CN114807312A

CN114807312A - 一种基于核酸外切酶ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌o157:h7的方法

Info

Publication number: CN114807312A
Application number: CN202210253367.9A
Authority: CN
Inventors: 姜毓君; 杨鑫焱; 满朝新; 王郑辉
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-03-15

Abstract

一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法，属于食品安全技术领域。为了解决利用传统微生物学等检测致病菌方法中存在操作复杂，时间长和仪器设备昂贵等问题，实现大肠杆菌O157:H7现场可视化检测，本发明先用磁珠富集菌，再进行核酸外切酶Ⅲ循环扩增，扩增出的单链DNA含有G‑triplex序列，与氯化血红素结合后，可催化TMB和H₂O₂变成蓝色。本发明可以快速高效的捕获大肠杆菌O157:H7，不涉及核酸提取复杂繁琐的过程，具有操作简单，检测时间较短，成本低廉等优点。为实现快速检测大肠杆菌O157:H7提供了参考。

Description

一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌 O157:H7的方法

技术领域

本发明涉及一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法，属于食品安全技术领域。

背景技术

大肠杆菌O157：H7是最常见的食源性致病菌之一，传播途径主要分为食源性传播、水源性传播及接触性传播。其中食源性传播是大肠杆菌O157:H7实现感染的首要传播途径，食物若未得到适当的加工与处理，易被大肠杆菌O157:H7污染，导致宿主致病，而且宿主的排菌仍具有传染源性。因此，食源性的传播导致多次大肠杆菌O157:H7的大爆发。在北美，受污染的牛肉产品估计导致了加拿大37％的食源性疾病。尤其是2012年9月4日，加拿大艾伯塔省一家牛肉加工厂的产品，造成了18例大肠杆菌O157:H7的感染病例，这一食品安全问题使4000吨牛肉产品全部被召回，这是加拿大历史上最大的牛肉召回事件。

大肠杆菌O157:H7的主要毒力因子是由stx基因(最常见的是stx1a、stx2a和stx2c)编码的志贺毒素。人体在感染后，会出现腹泻相关的溶血性尿毒综合征，通常会带来溶血性贫血、血小板减少和急性肾损伤等症状。大肠杆菌O157:H7感染的肠套叠案例通常是与儿童相关，发病率为2％-3％，成人感染是较为罕见的，回结肠肠套叠的发生高峰往往是在出生的头几年，这可能与婴儿的成长有关。2019年，报道了肠套叠成年人患者的临床表现为持续的腹痛。因此，无论是儿童还是成年人，在大肠杆菌O157:H7感染后，都会引起多种疾病，造成极大的危害。

目前，对大肠杆菌的检测方法主要有以培养为基础的传统微生物学法、基于抗原抗体的免疫学检测方法和分子生物学检测法，如核酸探针技术、聚合酶链式反应和等温扩增技术等。传统的微生物学方法需要极长的检测时间和极繁琐的检测步骤，并不适合于当代快速生活和生产的节奏，所以该方法不能满足食源性致病菌快速检测的需求，因此迫切需要一种操作简单、快速的检测技术。

发明内容

为了解决利用传统微生物学等检测致病菌方法中存在操作复杂，时间长和仪器设备昂贵等问题，实现大肠杆菌现场可视化检测，本发明提供了一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括如下步骤：

(1)将5’端标记生物素的大肠杆菌适配体Apt和与其互补短链cDNA混合，形成复合物Apt-cDNA；所述大肠杆菌适配体Apt的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述互补短链cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)获得的复合物Apt-cDNA与磁珠结合制备适配体功能化磁珠，与大肠杆菌O157:H7孵育后磁分离去上清；

(3)向步骤(2)获得的上清液中加入HP、核酸外切酶Ⅲ(Exo III)和氯化钾溶液进行孵育，将核酸外切酶Exo III灭活后，加入氯化血红素进行孵育，再加入TMB和H₂O₂反应；所述HP的核苷酸如SEQ ID NO.3所示；

