CN114796198A - 金粟兰内酯b在制备nlrp3炎症小体抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物领域，本发明公开了金粟兰内酯B在制备NLRP3炎症小体抑制剂中的应用，其能够抑制ASC斑点形成，以及后续caspase‑1 p20的活化和IL‑1β的分泌。金粟兰内酯B可作为为治疗炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。

Description

金粟兰内酯B在制备NLRP3炎症小体抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及金粟兰内酯B在制备NLRP3炎症小体抑制剂中的应用。

背景技术

NLRP3炎症小体在先天免疫、炎症和多种慢性炎症相关疾病中发挥重要作用，但其激活机制复杂。越来越多的证据表明NLRP3炎症小体是一种很有前途的治疗炎症性疾病的靶点。到目前为止，研究的最好、最具特征的炎症小体是NLRP3炎症小体，NLRP3炎症小体是一种存在于细胞内的多蛋白复合物，由NLRP3蛋白，凋亡相关斑点样蛋白(ASC)，效应分子半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(pro-Caspase-1)和NEK7蛋白四部分组成。ASC作为一种接头蛋白，能够连接上游的NLRP3受体蛋白和下游的pro-Caspase-1，三种蛋白紧密连接从而保证了NLRP3炎症小体的免疫活性和生物学功能。NLRP3炎症小体的激活依赖于两种启动信号:第一种启动信号主要由Toll样受体(TLR)/核因子κB(NF-κB)通路所诱导；第二种启动信号是由一系列病原相关分子模式和损伤相关分子模式所激活。目前，关于第一种启动信号的激活途径研究较多，其作用机制相对清楚。第二种启动信号的作用途径如下:细胞外ATP结合至细胞表面的P₂X₇受体，打开其控制的离子通道，激活下游的NLRP3炎症小体。NLRP3炎症小体被激活后，可招募ASC和Pro-Caspase-1，促使自身寡聚化，引起Pro-Caspase-1自我剪切活化，进而裂解pro-IL-1β，pro-IL-18形成成熟的IL-1β，IL-18，从而发挥炎症效应。NLRP3炎症小体如果被过度激活，过量释放的IL-1β和IL-18等细胞因子以及所产生的炎症瀑布式反应将会对机体产生致命性损害。因此，NLRP3炎症小体的激活必须准确地控制和调节。炎症小体作为固有免疫的重要组成部分，其异常活化和功能失调与多种获得性炎性疾病和自身免疫病的病理过程密切相关目前研究发现，溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病、2型糖尿病、骨性关节炎、腹膜炎、急性肺损伤、动脉粥样硬化、痛风性关节炎、非酒精性脂肪性肝炎等都与炎症小体的异常活化密切相关。

目前在治疗获得性炎性疾病和自身免疫病方面，并未有相关靶向NLRP3炎症小体药物的临床应用，因此开发炎症小体抑制剂，抑制炎症小体的异常活化，将有利于上述疾病的治疗并为其提供新的治疗途径。

发明内容

本发明公开了一类倍半萜化合物新的作用机制以及新的适应症，提供了一类倍半萜类化合物的药物新用途。

金粟兰内酯B的应用为如下(a)或(b)：

(a)在制备NLRP3炎症小体抑制剂中的应用；

(b)在抑制NLRP3炎症小体致病性疾病中的应用。

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

本发明的乌药烷型化合物自草珊瑚中提取、分离、纯化与衍生化得到，名为Chloranthalactone B(金粟兰内酯B)，分子式C₁₅H₁₆O₃，分子量244.29，白色粉末，溶于甲醇，DMSO。本发明保护金粟兰内脂B，如下图所示。

金粟兰内酯B的提取分离流程：草珊瑚干燥粉碎，95％乙醇回流提取4次/3h，浓缩得浸膏。水悬浮后石油醚脱脂，二氯甲烷萃取，浓缩后二氯甲烷层浸膏经HW-40C凝胶分离得四部分：A-D。其中C段经MCI柱分离，金粟兰内酯B由70％甲醇/水冲出，如图1所示。

本发明人发现金粟兰内酯B可以抑制LPS和ATP、尼日利亚菌素、尿酸钠结晶分别联用刺激地NLRP3炎症小体的激活，能够显著抑制炎症小体的活化，可用于制备相关疾病的药物。

