CN116716382A - 一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌o157:h7的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌O157:H7的方法，属于食品安全技术领域。本发明为解决目前检测大肠杆菌O157:H7技术时效性差、灵敏度低、特异性差、操作复杂以及成本较高的问题。所述快速检测大肠杆菌O157:H7的方法是利用链霉亲和素磁珠‑大肠杆菌O157:H7适配体‑适配体互补链特异性捕获大肠杆菌O157:H7，再利用催化发夹自组装等温扩增技术实现对G‑四链体信号的放大，利用G‑四链体与氯化血红素结合后所具有的过氧化物酶活性，催化过氧化氢氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺使溶液显色，并根据颜色信号的强弱实现对液态乳中大肠杆菌O157:H7数量的测定。本发明提供的方法操作简便、特异性强、灵敏度高，为食品中大肠杆菌O157:H7的检测提供参考。
Description
技术领域
本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种快速检测大肠杆菌O157:H7的方法。
背景技术
大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)隶属于肠杆菌科埃希氏菌属，革兰氏染色阴性，无芽孢，有鞭毛，动力试验呈阳性，是一种肠道致病菌。大肠杆菌O157:H7主要传播途径为动物来源的食品，以乳及乳制品居多，感染后会引发出血性结肠炎、溶血性尿毒症综合征或血栓性血小板减少性紫癜等疾病，住院率和死亡率均高于包括沙门氏菌或弯曲杆菌在内的任何其他的肠道致病菌。无论成人还是儿童，大肠杆菌O157:H7感染都会对其健康造成严重威胁。因此，建立一种快速有效的大肠杆菌O157:H7的检测方法具有重大意义。
现阶段已开发出的用于检测大肠杆菌O157:H7的方法均具有一定局限性。传统的微生物学检测技术时效性差、在定量检测方面尚有欠缺，灵敏度和特异性易受到其它物质干扰；分子生物学技术对仪器和操作人员要求高，反应过程易受到污染，造成假阳性结果；仪器分析技术检测成本高昂，依赖专业人员；现有已开发出的一些核酸适体生物传感器技术所涉及的方法需要较长的预增菌时间，对乳中大肠杆菌O157:H7检测的灵敏度仍有待提高，这也是现阶段食源性致病菌快速检测领域发展所遇到的最大瓶颈之一。因此开发一种灵敏度高、特异性好、操作简便，成本较低的大肠杆菌O157:H7快速检测方法成为了目前研究的重中之重。
发明内容
本发明提供了一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌O157:H7的方法，解决了检测大肠杆菌O157:H7技术时效性差、灵敏度低、特异性差、操作复杂以及成本较高的问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌O157:H7的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将5’端标记生物素的大肠杆菌适配体Aptamer和与其互补短链cDNA混合，形成复合物Aptamer-cDNA；所述大肠杆菌适配体Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述互补短链cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
(2)将链霉亲和素磁珠SMBs与步骤(1)中获得的Aptamer-cDNA偶联形成SMBs-Aptamer-cDNA磁珠复合物；
(3)将SMBs-Aptamer-cDNA磁珠复合物磁分离后移去上清液，向磁分离后的SMBs-Aptamer-cDNA磁珠复合物中加入大肠杆菌O157:H7菌液进行孵育，孵育完成后进行磁分离取上清液；
(4)向步骤(3)中获得的上清液中加入发夹探针HP1、HP2、HP3进行等温扩增反应得到获得含有G-四链体结构的溶液，所述HP1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述HP2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述HP3的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
(5)向步骤(4)获得的含有G-四链体结构的溶液中加入heminDNA酶孵育后，加入H2O2和TMB溶液反应，反应后溶液结果成蓝色，用多功能酶标仪测定吸光值，完成检测。