(4)溶液结果呈蓝色，用酶标仪检测紫外吸收光谱，即完成检测。

进一步地限定，所述步骤(1)是将Apt和cDNA相互混合，于90℃孵育5min，在3h内降至室温，形成复合物Apt-cDNA。

进一步地限定，所述大肠杆菌适配体Apt和其互补短链cDNA的浓度均为3.2μM，形成复合物Apt-cDNA的浓度为1.6μM。

进一步地限定，所述步骤(2)是将10μL浓度为10mg/mL的M-270链霉亲和素磁珠置于硅化管中，用50μL 1×BW缓冲液洗涤三次，加入20μL 2×BW缓冲液和20μL 1.6μM的Apt-cDNA，置于200rpm摇床中37℃孵育1h；PBS缓冲液洗涤三次后，用其重悬至20μL，之后与大肠杆菌O157:H7孵育，磁分离后取上清液。

进一步地限定，所述步骤(3)是向步骤(2)获得的上清液中加入2μL 100μM HP，40UExo III和8μL 500mM KCl溶液，在32℃条件下孵育1h；在75℃20min条件下灭活Exo III，并在1h内缓慢降至室温；加入2μL 100μM氯化血红素室温孵育30min后，再加入40μL 10mM TMB和5μmoL H₂O₂反应20min。

进一步地限定，步骤(4)所述的紫外吸收光谱波长为550nm-750nm，间隔10nm，最高峰在650nm处。

进一步地限定，用信噪比A/A₀来表示方法的性能，其中A和A₀分别为目标菌组和空白对照组在650nm处的吸光度。

本发明的有益效果：

(1)本发明将大肠杆菌O157:H7的特异性适配体和链霉亲和素磁珠偶联，形成特异性的适配体功能化磁珠，可以快速、高效的捕获并富集大肠杆菌，缩短了增菌时间，有利于后续检测。

(2)本发明是基于Exo III辅助扩增，温度在27-42℃之间，可满足现场检测的温度需求，结果可视化，不需要昂贵的检测仪器，另外，结果也可以用仪器检测，灵敏度比可视化结果高。

(3)本发明针对纯培养物中大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度达到1.3×10³CFU/mL，可视化灵敏度达1.3×10⁴CFU/mL；在人工污染乳样中，2.3×10¹、2.3×10²和2.3×10³CFU/mL的污染浓度分别预富集5h、3h和2h后检出。

附图说明

图1为本发明方法的实验原理图；

图2为本实验方法的可行性分析结果图；其中，图2中的A为琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker；泳道1为Apt；泳道2为cDNA；泳道3为Apt-cDNA；泳道4为cDNA+HP+Exo III；泳道5为HP+Exo III；泳道6为cDNA+HP；图2中的B为不同组分的紫外吸收光谱图，a为大肠杆菌O157:H7+HP+Exo III+氯化血红素；b为HP+Exo III+氯化血红素；c为大肠杆菌O157:H7+HP+氯化血红素；d为大肠杆菌O157:H7+Exo III+氯化血红素；e为氯化血红素；

图3为HP和cDNA序列的筛选结果图；

图4为适配体功能化磁珠制备方法的优化结果图；其中，图4中的A为Apt-cDNA的浓度优化结果图；图4中的B为Apt-cDNA与磁珠偶联时间的优化结果图；

图5为反应体系条件的优化结果图；其中，图5中的A为HP浓度的优化结果图；图5中的B为Exo III浓度优化结果图；图5中的C为酶反应温度的优化结果图；图5中的D为反应时间优化结果图；

图6为反应体系条件的优化结果图；其中，图6中的A为K⁺浓度的优化结果图；图6中的B为氯化血红素浓度的优化结果图；图6中的C为加入hemin后反应时间的优化结果图；图6中的D为H₂O₂用量的优化结果图；图6中的E为加入H₂O₂后的反应时间优化结果图；

图7为利用本发明所述方法对纯培养物中大肠杆菌O157:H7进行检测的灵敏度评价结果图；其中，图7中的A为不同大肠杆菌O157:H7浓度下紫外吸收光谱的测量；图7中的B为A/A₀与不同浓度大肠杆菌O157:H7的对数之间的关系，插图为1.3×10³～1.3×10⁷CFU/mL之间A/A₀与不同浓度大肠杆菌O157:H7的对数的线性关系；

图8为利用本发明所述方法对人工污染奶样中不同污染浓度的大肠杆菌O157:H7进行预富集后检测的结果图；

图9为本发明所述方法的特异性评价结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做出进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

本发明涉及的菌株及其信息见表1。

表1菌株信息

菌株的培养方法：

将冻存管内的大肠杆菌O157:H7按照2％的接种量接种到20mL LB液体培养基内，培养10～12h。在LB琼脂培养基平板上三区划线，继而培养12h，挑取单菌落，培养10-12h，菌落数可达10⁸～10⁹CFU/mL。

菌液浓度的计算方法：

本实验将以平版计数法计算大肠杆菌O157:H7的浓度。首先将菌液按100μL加入900μLPBS中算作稀释一倍进行梯度稀释，选择适宜的梯度涂板，每个梯度做三个平行，菌落数在30-300之间平板计数可用。将相同梯度的菌落数的平均值乘稀释倍数再乘以10即为原菌液浓度。

本发明涉及的核苷酸序列见表2.