金粟兰内酯B制备的炎症小体抑制剂可作为抑制炎症小体活化的抑制剂或者炎症小体异常活化的抑制剂。

本发明提供了金粟兰内酯B作为炎症小体抑制剂的用途，或者，金粟兰内酯B作为NLRP3炎症小体活化抑制剂的用途。

金粟兰内酯B的应用为如下(1)或(2)：

(1)在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的产品中的应用；

(2)在预防或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病中的应用。

所述产品为药物或者药物制剂。

所述炎症小体异常活化相关疾病包括但不限于：所述炎症小体异常活化相关疾病包括但不限于：急性肺炎；急，慢性肾炎；关节炎，如风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎，骨性关节炎；二型糖尿病；感染性炎症性疾病，如感染休克、脓毒症、腹膜炎等；非酒精性肝炎；神经性疾病及脑损伤，包括多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏症；遗传性Cryopyrin相关周期性发热综合征等。

金粟兰内酯B在如下(1)-(8)中任一所述的应用：

(1)在抑制白细胞介素-1β分泌和/或表达中的应用；

(2)在制备抑制白细胞介素-1β分泌和/或表达的产品中的应用；

(3)在抑制半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-1p20蛋白的活性中的应用；

(4)在制备抑制半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-1p20蛋白活性的产品中的应用；

(5)在制备抑制凋亡相关斑点样蛋白多聚化的产品中的应用；

(6)在抑制凋亡相关斑点样蛋白多聚化中的应用；

(7)在制备抑制NLRP3炎症小体组装的产品中的应用；

(8)在抑制NLRP3炎症小体组装的应用。

一种产品，其活性成分为金粟兰内酯B。

所述产品具有下述至少一种功效：

1)抑制炎症小体激活或者异常活化；

2)预防和/或治疗炎症小体异常活化相关疾病；

3)抑制半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-1p20蛋白活性；

4)抑制白细胞介素-1β分泌或表达；

5)抑制凋亡相关斑点样蛋白ASC低聚化；

6)抑制白细胞介素-18的分泌或表达

7)抑制NLRP3炎症小体组装。

本发明所述产品除含有金粟兰内酯B外，还可含有适宜的载体或赋形剂，以及包含其他起配伍协同作用的有效成分。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬酯酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料，或者其他材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。

有益效果

本发明发现金粟兰内酯B为NLRP3炎症小体的抑制剂。

尽管文献报道金粟兰内酯B能够对LPS诱导的RAW 264.7细胞的NO的表达具有一定的抑制效果，但是没有涉及炎症小体方面的应用。一氧化氮(NO)是人体内产生的气体小分子，其性质不稳定，是人体内重要的化学信使分子和生理递质，与机体多个系统的生理功能关系密切，能够加剧炎症反应以及促进免疫的激活。NO是由胍基氮原子和分子氧在NO合酶(NOSs)催化下反应生成的。在不同的细胞类型中，至少有三种不同形式的NOS表达:神经元(nNOS或NOS1)和内皮(eNOS或NOS3)的NOS产生低水平的NO，而诱导型NOS(iNOS或NOS2)被多种免疫刺激如IFN-γ、TNF-α和LPS激活，并产生高水平的NO。过量的NO可以通过NF-κB/MAPK信号通路加剧炎症作用，也可以促进ROS的释放诱发神经炎症。Cell Research杂志有文献报道，过量的一氧化氮能够抑制NLRP3炎症小体激活，NO可能是一系列由NLRP3炎症小体异常激活引起的疾病的内在负调控因子，也就是说NLRP3炎症小体与NO的抑制活性存在相反的关系。NO能够通过稳定巨噬细胞内线粒体，负向调节NLRP3炎症小体的激活脂多糖诱导体内感染性休克。所以，化合物对NO的抑制作用和对NLRP3的抑制作用没有本质关系。例如冬凌草甲素，作为NLRP3炎症小体抑制剂时的作用浓度对NO的表达与释放无明显影响。另外根据上述记载金粟兰内酯B作为NO抑制剂不能推测为金粟兰内酯B为NLRP3炎症小体激活剂。而事实上，本发明发现金粟兰内酯B的NLRP3炎症小体抑制剂。

