CN113813233B - 一种治疗类风湿关节炎的靶向脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药制剂领域，尤其涉及一种治疗类风湿关节炎的雷公藤甲素靶向脂质体及其制备方法。所述长循环靶向脂质体由雷公藤甲素，膜材以及靶向配体组成。本发明提供的雷公藤甲素长循环靶向脂质体及其制备方法，脂质体经过DSPE‑PEG2000、DSPE‑PEG2000‑FA修饰，得到了一种全新的靶向脂质体，该靶向脂质体能够使药物靶向炎症部位；雷公藤甲素包封于类生物膜的疏水性双分子层中，从而更好发挥免疫抑制、抗炎、保护软骨组织的作用。本发明为类风湿性关节炎的治疗提供了一个新的对策，具有重要的理论意义与临床意义。

Description

一种治疗类风湿关节炎的靶向脂质体及其制备方法
技术领域
本发明属于医药制剂领域，尤其涉及一种治疗类风湿关节炎的雷公藤甲素靶向脂质体及其制备方法。
背景技术
类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一种以关节受累的自身免疫性疾病，其发病人数占总人口的近1%。RA在全球分布广泛，可于任何年龄发病，女性病人的数量是男性病人的2-3倍。RA其在中医上属于“弊证”，它以关节软骨糜烂和损伤、滑膜细胞增生和骨破坏为特征，该病的主要临床特征为侵蚀性、对称性的关节炎，其中双手、腕、膝、踝和足关节的受累最为常见。RA发病过程中还容易伴有心血管疾病、呼吸系统疾病、肾功能不全等并发症。类风湿关节炎的病因十分复杂，主要包括遗传、吸烟、微生物感染、激素刺激、寒冷刺激、饮食等。目前广泛用于RA的药物包括非甾体类抗炎药（NSAIDs）、减病抗风湿药（DMARDs）及糖皮质激素（GCs）等，这些药物的使用可改善RA的症状和发病进程，但常伴有严重的毒副反应。因此，RA的治疗迫切需要一种更安全的方式，随着中医药治疗RA的研究不断取得突破，中医药治疗RA的疗效显著，副作用少，受到越来越多的关注。
雷公藤甲素（Triptolide, TP）又称雷公藤内酯醇，是一种从雷公藤中分离出来的有效的免疫抑制化合物，雷公藤甲素（TP）具有多种生物活性，如抗炎、抗增殖、免疫抑制、抗肿瘤和保护软骨基质等，被用于治疗RA、免疫复合物肾炎、系统性红斑狼疮和器官组织移植等炎症性和自身免疫性疾病。研究发现TP对于治疗缓解RA病症有多方面的作用：可以促进滑膜成纤维细胞的调亡，抑制一些关键的炎症相关的细胞因子，可以抑制破骨细胞的分化和骨吸收，起到防止骨破坏的功能，增加骨保护素的表达，减少骨破坏，起到软骨保护的作用等。然而，TP的溶解度较差，全身性毒副作用严重，药代动力学半衰期短，导致其抗RA作用尚未在临床上得到充分发挥。脂质体是一种将药物包载在类生物膜而形成的微粒。脂质体制备简便、成本低，且具有提高生物相容性、改善生物降解性、降低药物毒性、缓释性等多种优点，利用脂质体担载雷公藤甲素可以改善其生物利用度，且可以使得药物具有一定的靶向性。
叶酸是一种维生素，是所有分裂细胞存活和增殖的必要成分。RA患者激活的滑膜巨噬细胞具有功能性活性的FR-β，而且FR-βmRNA的表达比正常人更为丰富，叶酸能够特异性地与活化的FR-β结合。将叶酸修饰到雷公藤甲素脂质体，用于靶向巨噬细胞，可以更安全、更有效地治疗RA。在这个靶向脂质体中，叶酸与DSPE-PEG2000（二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇）偶联用于修饰脂质体表面，靶向炎症部位；雷公藤甲素被包封于类生物膜的双分子层中，从而更好发挥免疫抑制、抗炎、保护软骨组织的作用。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于发明一种叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体及其制备方法，能够使得药物靶向类风湿性关节炎的病变部位，从而增加药物在病变部位的浓度，提高药物的利用度，提高治疗效果。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体，其特征在于，所述长循环靶向脂质体由雷公藤甲素，膜材以及靶向配体组成。