进一步的，所述步骤(1)中，将5’端标记生物素的大肠杆菌适配体Aptamer和与其互补短链cDNA混合，形成复合物Aptamer-cDNA的方法为：将等体积的3μM 5’端标记生物素的大肠杆菌适配体Aptamer和3μM适配体互补链cDNA混合并在95℃加热5min，加热完成后置于室温下退火冷却，形成复合物Aptamer-cDNA。
进一步的，所述步骤(2)的具体过程为：将1mg的链霉亲和素磁珠SMBs用1×B&W缓冲液洗涤3次，洗涤完成后用200ul 2×B&W缓冲液重悬，向重悬后的SMBs中加入等体积的步骤(1)获得的Aptamer-cDNA进行孵育，获得SMBs-Aptamer-cDNA磁珠复合物。
进一步的，所述向重悬后的SMBs中加入等体积的步骤(1)获得的Aptamer cDNA进行孵育，孵育条件为温度37℃、摇床转速200rpm振荡孵育1h。
进一步的，所述步骤(3)中孵育条件为温度37℃、摇床转速180rpm孵育75min。
进一步的，所述步骤(4)中等温扩增反应条件为温度25℃，时间90min。
进一步的，所述步骤(5)中孵育条件为室温孵育，时间25min，形成G-四链体/heminDNA酶，再加入H2O2和TMB溶液反应时间为12min。
进一步的，所述步骤(5)中多功能酶标仪测定吸光值的波长为650nm。
有益技术效果
本发明将催化发夹自组装技术与免疫磁分离方法结合，可以对乳中的大肠杆菌O157:H7实现快速、高特异性以及高灵敏度的检测。首先，利用磁分离技术，通过链霉亲和素包裹的磁珠与生物素标记的大肠杆菌O157:H7适配体结合，可以实现对纯培养以及液态乳中大肠杆菌O157:H7的捕获和富集。之后基于催化发夹自组装等温技术对磁分离后的目标片段进行不断循环扩增，特异性强，且能够显著提高比色核酸适配体传感器检测的灵敏度。
催化发夹自组装技术与免疫磁分离方法相结合时，免疫磁分离方法可以有效克服乳中的复杂基质(乳清、脂肪)对致病菌检测造成的干扰，并且对大肠杆菌O157:H7的捕获过程仅需75min，无需像传统检测法那样对大肠杆菌O157:H7进行预增菌(通常需要3-6小时)，可以大大缩短检测时间，使得该方法具有良好的时效性。其次，催化发夹自组装技术具有较高的信号放大效率、较低的背景信号和操作简单等优点，通过将微量目标片段不断扩增，达到显著提高检测结果灵敏度的目的。在此技术中，针对纯培养物中大肠杆菌O157:H7的检测限达到101CFU/mL，对于人工污染乳中大肠杆菌O157:H7的检测限可达到102CFU/mL，具有极高的灵敏度和特异性。
本发明将催化发夹自组装技术与免疫磁分离方法相结合，不仅可以实现对乳中大肠杆菌O157:H7的检测，还可以推广应用到液态乳中其他食源性致病菌例如沙门氏菌、克罗诺杆菌、单增李斯特氏菌等的检测，为液态乳中致病菌的检测提供了一种新的方式。
附图说明
图1为催化发夹自组装等温扩增技术原理；
图2为与SMBs结合的Aptamer-cDNA浓度的优化，Aptamer-cDNA浓度分别为0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM；
图3为SMBs与Aptamer-cDNA孵育时间的优化，孵育时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h；
图4为SMBs-Aptamer-cDNA复合物添加量的优化，SMBs-Aptamer-cDNA复合物添加量分别为20μg、40μg、60μg、80μg、100μg；
图5为SMBs-Aptamer-cDNA与E.coli O157:H7孵育时间的优化，孵育时间分别为30min、45min、60min、75min、90min；
图6为反应体系缓冲液pH的优化，缓冲液pH分别为6.8、7.2、7.6、8.0；
图7为CHA反应温度的优化，CHA反应温度分别为13℃、25℃、37℃、49℃、61℃；
图8为发夹HP浓度的优化，发夹HP浓度分别为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM；
图9为适配体互补链cDNA和发夹HP反应时间的优化，cDNA和发夹HP反应时间分别为30min、60min、90min、120min、150min；
图10为催化发夹自组装传感器的特异性验证：1为空白对照；2为大肠杆菌O157:H7；3为大肠杆菌O104；4为大肠杆菌O152；5为大肠杆菌O144；6为大肠杆菌ATCC 25922；7为鼠伤寒沙门氏菌；8为阪崎克诺罗杆菌；9为丙二酸盐克罗诺杆菌；10为单增李斯特氏菌；11为金黄色葡萄球菌；12为阴沟肠杆菌；13为副溶血性弧菌；14为蜡样芽胞杆菌；15为枯草芽孢杆菌；16为福氏志贺氏菌；
图11为催化发夹自组装传感器在大肠杆菌O157:H7纯培养下的灵敏度，图a是在不同浓度大肠杆菌O157:H7存在下的紫外吸收光谱，从上至下大肠杆菌O157:H7浓度依次为8.6×108、8.6×107、8.6×106、8.6×105、8.6×104、8.6×103、8.6×102、8.6×101、8.6×100CFU/mL、空白对照；图b是吸光度与大肠杆菌O157:H7浓度的对数之间的关系；