此外NO信号通路与冠心病，帕金森症，神经性细胞损伤，稳定性心绞痛相关。而炎症小体作为固有免疫的重要组成部分，其异常活化和功能失调与多种获得性炎性疾病和自身免疫病的病理过程密切相关目前研究发现，溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病、2型糖尿病、骨性关节炎、腹膜炎、急性肺损伤、动脉粥样硬化、痛风性关节炎、非酒精性脂肪性肝炎等都与炎症小体的异常活化密切相关。

因此NO信号通路与炎症小体尽管在炎症方面有相同的地方，但化合物作用于信号通路的复杂性，信号通路对应病症显著不同，故金粟兰内酯B为NO抑制剂不足以推导出作为炎症小体的抑制剂。

本发明提供了化合物金粟兰内酯B制备抗炎药物的应用。体外抗炎实验表明，金粟兰内酯B可以抑制LPS启动，ATP、尼日利亚菌素、尿酸钠结晶分别刺激地NLRP3炎症小体的激活，对IL-1β的表达与释放具有显著的抑制作用。安全性好，在100μM以下没有明显细胞毒，对IL-1β释放的抑制作用良好。在体内水平，金粟兰内酯B能够明显改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤，显著改善肺泡壁的水肿与肺泡塌陷。显著降低血清中IL-1β、TNF-α、IL-6炎症因子的表达。金粟兰内酯B能够缓解Cis诱导的急性肾损伤，降低血清尿素氮与肌酐的表达。同时金粟兰内酯B能够缓解腺嘌呤诱导的慢性肾炎，降低血清尿素氮与肌酐的表达，降低肾组织中Caspase-1的表达。以上结果说明在体内外都具有较好的抗炎作用，且急毒实验表明，金粟兰内酯B具有良好的安全性，可作为具有抗炎作用的新药成分或者先导化合物。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1金粟兰内酯B分离流程。

图2显示的是金粟兰内酯B剂量依赖性抑制LPS/ATP诱导IL-1β分泌结果。

图3显示的是金粟兰内酯B剂量依赖性抑制LPS/ATP诱导的NLRP3炎症小体IL-18分泌的效果

图4显示的是金粟兰内酯B剂量依赖性抑制LPS/ATP诱导的NLRP3炎症小体Caspase-1分泌的效果。

图5显示的是金粟兰内酯B剂量依赖性抑制LPS/ATP诱导的NLRP3炎症小体Capase-1的前体(Pro-Caspase-1)以及IL-1β的前体(Pro-IL-1β)的剪切作用。

图6显示的是本发明中金粟兰内酯B剂量依赖性抑制不同NLRP3炎症小体激动剂诱导的IL-1β，Caspase-1的表达，以及Capase-1的前体(Pro-Caspase-1)以及IL-1β的前体(Pro-IL-1β)的剪切作用。

图7显示的是金粟兰内酯B剂量依赖性抑制不同NLRP3炎症小体激动剂尿酸钠，尼日利亚菌素诱导的Caspase-1的表达(A)，MSU诱导诱导的Caspase-1的表达(B)；