进一步地，所述长循环靶向脂质体为磷脂双分子层疏水结构，包载雷公藤甲素于双分子层疏水结构中。
进一步地，所述的膜材包括蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇；所述的靶向配体为二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-叶酸。
进一步地，所述长循环脂质体经过叶酸的修饰具有增加脂质体在体内的循环时间及病变部位的靶向性的作用；所述雷公藤甲素包封于磷脂双分子层疏水结构中具有免疫抑制、抗炎、保护软骨组织的作用。
进一步地，所述长循环脂质体在制备在用于治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
本发明还提供一种根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、将FA、DCC、NHS按比例溶解于二甲基亚砜中进行酰基化反应，将反应产物以8000-12000 r/min离心20-30min，离心1-5次，离心所得上清液移到新的离心管中后加入溶液A混匀，再次采用上述条件离心，获得黄色固体；然后将上述黄色固体用溶液A重悬后采用上述离心条件离心进行洗涤，洗涤1-5次，最后一次离心所得固体产物真空干燥，得到FA-NHS；
步骤2、将步骤1所得的FA-NHS与DSPE-PEG-NH2和吡啶按比例在DMSO溶剂中反应，将所得反应产物在隔膜泵中真空放置，除去吡啶，制得混合物A；然后将所得混合物A在蒸馏水中透析，最终得到的靶向配体DSPE-PEG-FA；
步骤3、将步骤2所得的靶向配体DSPE-PEG-FA与蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和雷公藤甲素溶解于甲醇溶剂中，得到混合物B；所得的混合物B在40℃水浴中旋转蒸发，通过薄膜分散法制得脂质膜；然后将所得脂质膜用1-10 mL PBS水溶液充分水化，得到水化液；将所得水化液置超声细胞捣碎机中进行超声；将所得超声产物用聚碳酸酯膜过滤两次，即得叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体。
进一步地，所述步骤1中FA、DCC和NHS的物质的量之比为（0.2-2）:（0.5-4）:(0.2-3）；所述酰基化反应的温度为15℃-50℃，反应的时间为2h-6h；所述干燥条件为30-80℃下真空过夜干燥。
进一步地，所述所述步骤1中溶液A为体积比为7:3的0℃-10℃的无水乙醚和丙酮的混合液。
进一步地，所述步骤2中FA-NHS与DSPE-PEG-NH2物质的量之比为（1-3）:（0.3-3）；所述反应条件为5℃-50℃温度下反应10h-48h；所述真空条件为30-90℃；所述透析截留分子量为25000Da，透析12-60 h。
进一步地，所述步骤3中EPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-FA、TP的物质的量之比为(80-120)：(22-40)：(0.3-1.5)：(0.3-1.5)：(3-8)；所述超声功率为100-700W，超声1-50 min；所述聚碳酸酯膜的孔径为0.22 μm。
与现有技术相比本发明的有益效果。
（1）本发明将叶酸修饰到雷公藤甲素脂质体，用于靶向巨噬细胞，可以更安全、更有效地治疗RA。
（2）本发明的靶向脂质体中，叶酸与DSPE-PEG2000（二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇）偶联用于修饰脂质体表面，靶向炎症部位，与未修饰的脂质体相比，叶酸修饰的脂质体有更理想的主动靶向作用，使得脂质体递送药物的准确性提高，运送药物到达靶标部位进行释放，更好的发挥作用。
（3）本发明中通过靶向聚合物制备的靶向脂质体，脂质体作为载药体系，一方面解决了药物溶解性的问题，将雷公藤甲素包封于脂质体的疏水层中，由其运送到细胞内发挥作用；另一个方面可以实现药物缓释，经过脂质体包载后，药物是以缓慢而连续的形式进行释放，增加了在体内的循环时间，从而起到了有效的治疗作用；第三方面降低了雷公藤甲素的毒性，从而更好发挥免疫抑制、抗炎、保护软骨组织的作用。本发明为类风湿性关节炎的治疗提供了一个新的对策，具有重要的理论意义与临床意义。