图12为催化发夹自组装传感器在人工污染大肠杆菌O157:H7液态乳中的灵敏度，图a是液态乳中不同浓度大肠杆菌O157:H7存在下的紫外吸收光谱，从上至下大肠杆菌O157:H7浓度依次为3.3×108、3.3×107、3.3×106、3.3×105、3.3×104、3.3×103、3.3×102、3.3×101CFU/mL、空白对照；图b是吸光度与大肠杆菌O157:H7浓度的对数之间的关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做出进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
本发明所涉及到的菌株及其信息如表1所示。
表1 菌株信息
| 菌株名称 | 菌株编号 | 菌株来源 |
| 大肠杆菌O157:H7 | ATCC 43895 | 广东省微生物研究所 |
| 大肠杆菌O104 | Laboratory | 乳品科学教育部重点实验室 |
| 大肠杆菌O152 | Laboratory | 乳品科学教育部重点实验室 |
| 大肠杆菌O144 | Laboratory | 乳品科学教育部重点实验室 |
| 大肠杆菌 | ATCC 25922 | 广东省微生物研究所 |
| 阪崎克罗诺杆菌 | ATCC 29544 | 中国食品药品检定研究院 |
| 丙二酸盐克罗诺杆菌 | DSM 18702 | 中国微生物菌种典藏中心 |
| 鼠伤寒沙门氏菌 | ATCC 14028 | 广东省微生物研究所 |
| 蜡样芽孢杆菌 | CMCC 63303 | 福建省疾病预防控制中心 |
| 枯草芽孢杆菌 | CMCC 63501 | 福建省疾病预防控制中心 |
| 单核细胞增生李斯特氏菌 | ATCC 19114 | 中国食品药品检定研究院 |
| 副溶血性弧菌 | ATCC 17802 | 福建省疾病预防控制中心 |
| 阴沟肠杆菌 | ATCC 3503 | 福建省疾病预防控制中心 |
| 金黄色葡萄球菌 | ATCC 25923 | 中国食品药品检定研究院 |
| 福氏志贺氏菌 | CMCC 51572 | 中国微生物菌种典藏中心 |
菌株的培养方法为：
将冻存管内的大肠杆菌O157:H7按照2％的接种量转移到20mL的LB液体培养基内，培养10-12h。在LB琼脂培养基平板上三区划线，培养12h，挑取单菌落，培养10-12h，即得到处于对数生长期的大肠杆菌O157:H7菌液，用于后续实验。
本发明涉及到的核酸序列如表2所示。
表2核酸序列
实施例1
基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌O157:H7的方法，所述检测方法的实验原理图见图1。
(1)SMBs-Aptamer-cDNA复合物的制备
SMBs-Aptamer-cDNA复合物的制备主要分为两个步骤，Aptamer与cDNA结合形成双链以及链霉亲和素磁珠与Aptamer-cDNA偶联形成SMBs-Aptamer-cDNA复合物。
(2)Aptamer与cDNA结合形成双链
取3μL 100μM的Aptamer和cDNA，分别加入97μL的Tris-HCl缓冲液，最终形成3μM的Aptamer与cDNA。将100μL的Aptamer和cDNA混合，在95℃下退火5min，之后缓慢冷却至室温，形成1.5μM的Aptamer-cDNA复合物。
(3)SMBs与Aptamer-cDNA偶联形成SMBs-Aptamer-cDNA复合物
取100μL SMBs磁珠悬浮液，加入100μL的1×B&W缓冲液混匀，将硅化管置于磁架上，静置10s后弃上清液，重复此操作3次，将磁珠重悬于2×B&W缓冲液。取等体积1.5μM的Aptamer-cDNA与磁珠重悬液混合，在37℃、200rpm摇床中振荡孵育1h，之后将硅化管置于磁架上，弃上清，用1×B&W缓冲液洗涤沉淀三次，保存于200μL的PBS缓冲液中待用。
(4)SMBs-Aptamer-cDNA复合物对大肠杆菌O157:H7的捕获
取1mL大肠杆菌O157:H7菌液，PBS洗涤3次，之后重悬于1mL的Tris-HCl缓冲液中待用。取16μL(80μg)磁珠悬浮液于硅化管中，磁分离后弃上清，加入70μL重悬于Tris-HCl缓冲液中的菌液，在37℃、180rpm摇床中振荡孵育75min。
(5)催化发夹自组装等温扩增反应
将振荡孵育完成的硅化管置于磁架上10s，取70μL上清液转移至新的200μL离心管中，之后分别加入10μL 30μM的HP1、HP2、HP3，溶液总体积为100μL。将离心管置于25℃下反应90min，形成G-四链体结构。
(6)G-四链体/hemin DNA酶的形成
将2μM(终浓度)的hemin加入到反应完成的溶液中，室温下避光静置孵育25min，形成G-四链体/hemin DNA酶。
(7)显色反应
