CN114807200B - 一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表面展示生物酶的无载体双固定化高效生物催化剂及其制备方法和应用，属于生物化工和发酵工程技术领域。本申请利用细胞表面展示技术将酶固定在宿主细胞表面，利用细胞表达絮凝蛋白实现细胞成团，从而固定在反应器中，絮凝细胞颗粒自重沉降，无需离心操作，可实现产物分离和催化剂连续循环使用，简化生产环节，增加生产强度，降低生产成本；此外固定化细胞密度大，形成细胞群体效应，进一步提高环境胁迫耐受性，降低产物浓度抑制压力，广泛适用于各类高附加价值化学品的规模化绿色生物制造。本发明所述的生物催化剂的制备方法为我国开发具有完全自主知识产权的生物催化剂和化学品的绿色生物制造奠定良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于生物化工和发酵工程技术领域，具体涉及一种无载体双固定化生物催化剂的开发与优化，及其在生物催化转化和产物分离纯化过程的应用。
背景技术
作为世界第一制造大国，化工产业是我国国民经济和国防工业重要的基础性行业。但是当前经济社会发展面临诸多挑战，如与日俱增的能源需求，日益枯竭的土地、水和化石资源，和逐渐加剧的全球变暖等。因此，开发绿色可持续的制造模式是我国化工产业发展的必然趋势。
近年来，生物制造技术的不断进步为传统化工产业的转型升级提供了绿色动力，也成为了未来我国实现绿色发展的重要突破口。生物制造技术不仅能节约资源(把高温、高压、高污染的化学工业过程向着条件温和、清洁环保的生物加工过程转移)，而且在碳减排方面也做出了突出贡献(工业过程中每使用1kg酶制剂，可显著减少100kg二氧化碳的排放)，因而被全球众多国家积极的推进和发展，广泛地应用于农业、工业、食品、保健品和医药等领域。
我国生物制造技术起步较晚，目前虽发展迅速，但仍存在不少技术短板和“卡脖子”问题，尤其是缺乏具有完全自主知识产权的生物制造核心“芯片”：生物催化剂。面对美国、日本、荷兰等国的技术垄断，我国生物制造产业正处于技术攻坚克难和商业开拓应用的关键阶段，迫切需要高效且优质的生物催化剂以及绿色化与集成化的生产过程。
现有的生物催化剂主要分为两类，酶制剂和微生物全细胞催化剂。其中，酶制剂催化活性高，但存在酶制备步骤多、难度大、易失活且难以回收再利用、下游产物分离纯化困难以及生产成本高等缺点。工业生产过程一般会采用酶的固定化来提高酶利用率，不过传统固定化方法也存在影响催化效率的传质阻力问题(专利CN104480075A和CN105274174A)。而含有生物酶的全细胞催化剂有效克服了酶制剂的使用弊端，但产物易被胞内酶降解、跨膜阻力影响生产效率、以及分离纯化过程中需要使用大型离心设备和巨大能耗等仍是不容忽视的问题(专利CN201611254213.2)。因此，围绕国家重大战略需求，加快关键核心技术攻关，本领域现急需开发一种能够广泛应用于不同底物的通用性生物催化平台技术以规模化创制各种高效且优质的生物催化剂，并设计具有高活性、高强度、低成本和可持续特色的生产方式实现高附加价值化学品的绿色生物制造，使之具备与化学法相竞争的潜力开拓占领国内外市场份额，积极推动工业绿色化和产业国际化。
发明内容
鉴于此，本发明首次建立了一种表面展示生物酶的无载体双固定化高效生物催化剂及其制备方法和应用。
本发明的目的之一是通过引导肽将一种或多种生物酶锚定到细胞表面，实现生物酶在细胞的原位固定化，避免物质运输的跨膜阻力和产物的胞内降解。
本发明的目的之二是通过絮凝基因的表达使细胞自絮凝成毫米级颗粒，实现生物反应器内固液自动化分离的无载体固定化，自重沉降分离产物和生物催化剂，避免离心和传质阻力。
本发明的目的之三是开发基于上述目的表面展示生物酶的无载体双固定化通用性平台技术，以规模化创制高效且优质的生物催化剂，实现多种高附加值化学品的生物制造。
本发明的目的之四是开发清洁、安全、高效和连续的生产工艺，通过生物催化剂循环利用简化生产环节，降低生产成本，提高生产强度，实现多种高附加值化合物的绿色可持续化生产。
本发明的目的之五是提供一种创制高效优质生物催化剂、重构与强化反应与分离过程、实现产物连续高强度生产的全链条工艺设计。