附图说明
图1为本发明雷公藤甲素TP长循环靶向脂质体示意图。
图2为DSPE-PEG2000-NH2的MALDI-TOF-MS图谱。
图3为靶向配体DSPE-PEG2000-FA的MALDI-TOF-MS图谱。
图4为雷公藤甲素长循环靶向脂质体的透射电镜照片。
图5为雷公藤甲素长循环靶向脂质体的原子力显微镜二维照片。
图6为雷公藤甲素长循环靶向脂质体的原子力显微镜三维照片。
图7为雷公藤甲素长循环靶向脂质体的的粒径分布图。
图8为雷公藤甲素长循环靶向脂质体的Zeta电位图。
图9为不同剂型的雷公藤甲素对小鼠单核巨噬细胞RAW的体外存活率影响的测定结果。
图10为不同剂型的雷公藤甲素对小鼠单核巨噬细胞RAW的细胞凋亡的测定结果。
图11为流式细胞仪测定LPS处理的小鼠单核巨噬细胞RAW摄取脂质体的情况。
图12为激光共聚焦显微镜共定位测定LPS处理的小鼠单核巨噬细胞RAW摄取叶酸修饰的靶向脂质体的情况。
图13为不同剂型的雷公藤甲素对LPS处理的小鼠单核巨噬细胞RAW中炎症因子的影响的测定结果。
图14为不同剂型的雷公藤甲素对RAW264.7细胞向破骨细胞转化的影响的测定结果。
图15为药物在CIA大鼠活体状态下的组织分布情况。
图16为药物对CIA大鼠关节炎治疗的评分指数情况。
图17为药物对CIA大鼠关节炎治疗的足爪肿胀程度。
图18为CIA大鼠治疗后的软骨组织HE染色情况。
图19为CIA大鼠治疗后的软骨组织TRAP染色情况。
图20为CIA大鼠治疗后的软骨组织免疫组织化学染色情况。
图21为CIA大鼠治疗后血清炎症因子的测定情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例具体阐述所述的叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体治疗类风湿性关节炎的应用，但不限于以下实施方式。本发明具体实施例中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售普通的公知原料途径而获得。
一、实验仪器与材料
1.1实验仪器：DZKW-S-4电热恒温水浴锅（上海医疗器械公司医疗器械五厂）；JY92-IIN型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SG3300H型超声波清洗器（上海冠特超声仪器公司）；RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；XS105型十万分之一天平（Mettler Toledo）；Ti-S型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；HBS-1096A型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；20AT型液相色谱仪（UV检测器，岛津色谱工作站，日本岛津）；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm，上海月旭）。葡聚糖凝胶柱（Sephadex G-50，上海华蓝化学科技有限公司）；MD44透析袋（北京索莱宝科技有限公司，截留分子量12000-14000）；聚碳酸酯膜（美国Milipore有限公司）；激光散射粒径测定仪（Malvern Zetasizer 3000HS）（英国Malvern instruments公司）；JEM-2000EX透射电子显微镜（日本电子有限公司）；SPI3800N series SPA-400型原子力显微镜（日本NSK有限公司）；SW-CJ-1D单人净化工作台（上海苏净实业有限公司）；气套式二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo Flesher Scientific(Asheville) LLC）；流式细胞仪（美国BD公司）；多光谱活体成像系统（美国CarestreamHealth，Inc.）；RM2235型石蜡切片机（德国莱卡公司）。