图8显示的是金粟兰内酯B特异性抑制ASC寡聚化的Western blot检测；

图9显示的是金粟兰内酯B可以显著降低LPS诱导的小鼠急性肺损伤肺泡灌洗液中IL-1β的分泌；

图10显示的是金粟兰内酯B可以显著降低LPS诱导的小鼠急性肺损伤肺水肿的程度；

图11显示的是金粟兰内酯B可以显著降低LPS诱导的小鼠急性肺损伤MPO水平

图12显示的是金粟兰内酯B可以显著降低顺铂诱导的小鼠急性肾损伤尿素氮的释放；

图13显示的是金粟兰内酯B可以显著降低顺铂诱导的小鼠急性肾损伤肌酐的表达；

图14显示的是金粟兰内酯B可以显著降低顺铂诱导的小鼠急性肾损伤血清IL-1β的水平

图15显示的是金粟兰内酯B可以显著降低顺铂诱导的小鼠急性肾损伤的肾损伤评分；

图16显示的是金粟兰内酯B可以显著降低腺嘌呤诱导的慢性肾炎小鼠尿素氮释放；

图17显示的是金粟兰内酯B可以显著降低腺嘌呤诱导的慢性肾炎小鼠肌酐的释放；

图18显示的是金粟兰内酯B可以显著降低腺嘌呤诱导的慢性肾炎小鼠尿蛋白水平；

图19显示的是金粟兰内酯B可以显著降低腺嘌呤诱导的慢性肾炎小鼠MDA水平；

图20显示的是金粟兰内酯B可以显著降低腺嘌呤诱导的慢性肾炎小鼠肾系数和血清的总SOD水平；

图21显示的是金粟兰内酯B治疗腺嘌呤诱导的慢性肾炎肾组织的HE染色，

图22显示的是金粟兰内酯B对肾组织中Caspase-1表达的影响和对血清中IL-1β的影响；电泳结果(A)和统计结果(B)；

图23显示的是金粟兰内酯B在小鼠急毒实验中的死亡情况，金粟兰内酯B在200-400mg/kg剂量下小鼠的死亡率以及体重变化情况；

图24为金粟兰内酯B的氢谱

图25为金粟兰内酯B的碳谱

图26为金粟兰内酯B的质谱

其中缩写指代

LPS:脂多糖

ATP：三磷酸腺苷

IL-1β：白细胞介素-1β

ASC：凋亡斑点样蛋白

Casapse-1：半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-1

HE染色：苏木精-伊红染色法

MPO:髓过氧化物酶

MDA：丙二醛

SOD:超氧化物歧化酶。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述实施例中所使用的相关材料如下所示：

1、药物

金粟兰内酯B是从草珊瑚中直接分离得到；顺铂、LPS购自美国Sigma公司，腺嘌呤购买时阿拉丁化学试剂公司。

Chloranthalactone B(IV):白色粉末；

HR-ESI-MS:m/z 267.0991(C₁₅H₁₆O₃Na)；

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ_H 1.71(td,J＝8.0,3.6Hz,H-1),0.97(ddd,J＝9.1,8.0,5.5Hz,H-2a),0.84(dt,J＝5.5,3.6Hz,H-2b),1.99(m,H-3),3.38(ddt,J＝13.0,5.1,2.0Hz,H-5),2.55(ddq,J＝19.0,5.1,2.0Hz,H-6a),2.11(ddq,J＝19.0,13.0,2.0Hz,H-6b),4.18(s,H-9),1.89(s,H-13),0.64(s,H-14),5.03(s,H-15a),4.70(s,H-15b)；

¹³C NMR(125MHz,CDCl₃):δ_C 24.0(C-1),16.9(C-2),23.1(C-3),150.0(C-4),50.7(C-5),21.4(C-6),152.5(C-7),88.0(C-8),64.6(C-9),41.4(C-10),129.2(C-11),170.5(C-12),9.1(C-13),17.1(C-14),106.9(C-15).见图24-26

2、试剂、材料

DMEM培养基(Hyclone)；胎牛血清(南京海星利BI)；胰蛋白酶、双抗(青霉素-链霉素溶液)；三磷酸腺苷(ATP)、尼日利亚菌素(Nig)、尿酸钠(MSU)(美国Sigma Aldrich公司)；NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-Caspase-1、pro-IL1β、GAPDH抗体(美国Cell SignalingTechnology公司)；Caspase-1ELISA检测试剂盒(美国CD公司)；IL-1βELISA检测试剂盒(福麦斯生物技术有限公司)；5×SDS蛋白电泳上样缓冲液、双色预染蛋白Marker(南京雅酶有限公司)；电泳液转印液、10×TBST缓冲液、CCK-8试剂盒、考马斯亮蓝和NP-40裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；增强型ECL显色液(上海翊圣生物科技有限公司)、PVDF膜(美国Millipore公司)。

实施例1、本实施例用于说明金粟兰内酯B能明显抑制ATP/尼日利亚菌素/尿酸钠诱导的NLRP3炎症小体活化后IL-1β的加工成熟及释放。

1.1小鼠原代骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)的培养和分化。

取10-12周龄的C57BL/6雄性小鼠,脱臼处死后在超净台分离小鼠的肱骨和股骨,用10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及1％双抗的DMEM培养基重悬细胞，红细胞裂解，反复抽取,骨髓细胞并按1：4000加入小鼠集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor,MCSF)。按1×10⁶个/ml接种细胞(12孔板，1ml/孔)，细胞培养7天后获得BMDMs细胞。