往孵育完成的溶液中加入5mM(终浓度)H2O2和TMB显色液，室温下静置反应12min后观察颜色变化并用多功能酶标仪在650nm处记录吸光度。
检测方法的优化。
(1)SMBs-Aptamer-cDNA复合物的优化
与SMBs结合的Aptamer-cDNA复合物浓度的优化：
固定其他成分的浓度，调整Aptamer-cDNA复合物浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5μM，通过CHA等温扩增体系进行扩增反应，之后利用多功能酶标仪在650nm处分别测定阳性样本的吸光度A和空白对照样本的吸光度A0，根据A/A0的大小来选择Aptamer-cDNA复合物的最佳浓度。
如图2所示，当Aptamer-cDNA浓度在0.5～1.5μM时，A/A0逐渐增加并在1.5μM达到最大，随着双链浓度的进一步增加，A/A0有所下降，因此选择与SMBs结合的Aptamer-cDNA复合物浓度为1.5μM。
SMBs与Aptamer-cDNA反应时间的优化：
固定其他成分的浓度，调整SMBs与Aptamer-cDNA的反应时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，通过CHA等温扩增体系进行扩增反应，之后利用多功能酶标仪在650nm处分别测定阳性样本的吸光度A和空白对照样本的吸光度A0，根据A/A0的大小来选择最佳反应时间。
如图3所示，当结合时间为1.5h时，A/A0达到最大，随着结合时间进一步延长，A/A0趋于稳定，无显著变化，因此根据时效性，选择的结合时间为1.5h。
(2)关键反应条件的优化
SMBs-Aptamer-cDNA复合物添加量：
固定其他成分的浓度，调整SMBs-Aptamer-cDNA的添加量分别为20、40、60、80、100μg，通过CHA等温扩增体系进行扩增反应，之后利用多功能酶标仪在650nm处分别测定阳性样本的吸光度A和空白对照样本的吸光度A0，根据A/A0的大小来选择复合物添加量。
如图4所示，复合物添加量在20～80μg之间，随着复合物添加量的增加，A/A0呈上升趋势，当复合物添加量继续提高时，背景值提高，导致A/A0有所下降，因此选择复合物的添加量为80μg。
SMBs-Aptamer-cDNA与E.coli O157:H7孵育时间：
固定其他成分的浓度，调整孵育时间分别为30、45、60、75、90min，通过CHA等温扩增体系进行扩增反应，之后利用多功能酶标仪在650nm处分别测定阳性样本的吸光度A和空白对照样本的吸光度A0，根据A/A0的大小来选择孵育时间。
如图5所示，随着SMBs-Aptamer-cDNA与大肠杆菌O157:H7孵育时间的增加，A/A0值呈现先升高后缓慢降低的趋势，在75min时达到最大，因此选择75min作为孵育时间。
反应体系缓冲液pH的优化：
固定其他成分的浓度，调整Tris-HCl缓冲液pH分别为6.8、7.2、7.6、8.0，通过CHA等温扩增体系进行扩增反应，之后利用多功能酶标仪在650nm处分别测定阳性样本的吸光度A和空白对照样本的吸光度A0，根据A/A0的大小来选择缓冲液pH。
如图6所示，当体系缓冲液的pH为7.6时，A/A0显著高于其他pH条件下的A/A0，因此该反应体系的Tris-HCl缓冲液pH选择7.6。
CHA反应温度：
固定其他成分的浓度，调整CHA反应温度分别为13、25、37、49、61℃，之后利用多功能酶标仪在650nm处分别测定阳性样本的吸光度A和空白对照样本的吸光度A0，根据A/A0的大小来选择反应温度。
如图7所示，当反应温度在25℃时，A/A0达到最大，随着反应温度的继续升高，A/A0显著降低，因此反应温度选择为25℃。
发夹HP浓度：
固定其他成分的浓度，调整发夹HP1、HP2、HP3浓度分别为1、2、3、4、5μM，通过CHA等温扩增体系进行扩增反应，之后利用多功能酶标仪在650nm处分别测定样本的吸光度A和空白对照样本的吸光度A0，根据A/A0的大小来确定发夹探针浓度。
如图8所示，HP浓度在1～3μM时，A/A0随HP浓度的增加而提高，3μM时A/A0达到最大；当HP浓度在3～5μM时，A/A0略微降低，因此选择3μM作为HP的浓度。
适配体互补链cDNA和发夹HP反应时间：
固定其他成分的浓度，调整反应时间分别为30、60、90、120、150min，通过CHA等温扩增体系进行扩增反应，之后利用多功能酶标仪在650nm处分别测定样本的吸光度A和空白对照样本的吸光度A0，根据A/A0的大小来确定反应时间。
如图9所示，在30～90min时，A/A0随着反应时间的增加而逐渐增加，在90min之后，A/A0趋于稳定，不产生显著变化，因此选择90min作为HP与cDNA反应时间。
实施例2
利用基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌O157:H7的方法检测人工污染奶样。