1.2 实验材料：TP（成都普菲德生物技术有限公司，纯度98.94%）；叶酸（大连美仑生物技术有限公司）；卵磷脂、胆固醇（美国Avanti Polar Lipids公司）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-胺（日本NOF公司）；鸡 II型胶原、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（美国Sigma公司）；RANKL（美国PEPROTECH公司）；M-CSF（大连美仑生物技术有限公司）；IL-1β、TNF-α及IL-6 ELISA试剂盒（北京索莱宝生物有限公司）；TRAP染色试剂盒（北京索莱宝生物有限公司）；细胞凋亡试剂盒（大连美仑生物技术有限公司）；MMP-2抗体、MMP-9抗体·（美国Abcam公司）；其余试剂均为分析纯，水为纯净水。
实施例1脂质体的制备。
1.靶向配体DSPE-PEG2000-FA的制备。
将FA、二环己基碳二亚胺（DCC）和NHS，物质的量之比为（0.2-2）:（0.5-4）:（0.2-3）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。在15℃-50℃下作用2h-6h，然后离心两次。上清液用0℃-10℃的无水乙醚和丙酮（7:3，v/v）快速转移到离心管中，离心以获得黄色固体。将初步产物洗涤两次并干燥过夜，得FA-NHS。将FA-NHS、DSPE-PEG-NH2、吡啶在室温下溶解于DMSO中，FA-NHS与DSPE-PEG-NH2物质的量之比为（1-3）:（0.3-3），反应温度15℃-50℃，反应时间为10h -48h。所述反应产物使用隔膜泵在60℃的真空中放置，去除吡啶。所得混合物在蒸馏水中透析（截留值为25000Da）48小时，最终得到的DSPE-PEG-FA。
2 叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体的制备。
利用膜分散法制备雷公藤甲素长循环脂质体。将处方量的EPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-FA与TP（物质的量之为100：30：1：1：5），溶解于甲醇溶剂中，得到混合物。将此混合物在40℃水浴中旋转蒸发，通过薄膜分散法制得脂质膜。所得脂质膜用5mLPBS水溶液充分水化，得到水化液。将所得水化液置超声细胞捣碎机中进行超声1-50分钟，超声功率为100-700W。将所得超声产物用聚碳酸酯膜（0.22 μm）过滤两次，即得叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体。
3 叶酸修饰的香豆素脂质体（FA-Cou-Lips）的制备。
叶酸修饰的香豆素脂质体通过上述相同方法进行制备，其中雷公藤甲素用香豆素（Cou）代替。
4 脂质体的表征。
将DSPE-PEG2000-NH2与DSPE-PEG2000-FA基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测，图2和图3分别为DSPE-PEG2000-NH2与靶向配体DSPE-PEG2000-FA的MALDI-TOF-MS图谱。MALDI-TOF-MS图谱显示，DSPE-PEG2000-NH2（图2）与DSPE-PEG2000-FA（图3）的平均相对分子质量分别为2519.53 Da与2961.64 Da，二者相对分子质量差值结果与FA和NH2的相对分子质量差值基本吻合，证明靶向材料DSPE-PEG2000-FA合成成功。
雷公藤甲素长循环靶向脂质体的表面及形态使用透射电子显微镜及原子力扫描探针显微镜进行观察，结果见图4，5和6。其中，图4为雷公藤甲素长循环靶向脂质体的透射电镜照片，图5为雷公藤甲素长循环靶向脂质体的原子力显微镜二维照片，图6为雷公藤甲素长循环靶向脂质体的原子力显微镜三维照片。由图4可知，制备的雷公藤甲素长循环靶向脂质体呈圆球形。由图5和6可知，雷公藤甲素长循环靶向脂质体粒径大约为100 nm，呈圆形或类圆形，表面光滑。