本发明的目的之六是提供一种改变絮凝性状的方法，实现絮凝颗粒尺寸的可控调节，使之无载体自固定化于生物反应器。
本发明的目的之七是提供一种酶活高、稳定性好、无载体、可循环使用、无跨膜阻力和传质阻力的酶与细胞的双固定化方法。
本申请的具体技术方案如下：
一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂的制备方法，首先克隆絮凝基因并优化絮凝基因结构以调整宿主细胞的絮凝颗粒尺寸，实现宿主细胞的无载体自固定化，然后通过表面展示技术将生物酶固定化于宿主细胞的外表面，所得宿主细胞经过培养后即得表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂。
基于以上技术方案，进一步地，所述的制备方法主要包括以下步骤：
(1)首先分别扩增启动子和絮凝基因，插入到载体中构建絮凝表达载体，优化絮凝基因结构，制备絮凝基因重复序列随机丢失的突变文库，转入宿主细胞中筛选阳性转化子，筛选具有絮凝性状的宿主细胞；
(2)扩增获得生物酶的基因，连接到表面展示表达载体中，将所得的表面展示表达载体转入步骤(1)得到的宿主细胞中，经过培养后得到表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂。
基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的絮凝基因包括但不局限于FLO1，FLO5，FLO9，FLO10，FLO11基因；所述的启动子包括但不局限于PGK和GAL1(SEQ ID NO.2)；组成型强表达启动子PGK使得絮凝基因从生长开始就表现出絮凝状态；半乳糖诱导型启动子GAL1，受葡萄糖抑制，在葡萄糖耗尽时半乳糖可启动外源基因表达，使宿主细胞成为絮凝状态。
基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的表达载体为穿梭载体、游离载体和整合载体中的任意一种，包括但不局限于pRS425。
基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述宿主细胞为原核微生物和真核微生物中的任意一种，包括但不局限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、微藻类。
基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的宿主细胞为真核微生物的任意一种，包括但不局限于酿酒酵母S.cerevisiae EBY100。
基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述优化具体过程为：将构建的絮凝表达载体转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α中培养，混菌提质粒，获得絮凝基因重复序列随机丢失的突变文库。
基于以上技术方案，进一步地，步骤(2)中所述生物酶的种类为一种或两种以上，所述生物酶为水解酶、转酯酶或合成酶，包括但不局限于Asp-OMe-Phe合成的转酯酶和烟酰胺单核苷酸合成的烟酰胺核糖激酶。
基于以上技术方案，进一步地，Asp-OMe-Phe合成的转酯酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，烟酰胺单核苷酸合成的烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
基于以上技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的表面展示表达载体的表面展示方法包括但不局限于絮凝素锚定和SED锚定。
基于以上技术方案，进一步地，所述的表面展示表达载体包括但不局限于含有a-凝集素的表面展示表达载体pYD1。
本发明另一方面提供上述的制备方法制得的无载体双固定化生物催化剂。
本发明还提供一种高强度、低成本、连续生产目标化学品的方法，具体包括以下两种：
(1)连续批式反应：通过将上述的无载体双固定化生物催化剂与底物加入反应器内，反应结束后，无载体双固定化生物催化剂自重沉降，移出反应上清液，补加新鲜底物溶液进行下一批次生物催化反应；