将培养至一定浓度的1mL大肠杆菌O157:H7菌悬液在12000rpm下离心5min，用PBS缓冲液洗涤3次，之后往菌泥中加入1mL无菌乳均匀混合，梯度稀释至101-108CFU/mL。将1mL人工污染奶样用PBS缓冲液洗至溶液呈透明无明显浑浊，按照实施例1所述的方法进行检测。
实施例3
基于催化发夹自组装传感器特异性的验证结果。
所构建基于催化发夹自组装传感器的特异性见图10，大肠杆菌O157:H7呈阳性反应，4株非O157:H7分型的大肠杆菌以及10株非大肠杆菌菌株均呈阴性反应，这表明所构建的传感器只能检测出大肠杆菌O157:H7，不会受到大肠杆菌的其他分型以及非大肠杆菌菌属的干扰，证明了该传感器具有良好的特异性。
实施例4
基于催化发夹自组装传感器灵敏度的测定结果。
(1)纯培养物的灵敏度测定
经平板计数，原始菌液浓度为8.6×109CFU/mL。如图11a和11b所示，传感器在纯培养中的检测限为8.6×101CFU/mL，线性范围为8.6×102～8.6×107CFU/mL。
(2)人工污染乳的灵敏度测定
人工污染乳的大肠杆菌O157:H7菌液浓度从3.3×101CFU/mL～3.3×108CFU/mL。如图12a和12b所示，传感器在人工污染乳中的检测限为3.3×102CFU/mL，线性范围为3.3×103～3.3×107CFU/mL。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将5’端标记生物素的大肠杆菌适配体Aptamer和与其互补短链cDNA混合，形成复合物Aptamer cDNA；所述大肠杆菌适配体Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述互补短链cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
(2)将链霉亲和素磁珠SMBs与步骤(1)中获得的Aptamer-cDNA偶联形成SMBs-Aptamer-cDNA磁珠复合物；
(3)将SMBs-Aptamer-cDNA磁珠复合物磁分离后移去上清液，向磁分离后的SMBs-Aptamer-cDNA磁珠复合物中加入大肠杆菌O157:H7菌液进行孵育，孵育完成后进行磁分离取上清液；
(4)向步骤(3)中获得的上清液中加入发夹探针HP1、HP2、HP3进行等温扩增反应得到获得含有G-四链体结构的溶液，所述HP1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述HP2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述HP3的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
(5)向步骤(4)获得的含有G-四链体结构的溶液中加入heminDNA酶孵育后，加入H2O2和TMB溶液反应，反应后溶液结果成蓝色，用多功能酶标仪测定吸光值，完成检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将5’端标记生物素的大肠杆菌适配体Aptamer和与其互补短链cDNA混合，形成复合物Aptamer cDNA的方法为：将等体积的3μM 5’端标记生物素的大肠杆菌适配体Aptamer和3μM适配体互补链cDNA混合并在95℃加热5min，加热完成后置于室温下退火冷却，形成复合物Aptamer-cDNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体过程为：将1mg的链霉亲和素磁珠SMBs用1×B&W缓冲液洗涤3次，洗涤完成后用200ul 2×B&W缓冲液重悬，向重悬后的SMBs中加入等体积的步骤(1)获得的Aptamer cDNA进行孵育，获得SMBs-Aptamer-cDNA磁珠复合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述孵育条件为温度37℃、摇床转速200rpm振荡孵育1h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中孵育条件为温度37℃、摇床转速180rpm孵育75min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中等温扩增反应条件为温度25℃，时间90min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中孵育条件为室温孵育，时间25min，形成G-四链体/hemin DNA酶，再加入H2O2和TMB溶液反应时间为12min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中多功能酶标仪测定吸光值的波长为650nm。
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