-5'-磷酰咪唑化物；和
(步骤3)将式2b表示的尿苷-5'-磷酰咪唑化物与单磷酸化试剂和叔胺反应，从而制备式3a表示的UDP、其盐或其水合物：
[式2a]
[式2b]
[式3a]
2.根据权利要求1所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤1的酸为硫酸或盐酸。
3.根据权利要求1所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤1使用水和醇的混合溶剂作为反应溶剂。
4.根据权利要求1所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤2的碳亚胺类缩合剂为选自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳亚胺(EDCI)或其盐、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)的至少任何一种。
5.根据权利要求1所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤2的叔胺为选自三乙胺、三丁胺和二异丙基乙胺中的至少任何一种。
6.根据权利要求1所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤3使用选自丙酮、醇、乙腈和N,N'-二甲基甲酰胺中的至少任何一种作为反应溶剂。
7.根据权利要求1所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤3的单磷酸化试剂和叔胺的用量分别为以1摩尔当量的式2b表示的尿苷-5'-磷酰咪唑化物计的1.0-10.0摩尔当量。
8.根据权利要求1所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤3的单磷酸化试剂与叔胺的摩尔当量比为1:1。
9.根据权利要求1所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，所述方法还包括：在上述步骤3之后，
(步骤4-1)通过吸附纯化和洗脱式3a表示的UDP制备式3a表示的UDP；
(步骤4-2)将式3a表示的UDP转化为其金属盐并固化；和
(步骤4-3)将尿苷5'-二磷酸的金属盐转化为式3a表示的UDP、其盐或其水合物。
10.根据权利要求9所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤4-1的吸附纯化中使用的吸附剂为活性炭。
11.根据权利要求9所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤4-1中用于洗脱的洗脱液为选自稀盐酸、稀氨水和氯化钠水溶液的至少任何一种。
12.根据权利要求9所述的用于制备式3a表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)、其盐或其水合物的方法，其特征在于，上述步骤4-2中制备的UDP金属盐为二价阳离子金属盐。
13.一种式3b表示的尿苷5'-二磷酸(UDP)钙盐：
[式3b]
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