(2)连续循环反应：将上述的无载体双固定化生物催化剂固定于反应器内，从溢流口收集流出的反应液，以合适的流速补充新鲜的底物溶液进行连续循环生物催化反应。
本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本申请的表面展示生物酶的固定化技术避免了物质运输的跨膜阻力和传统固定化方式的传质阻力，具有酶活高、稳定性好、不易脱落、可重复利用、产物不发生胞内降解等特点；絮凝无载体自固定化技术，细胞自动化形成毫米级絮凝颗粒，无需离心和其他固定化材料，自重沉降，简化生产步骤，降低生产成本，增加细胞密度和环境胁迫耐受性，适用于大规模连续生物催化过程。
(2)本申请开发的无载体双固定化生物催化剂的制备方法作为一种通用的生物催化剂制备方法，解决了现有生物催化剂的共性问题，可用于高效生物催化剂的创制、反应与分离过程的重构与加强，快速将投入的底物高效转化为目标产物，具有反应条件温和、反应速度快、催化效率高、环境污染小、生产成本低和连续可持续发展等多方面优势。该技术的推广和应用将帮助我国获得一系列具有完全自主知识产权的高性能全细胞生物催化剂，极大扩充我国绿色生物制造的工业菌株储备库，打破国际的核心技术垄断，为实现高附加化合物的绿色化与集成化生产奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为三个絮凝基因突变体EP-FLO1-a10、EP-FLO1-a14、EP-FLO1-a16及阴性对照(无絮凝基因重复序列)的絮凝性状。
图2表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂的连续生产工艺示意图及重复利用情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
絮凝基因的表达调控与无载体自固定化
首先通过PCR分别扩增启动子PGK(SEQ ID NO.1)和絮凝基因FLO1(SEQ ID NO.3)，经XhoI/HindIII和BamHI/NotI限制性内切酶分别处理后，依次插入到pRS425载体中，将构建的酵母絮凝表达载体pRS425-PGK-FLO1转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α中培养，混菌提质粒，制备FLO1絮凝基因重复序列随机丢失的突变文库；将絮凝基因重复序列随机丢失突变体文库转至酿酒酵母S.cerevisiae EBY100中筛选验证，评估阳性转化子EP-FLO1m的絮凝性状并测序。根据测序结果发现，絮凝基因内重复序列的数量与絮凝颗粒的大小成正相关，重复序列丢失10、14和16个的三个絮凝基因突变体EP-FLO1-a10(絮凝基因核苷酸序列为SEQ ID NO.4)、EP-FLO1-a14(絮凝基因核苷酸序列为SEQ ID NO.5)和EP-FLO1-a16(絮凝基因核苷酸序列为SEQ ID NO.6)直观展现了具有显著性差异的絮凝颗粒大小(如图1所示)。其中EP-FLO1-a10和EP-FLO1-a14仍能保持毫米级絮凝颗粒，但是丢失了16个重复序列的EP-FLO1-a16几乎丧失了絮凝性状。因此，可以通过调节絮凝基因FLO1中重复序列的含量，可得到不同絮凝颗粒大小的细胞EP-FLO1m，实现在反应器内的无载体自固定化。同时，我们可以利用基因编辑自主调控絮凝基因内重复序列数量，从而得到絮凝颗粒大小适合于在各类生物反应器内稳定实现无载体自固定化的生物催化剂。
实施例2
创制阿斯巴甜前体肽绿色合成的无载体双固定化生物催化剂
通过PCR扩增鞘氨醇杆菌属转酯酶基因AET(SEQ ID NO.7)，经BamHI/XhoI限制性内切酶处理后，连接至含有a-凝集素的表面展示表达载体pYD1中，将构建的酵母表面展示表达载体pYD1-AET转入实施例1的絮凝菌EP-FLO1-a10，得到用于阿斯巴甜前体肽(Asp-OMe-Phe)绿色合成的无载体双固定化生物催化剂EPA-FLO1-a10。
实施例3
创制烟酰胺单核苷酸绿色合成的无载体双固定化生物催化剂