1.2利用BMDM细胞构建NLRP3炎症小体活化模型

取上述分离培养好的BMDMs，采取换液加药的方式，将培养基替换成含有LPS(1μg/mL)的DMEM培养基，LPS预处理6h后，撤除LPS刺激，用不同浓度的金粟兰内酯B(12.5μM，25μM，50μM)处理1h后，再以补液方式分别加入NLRP3炎症小体激活剂2.5mMATP刺激30min，刺激时间结束后收取细胞上清液，采用ELISA检测试剂盒检测上清液中的IL-1β、IL-18和Casapse-1的含量。

1.3样品处理

重复上述步骤1.2，收集细胞培养上清液及细胞裂解液，细胞培养上清液，3800rpm离心5min收上清弃去沉淀，加入1/4体积三氯乙酸(TCA)，冰上孵育3-5h后，4℃，14000rpm离心10min；弃上清，加冰的丙酮(500μL/孔)上下颠倒混匀重复洗3次，直至三氯乙酸尽除，4℃，14000rpm离心15min；弃上清，挥干丙酮，待丙酮挥发后加1×Loading buffer 40μL振荡混匀，水浴煮沸，冷却后作为上清样品。

贴壁细胞收集后用NP-40裂解裂解30min，然后超声破碎细胞，4℃，12000rpm离心10min后取上清即为细胞裂解液，BCA法测定蛋白浓度，加2×Loading buffer振荡混匀，水浴煮沸，冷却后作为细胞裂解液样品。

1.4 ELISA测定细胞上清液中IL-1β、IL-18和Casapse-1的含量测定细胞上清液中IL-1β，IL-18的含量，操作步骤按说明书进行。

①从平衡至室温的密封袋中取出PVC透明微量滴定板(96板)，确定需要的孔数，未使用的板条放回铝箔袋，重新封口；

②分别将不同浓度的标准品500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.81、3.91pg/ml，处理好的细胞上清样品和标准品加入相应孔中，用封板膜封住反应孔，在37℃条件下孵育90min；

③倒掉板内液体，加入适量的洗涤液，静置一分钟，将板内的液体拍干。重复洗板4次；

④将稀释100倍的IL-1β生物素加入孔内，用封板膜封住反应孔，在37℃条件下孵育60min；

⑤重复第c步洗板操作；

⑥将稀释100倍的IL-1β浓缩酶加入孔内用封板膜封住反应孔，在37℃条件下孵育30min；

⑦重复第c步洗板操作；

⑧在每个微孔内加入IL-1β显色液，在37℃条件下孵育20min(注意避光)，孔内颜色由无色变为蓝色；

⑨在每个微孔内加入IL-1β终止液，孔内颜色变黄；

⑩在450波长处测定OD值，设定570nm作为校正波长；计算结果，根据标准孔的OD值绘制线性标准曲线，把样品的OD值带入标准曲线得到IL-1β浓度。计算浓度时乘以稀释倍数。

1.5 Western blot测定NLRP3炎症小体相关蛋白的表达

Western blot测定：检测上清中IL-1β、Caspase-1蛋白表达水平，检测细胞裂解液中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和pro-IL-1β蛋白水平。

细胞上清蛋白样品采用12.5％浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，细胞裂解液样品采用10％浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接通电源，设定恒定电压80V，45min后电压改为120V，溴酚蓝到达分离胶底部时，结束电泳，安装转印装置。接通电源，设定恒定电压，100V，1h。转膜后，在5％脱脂奶中室温封闭1h，caspase-1(p20)，IL-1β，pro-caspase-1(p45)，pro-IL-1β，ASC，NLRP3，GAPDH(抗体缓冲液)抗体(1:1000)4℃摇床孵育过夜，PVDF膜TBST溶液间隔5min洗膜3次，再与相应标记的鼠或兔来源的二抗(1：10000，按照试剂说明书)溶液进行反应1h，弃二抗，用1％TBST溶液间隔5min洗膜3次，将显影液A和B两种试剂等体积混合后，立即加到膜上，用ChemiDOC XRS+凝胶成像系统拍照显影。