表2本发明涉及的核苷酸序列

注：下划线序列是与cDNA互补序列，斜体序列是G-三链体序列。

实施例1：利用基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法检测纯培养物

(一)基于核酸外切酶辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法

(1)复合物Apt-cDNA的制备

取相同体积的3.2μM大肠杆菌的适配体(Apt)和其互补短链(cDNA)相互混合，于90℃孵育5min，在3h内降至室温，形成终浓度为1.6μM的复合物(Apt-cDNA)。

大肠杆菌适配体Apt的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其互补短链cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，大肠杆菌适配体Apt的5’端标记生物素。

(2)适配体功能化磁珠的制备

取10μLM-270链霉亲和素磁珠(SMBs)(10mg/mL)于硅化管中，用50μL 1×BW缓冲液洗涤三次，加入20μL 2×BW缓冲液和20μL 1.6μM的Apt-cDNA，置于200rpm摇床中37℃孵育1h；PBS缓冲液洗涤三次后，用其重悬至20μL，4℃保存备用。

(3)大肠杆菌O157:H7的检测

首先取1mL培养至10⁸CFU/mL-10⁹CFU/mL的菌液，用PBS缓冲液洗涤三次，离心参数为8000×g，5min，用1mLPBS缓冲液重悬，稀释到10⁶CFU/mL-10⁷CFU/mL。取200μL菌液于2mL离心管中，加入上述合成的适配体功能化磁珠，37℃200rpm摇床孵育1h。磁分离后取上清液转移至另一新管内，加入2μLHP(100μM)，40U Exo III孵育1h。孵育结束后加入8μL KCl溶液(500mM)，在75℃20min条件下灭活Exo III，并在1h内缓慢降至室温，以使切割剩余的序列形成稳定的G3结构。加入2μL氯化血红素(100μM)室温孵育30min后，再加入40μL TMB(10mM)和15μL H₂O₂(500mM)反应20min，观察颜色呈深蓝色并使用酶标仪测定在650nm处的吸光值。

所述检测方法的实验原理图见图1。

所述检测方法的可行性分析结果见图2，图2中的A为不同组分琼脂糖凝胶电泳结果图，泳道1为Apt条带，泳道2为cDNA条带。我们可以观察泳道3在40bp处有一个深的条带，而在20bp处有一个较浅的带。体系中在没有cDNA存在，而只有HP和Exo III时，泳道5仅有一条约在20bp较深的条带。与此相对应的，泳道6仅有cDNA和HP，无Exo III，我们可以观察到在约40bp的位置有一条较浅的条带和在20bp位置一条较深的条带，表明cDNA已成功与HP结合。泳道4表示存在cDNA时，整个检测体系的变化，与泳道5和6相比，cDNA-HP复合物被ExoIII消化，约20bp的条带较浅。此外，在20-40bp处有两条很浅的条带，可能是循环过程中未消化的cDNA与HP结合的产物，以及消化后HP尾部残留的含有G-triplex的单链DNA。这说明Exo III酶切体系成功构建。图2中的B中，a组和b组的区别在于有无大肠杆菌O157:H7，其在650nm处的吸光度差值为0.2768，且a组颜色明显比b组深。c组仅有大肠杆菌O157:H7和HP，吸光值略小于b组，d组是由大肠杆菌O157:H7和Exo III组成，e组仅有hemin，二者与c组的吸光度无明显区别，颜色均为极浅的蓝色。这表明我们的策略成功检测到大肠杆菌O157:H7。