通过PCR扩增克鲁维酵母菌属烟酰胺核糖激酶基因NRK(SEQ ID NO.8)，将其连接至含有a-凝集素的表面展示表达载体pYD1中，将构建的酵母表面展示表达载体pYD1-NRK转入絮凝菌EP-FLO1-a10，得到用于烟酰胺单核苷酸(NMN)绿色合成的无载体双固定化生物催化剂EPN-FLO1-a10。
实施例4
无载体双固定化全细胞生物催化剂用于Asp-OMe-Phe合成的培养与反应：
将实施例2的无载体双固定化全细胞生物催化剂EPA-FLO1-a10接种至100mL的种子培养基中(YNB 1.34g，加入80mL ddH2O，121℃灭菌15min；灭菌后补加过膜除菌的10×氨基酸混合液10mL，40％葡萄糖10mL)，30℃，200rpm振荡培养至OD620为2.0左右。然后，将菌体转移至200mL的诱导培养基(YNB 2.68g，加入160mL ddH2O，121℃灭菌15min；灭菌后补加过膜除菌的10×氨基酸混合液20mL，40％半乳糖20mL)，25℃，200rpm振荡培养48h。其中10×氨基酸混合液具体包括精氨酸0.2g/L、天冬氨酸1.0g/L、谷氨酸1.0g/L、异亮氨酸0.3g/L、赖氨酸0.3g/L、缬氨酸1.5g/L、蛋氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、丝氨酸3.75g/L、酪氨酸0.3g/L和腺嘌呤0.4g/L。
在生物反应器内EPA-FLO1-a10添加至含有100mmol/L天冬氨酸二甲酯盐酸盐Asp-(OMe)2和200mmol/L苯丙氨酸(Phe)的底物溶液中，控制反应温度为20℃，用6mmol/L NaOH溶液维持反应pH恒定在8.5，反应60min后，通过高效液相色谱(HPLC)检测Asp-OMe-Phe浓度，经计算可生成72.8mmol/L的Asp-(OMe)-Phe，转化率高达73％。本发明创制的无载体双固定化全细胞生物催化剂EPA-FLO1-a10以阿斯巴甜前体肽的高效合成，展示了我们所开发的平台技术在食品绿色生物制造领域的应用优势和广阔前景。
实施例5
无载体双固定化全细胞生物催化剂用于NMN合成的培养与反应：
EPN-FLO1-a10的培养条件及过程与实施例4所述的培养条件及过程相同。
在生物反应器内将EPN-FLO1-a10添加至含有50mmol/L烟酰胺核糖(NR)和50mmol/L ATP的底物溶液中，控制反应温度为30℃，用6mmol/L NaOH溶液维持反应pH恒定在6.0，反应2h后，通过HPLC检测NMN浓度，经计算可生成42.5mmol/L的NMN，转化率高达85％，实现了NMN的高效合成。本发明创制的无载体双固定化全细胞生物催化剂EPN-FLO1-a10以NMN的高效合成，展示了我们所开发的平台技术在药品的绿色生物制造领域的应用优势和广阔前景。
实施例6
(1)连续批式使用EPA-FLO1-a10高效合成Asp-OMe-Phe：
EPA-FLO1-a10的培养和反应条件与实施例4所述的培养和反应条件相同，每完成一次催化反应，通过自沉降移除反应上清液，然后再补加新鲜的底物溶液进行下一轮催化反应，连续测试五个批次Asp-OMe-Phe浓度。
结果如图2(A)所示，将初始的生物催化剂活性定义为100％，第一次循环利用的相对酶活性为98％，第二次循环利用的相对酶活性为95％，第三次循环利用的相对酶活性为91％，第四次循环利用的相对酶活性为85％。酶活略有降低的原因推测是由于少量细胞的流失，以及每批次由于不能完全移除反应上清液，导致底物溶液被稀释所致。本申请基于无载体双固定化生物催化剂开发的连续批式生产工艺具备低成本、高强度、可持续特色的工业化应用潜力。
(2)连续循环使用EPA-FLO1-a10高效合成Asp-OMe-Phe：
EPA-FLO1-a10的培养和反应条件与实施例4所述的培养和反应条件相同，絮凝颗粒被截留在生物反应器内，反应60min后，以5mL/min的流速向生物反应器内部补充新鲜的底物溶液，每间隔30min从溢流口收集反应液，连续测试300min内Asp-OMe-Phe浓度。结果如图2(B)所示，将开始补料时的生物催化剂活性定义为100％，30-300min内的相对酶活性均能维持90％左右，本发明创制的无载体双固定化生物催化剂EPA-FLO1-a10以其连续循环催化的生产工艺，展示了良好的催化稳定性和生产强度，可作为大规模连续生物催化过程的首选生产工艺。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连理工大学