取上述分离培养好的BMDMs，采取换液的方式，培养基替换成含有LPS(1μg/mL)的DMEM培养基，LPS预处理6h后，撤除LPS刺激，用不同浓度的金粟兰内酯B(12.5μM，25μM，50μM)处理1h后，再以补液方式分别加入NLRP3炎症小体激活剂2.5μM尼日利亚菌素刺激30min或者尿酸钠(200μg/mL)刺激4h，刺激时间结束后收取细胞上清液，采用ELISA检测试剂盒检测上清液中的IL-1β，Western blot方法检测上清蛋白和细胞蛋白。结果如图7-8所示，金粟兰内酯B能够显著抑制尼日利亚菌素或尿酸钠诱导的NLRP3炎症小体的激活。

所有实验至少重复3次。实验数据采用Excel和Graph Pad Prism 5.0(Graph PadSoftware，San Diego，CA，USA)进行分析计算。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)对各组间的差异进行分析，结果统计用数据平均值加减标准差(means±S.D.表示。当P值<0.05为有统计学意义，具有显著性差异。

结果如图2，3，4所示，金粟兰内酯B能够显著降低IL-1β、IL-18和Caspase-1的释放；

结果如图5所示，金粟兰内酯B能够显著降低IL-1β和Caspase-1的释放，但是对Pro-Caspase-1和IL-1β的表达无明显影响。

结果如图6所示，本发明中金粟兰内酯B剂量依赖性抑制不同NLRP3炎症小体激动剂尿酸钠,尼日利亚菌素诱导的IL-1β和Caspase-1的释放，但是对Pro-Caspase-1和IL-1β的表达无明显影响。

图7显示的是本发明中金粟兰内酯B抑制尼日利亚菌素，尿酸钠诱导的Caspase-1的释放；

实施例2、本实施例用于说明金粟兰内酯B抑制ASC多聚化。

将BMDM细胞接种在12孔板中(密度为1×10⁶/孔)，过夜后，加入不同浓度金粟兰内酯B作用1h，1μg/ml LPS诱导6h，再加入NLRP3炎症小体刺激因子作用相应时间。吸弃上清液，每孔加入500μL NP-40裂解液，静置15min后，6000×g离心15min，吸弃上清，加入预冷的PBS洗涤两次，然后重悬于500μL的PBS，直接加入辛二酸双酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)，使其终浓度为2mM，37℃下反应30min。随后6000×g离心15min，去上清液后，加入30μL的2×电泳上样缓冲液，煮沸10min，经上述处理后的蛋白，用免疫印迹方法检测。

结果如图8，结果表明金粟兰内酯B抑制NLRP3炎症小体活化引起ASC寡聚化。

实施例3、本实施例用于说明金粟兰内酯B缓解LPS诱导的小鼠急性肺损伤。

选取六周的C57BL/6雄性小鼠，40只，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司南京分公司。在实验室适应性饲养一周后，随机分为5组，分别空白对照组、LPS模型组、金粟兰内酯B治疗组(25mg/kg)、金粟兰内酯B治疗组(50mg/kg)和阳性药地塞米松(10mg/kg)。适应性喂养一周后，空白组和模型组腹腔注射10％DMSO，5％吐温80和85％生理盐水，给药组和阳性药组溶解于腹腔注射10％DMSO，5％吐温80和85％生理盐水的药物，1h后，模型组、给药组和阳性药组气管滴注LPS(5mg/kg)，空白组滴注等体积的生理盐水。24h后摘眼球取血，检测血清中的炎症因子。取肺泡灌洗液，检测肺泡灌洗液中的炎症因子，中性粒细胞以及巨噬细胞个数和MPO含量。取肺组织检测肺的湿干重比值，HE染色观察肺部损伤情况。

结果如图9-11所示，图9结果表明金粟兰内酯B能够显著降低肺泡灌洗液中的IL-1β的表达与释放。图10-11表明金粟兰内酯B能够降低肺的湿干重比，缓解肺水肿。同时通过降低MPO的产生缓解肺损伤。