(二)检测方法的优化：

①HP和cDNA序列的优化

所用序列如表2所示，当所用互补短链cDNA为表中cDNA、cDNA2和cDNA3时，对应的大肠杆菌适配体Apt的5’端标记生物素，当所用互补短链cDNA为表中cDNA4、cDNA5、cDNA6和cDNA7时，对应的大肠杆菌适配体Apt的3’端标记生物素。优化结果图见图3，由该图可知HP4和HP5实验组与对照组都有较高的吸光度，而HP2、HP3、HP6和HP7实验组与对照组吸光度均较低。相反，HP实验组与对照组吸光值之间的差值最大，且A/A₀值最高，因此，HP和cDNA作为最优序列。

②适配体功能化磁珠制备的优化

取10μLM-270链霉亲和素磁珠(SMBs)(10mg/mL)于硅化管中，用1×BW洗涤三次后，加入20μL不同浓度的Apt-cDNA(1.2，1.4，1.6，1.8，2.0μM)，分别在37℃150rpm的摇床内孵育不同的时间(0.5，1，1.5，2h)，用PBS缓冲液洗涤三次，加入20μL PBS缓冲液制备成SMBs-Apt-cDNA。按照所述方法对空白样品和大肠杆菌污染样品进行检测，并通过多功能酶标仪记录各组吸光度变化。

如图4中的A所示，Apt-cDNA浓度优化范围从1.2-2.0μM，1.2μM和1.4μM的A/A₀值较低。当Apt-cDNA的浓度到达1.6μM时，A/A₀的值最高，随着浓度的增加，1.8μM和2.0μM浓度时的A/A₀比最高值略低。因此我们选取1.6μM作为Apt-cDNA的最终浓度。如图4中的B所示，当SMBs与Apt-cDNA反应0.5h时，Apt-cDNA结合较少，使A/A₀值略低于该组的最高值；当二者反应时间超过1h(包括1h)时，A/A₀值几乎保持不变，表明Apt-cDNA和SMBs的结合在1h已达饱和状态。因此本实验最终选取1h作为SMBs与Apt-cDNA反应时间。

③HP浓度的优化

分别将1μL、2μL、3μL、4μL的HP(100μM)在90℃水浴5min，缓慢降至室温，之后进行后续反应。

优化结果见图5中的A，该图显示终浓度为1μM为最佳HP浓度。

④Exo III酶切反应参数的优化

为提高检测的灵敏度，本实验对酶切反应参数进行了优化，包括酶浓度(30，40，50，60U)，反应时间(0.5，1，1.5，2h)和反应温度(27，32，37，42，47，52℃)，按照所述方法对空白样和靶标进行检测，并记录颜色和吸光值变化。

优化结果见图5中的B、C和D，由图可知40U的Exo III、32℃的反应温度和1h的反应时间为最佳条件。

⑤K⁺浓度的优化

分别向检测体系中加入0μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL的KCl溶液(500mM)，按照所述方法对空白样和靶标进行检测，并记录颜色和吸光值变化。

优化结果见图6中的A，由该图可知K+终浓度为20mM最佳。

⑥氯化血红素浓度和时间的优化

分别向检测体系中加入1μL、2μL、3μL、4μL、5μL的hemin(100μM)，按照所述方法对空白样和靶标进行检测，并记录颜色和吸光值变化。

在检测体系中加入2μL hemin(100μM)后，分别在室温下孵育0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min，加入TMB和H₂O₂，对空白样品和靶标进行检测，并记录颜色和吸光值变化。

优化结果见图6中的B和C，该结果显示氯化血红素的终浓度为1.5μM，加入hemin后的反应时间为10min最佳。

⑦过氧化氢的添加量和反应时间的优化

向检测体系中分别加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL和35μL的H₂O₂(0.5M)，与40μLTMB反应20min后对空白样品和靶标进行检测，并记录吸光值变化。用最佳H₂O₂的添加量与TMB反应，每30s测一次吸光值，总时长约为25min，以得到吸光值达最大时的反应时间。

由图6中的D和E可知，H₂O₂的物质的量为5μmol，加入H₂O₂后的反应时间为20min，为最佳反应条件。

实施例2：利用基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法检测人工污染奶样

将市场上买到的超高温瞬时灭菌乳(UHT乳)按照平板计数的方法确定样品中不含任何菌株，取1mL培养至10⁸-10⁹的菌液，8000×g离心5min，并用PBS缓冲液洗涤三次，离心去上清得到菌泥，向菌泥中加入1mL无菌的UHT乳混合均匀，再逐渐用UHT乳梯度稀释至2.3×10¹-2.3×10³，37℃分别预富集1-5h。将1mL加标奶样用PBS缓冲液洗至溶液呈透明无明显浑浊，按照实施例1所述方法进行检测，记录颜色和吸光值变化。