<120> 一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂及其制备方法和应用
<130> 20220317
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 872
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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tag 723
Claims (6)
1.一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂的制备方法，其特征在于，首先克隆絮凝基因并优化絮凝基因结构以调整宿主细胞的絮凝颗粒尺寸，实现宿主细胞的无载体自固定化，然后通过表面展示技术将生物酶固定化于宿主细胞的外表面，所得宿主细胞经过培养后即得表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂；
包括以下步骤：
（1）首先分别扩增启动子和絮凝基因，插入到载体中构建絮凝表达载体，优化絮凝基因结构，制备絮凝基因重复序列随机丢失的突变文库，转入宿主细胞中筛选阳性转化子，筛选得到具有絮凝性状的宿主细胞；所述得到具有絮凝性状的宿主细胞中的絮凝基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；
（2）扩增获得生物酶的基因，连接到表面展示表达载体中，将所得的表面展示表达载体转入步骤（1）得到的宿主细胞中，经过培养后得到表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂；
步骤（1）中所述的絮凝基因为FLO1；絮凝基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的启动子包括PGK和GAL1；所述的絮凝表达载体为穿梭载体、游离载体和整合载体中的任意一种，包括pRS425；
步骤（2）中所述生物酶为用于阿斯巴甜前体肽Asp-OMe-Phe合成的转酯酶或用于烟酰胺单核苷酸合成的烟酰胺核糖激酶；
所述宿主细胞为酿酒酵母。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述优化具体过程为：将构建的絮凝表达载体转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α中培养，混菌提质粒，获得絮凝基因重复序列随机丢失的突变文库。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的表面展示表达载体的表面展示方法包括絮凝素锚定和SED锚定。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的表面展示表达载体包括含有a-凝集素的表面展示表达载体pYD1。
5.权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的无载体双固定化生物催化剂。
6.一种连续生产目标化学品的方法，其特征在于，具体包括以下两种方法：
（1）连续批式反应：通过将权利要求5所述的无载体双固定化生物催化剂与底物加入反应器内，反应结束后，无载体双固定化生物催化剂自重沉降，移出反应上清液，补加新鲜底物溶液进行下一批次生物催化反应；
（2）连续循环反应：将权利要求5所述的无载体双固定化生物催化剂固定于反应器内，从溢流口收集流出的反应液，以合适的流速补充新鲜的底物溶液进行连续循环生物催化反应；
所述的目标化学品为阿斯巴甜前体肽Asp-OMe-Phe或烟酰胺单核苷酸；
用于合成阿斯巴甜前体肽Asp-OMe-Phe的底物为天冬氨酸二甲酯盐酸盐和苯丙氨酸；用于合成烟酰胺单核苷酸的底物为烟酰胺核糖和ATP。
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