实施例4、本实施例用于说明金粟兰内酯B缓解顺铂诱导的小鼠急性肾损伤。

选取六周的C57BL/6雄性小鼠，40只，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司南京分公司。在实验室适应性饲养一周后，随机分为4组，分别空白对照组、LPS模型组、金粟兰内酯B治疗组(25mg/kg)、金粟兰内酯B治疗组(50mg/kg)。适应性喂养一周后，模型组和给药组腹腔注射顺铂20mg/kg，空白对照组腹腔注射相同体积的生理盐水。24h后空白组和模型组腹腔注射溶剂(2％DMSO，10％吐温80，30％PEG300和58％生理盐水)，给药组腹腔注射25mg/kg,50mg/kg(溶于2％DMSO，10％吐温80，30％PEG300和58％生理盐水)的药物，连续腹腔注射给药三天后摘眼球取血，检测血清中的肌酐、尿素氮和IL-1β的含量。取肾脏做病理切片，HE染色检测肾小管损伤并评分计算损伤分数。

结果如图12-15所示。表明金粟兰内酯B能够降低顺铂诱导的肾损伤，降低血清肌酐和尿素氮的含量，缓解肾脏组织损伤。

实施例5本实施例用于说明金粟兰内酯B对慢性肾炎的治疗作用。

选取六周的C57BL/6小鼠，雄性，45只，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司南京分公司。在实验室适应性饲养一周后，C57BL/6小鼠，随机分为空白组(9只)与造模组(36只)，造模组小鼠采用腺嘌呤(80mg/kg)连续灌胃7d，取尿蛋白含量明显升高的造模小鼠，并将其随机分为模型组，二个给药组，一个地塞米松阳性药组，每组8只。给药组腹腔注射不同剂量的金粟兰内酯B(溶于2％DMSO，10％吐温80，30％PEG300和58％生理盐水)，空白组腹腔注射相同体积的溶媒，阳性药组注射5mg/kg的地塞米松。检测指标如下：

肾系数：肾系数＝双侧肾脏质量/小鼠体质量

尿蛋白(CBB法)：收集尿液检测不同时间点的尿蛋白。

血液生化指标：给药3周末处死小鼠，采血测定血清BUN、肌酐(CRE)、MDA、SOD值。肾组织病理学观察：取血后摘取肾组织，称重，包埋，切片，HE染色，病理分析。

结果如图16-22所示。金粟兰内酯B能够显著降低肌酐，尿素氮等血液生化指标水平，降低肾系数。HE结果显示金粟兰内酯B能够显著改善肾脏的空泡化和细胞核固缩。说明金粟兰内酯B对慢性肾炎具有很好的缓解改善作用。

实施例6本实施例用于说明金粟兰内酯B对小鼠的急性毒性。

选取六周的C57BL/6小鼠，雌雄各半36只，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司南京分公司。在实验室适应性饲养一周后，随机分为3组，分别是空白对照组、金粟兰内酯B组(200mg/kg)、金粟兰内酯B组(400mg/kg)。适应性喂养一周后，给药组腹腔注射不同剂量的金粟兰内酯B(溶于10％DMSO，10％吐温80，30％PEG300和50％生理盐水),空白组腹腔注射相同体积的10％DMSO，10％吐温80，30％PEG300和58％生理盐水。观察7天，记录体重，死亡率。

结果如图23所示。小鼠无一例死亡，说明金粟兰内酯B具有良好的安全性。

Claims (5)

1.金粟兰内酯B在制备NLRP3炎症小体抑制剂中的应用，其中金粟兰内酯B的结构式如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用为制备治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述炎症小体异常活化相关疾病包括：急性肺炎；急，慢性肾炎；关节炎，如风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎，骨性关节炎；二型糖尿病；感染性炎症性疾病，如感染休克、脓毒症、腹膜炎；非酒精性肝炎；神经性疾病及脑损伤，包括多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏症；遗传性Cryopyrin相关周期性发热综合征。

4.一种药物组合物，其活性成分为权利要求1所述的金粟兰内酯B药学可接受的辅料。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述组合物形成药物制剂为片剂，胶囊，缓释剂，栓剂，注射剂，颗粒剂，丸剂，气雾剂、吸入剂，洗剂，涂膜剂，软膏剂、透皮贴膏，滴眼剂，口腔膜剂，舌下片剂，含漱剂等。

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