(1)纯培养物的灵敏度测定

经平板计数，原始菌液浓度为1.3×10⁹CFU/mL。结果如图7所示，由最终反应溶液的颜色也可以看出随着菌液浓度的增加颜色逐渐加深，在650nm处的吸光值也逐渐提高，1.3×10¹CFU/mL和1.3×10²CFU/mL的紫外吸收曲线比空白对照组的紫外吸收曲线略低，几乎重合；而1.3×10³CFU/mL的紫外吸收曲线比空白对照组的略高，故该检测体系的检出限为1.3×10³CFU/mL。同时，由颜色图可以看出肉眼的检出限为1.3×10⁴CFU/mL。另外，大肠杆菌浓度在1.3×10³至1.3×10⁷CFU/mL之间可建立良好线性关系：y＝0.35001x-0.04375(R²＝0.98086)。

(2)人工污染牛奶样品中的检测

由于本发明方法在纯培养中的检出限为1.3×10³CFU/mL，因此选取10¹-10³CFU/mL较低污染浓度的奶样先预富集后再进行检测，结果如图8所示。10³CFU/mL的污染浓度在预富集2h后吸光度明显升高，颜色略有加深。10²CFU/mL的污染浓度则在预富集3h后吸光度有明显的提高，预富集4h后颜色有明显变化。10¹CFU/mL的污染浓度在预富集5h后吸光度有所提高，颜色略有加深，但不明显。由此可知，10¹、10²和10³CFU/mL的菌液分别预富集5h、3h和2h能够通过本试验方法检出。

(3)特异性评价

为了评价本实验方法的特异性，选取不同种属的七株常见致病微生物(如表1)进行干扰实验。均将菌株培养10-12h，并以大肠杆菌O157:H7作为阳性对照和空白样品作为阴性对照，按照所述方法进行检测，记录颜色和吸光值变化。

结果如图9所示，目标菌的检测结果呈较深的蓝色，而空白对照组和非目标菌组呈浅蓝色，颜色对比明显。同时测定各组的吸光值，发现大肠杆菌组的吸光值明显高于其他组，这表明所开发的信号放大比色型适体传感器具有良好的特异性和选择性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccggacgctt atgccttgcc atctacagag caggtgtgac gg 42

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tgccatctgg gaagggaggg ttttccctcc cttcccatac agagca 46

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tgcctttggg aagggagggt tttccctccc ttcccagcca tctaca 46

Claims

1.一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)向步骤(2)获得的上清液中加入HP、核酸外切酶III和氯化钾溶液进行孵育，将核酸外切酶III灭活后，加入氯化血红素进行孵育，再加入TMB和H₂O₂反应；所述HP的核苷酸如SEQID NO.3所示；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是取相同浓度、相同体积的5’端标记生物素的大肠杆菌适配体Apt和其互补短链cDNA相互混合，于90℃孵育5min，在3h内降至室温，形成复合物Apt-cDNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌适配体Apt和其互补短链cDNA的浓度均为3.2μM，形成复合物Apt-cDNA的浓度为1.6μM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)是将10μL浓度为10mg/mL的M-270链霉亲和素磁珠置于硅化管中，用50μL 1×BW缓冲液洗涤三次，加入20μL 2×BW缓冲液和20μL 1.6μM的Apt-cDNA，置于200rpm摇床中37℃孵育1h；PBS缓冲液洗涤三次后，用其重悬至20μL，之后与大肠杆菌O157:H7孵育，磁分离后取上清液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)是向步骤(2)获得的上清液中加入2μL 100μM HP，40U核酸外切酶III和8μL 500mM KCl溶液，在32℃条件下孵育1h；在75℃20min条件下灭活核酸外切酶III，并在1h内缓慢降至室温；加入2μL100μM氯化血红素室温孵育30min后，再加入40μL 10mM TMB和5μmoL H₂O₂反应20min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的紫外吸收光谱波长为550nm-750nm，间隔10nm，最高峰在650nm处。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用信噪比A/A₀来表示方法的性能，其中A和A₀分别为目标菌组和空白对照组在650nm处的吸光度。