脂质体的粒径以及Zeta电位情况适用马尔文激光粒度仪进行测定，结果见图7和8。由图7可知，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体的粒径为100nm左右，粒径大小符合实验预期。由图8可知，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体表面Zeta电位为-6.33±0.15 mV。
实施例2脂质体体外靶向性研究。
1 细胞培养。
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7细胞培养于DMEM培养液（含有10 %的胎牛血清和5%的100 U/mL青霉素与100 μg/mL链霉素），在37 ℃并含有5% CO2的恒温细胞培养箱内培养。根据培养瓶内具体的细胞数量及生长状态，取对数生长期的RAW264.7细胞进行实验。
2 细胞毒作用。
2.1 SRB方法测定RAW264.7细胞体外存活率。
取对数生长期RAW264.7细胞以5×103个/孔的细胞浓度将细胞接种于96孔板，不同给药浓度分别设置4个平行复孔。继续孵育24 h，每孔加入不同浓度的游离药物和脂质体。 孵育48 h后，采用 SRB方法测定RAW264.7细胞体外存活率，540 nm波长下测定光密度值（OD值）。细胞生存率计算方法如下：细胞生存率 (%)=OD值给药组/OD值对照组×100 %。采用GraphPad Prism 6.0版软件计算50%抑制浓度(IC50)。 结果见图9。由图9可知，游离的雷公藤甲素组（TP）的IC50值为2.78±0.12μ M，无叶酸修饰的雷公藤甲素脂质体组（TP-Lips）的IC50值为1.75±0.06µM，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体组（ FA-TP-Lips）的IC50值为2.73±0.11µM。即，与游离的雷公藤甲素组相比，脂质体剂型的雷公藤甲素环境下，RAW264.7细胞的体外存活率有所升高，即，脂质体剂型的雷公藤甲素对应的RAW264.7细胞毒性有所降低。
2.2 流式细胞仪测定细胞凋亡。
为了检测叶酸修饰雷公藤甲素脂质体对RAW264.7细胞凋亡的影响，将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在6孔板中，分别用不同制剂处理24小时，PBS作为空白对照。然后收集细胞，利用凋亡检测试剂盒APC (Thermo)进行染色。染色后，用流式细胞仪进行检测，结果见图10。其中，PBS组代表空白对照，TP-Lips组为无叶酸修饰的雷公藤甲素脂质体，FA-TP-Lips组为叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体，TP组为游离的雷公藤甲素。图10表明，PBS组RAW264.7细胞凋亡的总百分比为3.20±0.11%，TP-Lips组为17.90±0.48%，FA-TP-Lips组为6.13±0.95%，游离TP组为22.71±1.56%。即，与游离的雷公藤甲素相比，雷公藤甲素脂质体剂型产生的 小鼠单核巨噬细胞的凋亡数目少于更少。该结果与SRB方法测定RAW264.7细胞体外存活率的测定结果一致。
3 脂质体体外靶向性研究。
3.1 流式细胞仪测定细胞摄取。
流式细胞仪用于评估香豆素在体外LPS诱导后RAW264.7细胞中的摄取。简而言之，将指数生长期的RAW264.7细胞以每孔1.5×105个细胞的密度接种在6孔板中。在37°C下孵育12小时后，加入LPS诱导16小时，然后用香豆素脂质体和叶酸修饰的香豆素脂质体分别孵育RAW264.7细胞4 h，香豆素浓度为3μM，空白培养基用作对照。孵育后，收集细胞并混悬在500μLPBS中，使用FACScan流式细胞仪测量香豆素的荧光强度，每次分析所收集的细胞数为1×104个，实验平行进行三次。用荧光强度表示细胞的摄取量，结果见图11。其中，a为空白对照组4h结果，b为无叶酸修饰的香豆素脂质体4h结果,c为叶酸修饰的香豆素靶向质体4h结果。由图11可知，空白对照组4h的荧光强度数值为3.12±0.13，无靶头修饰的香豆素脂质体组4h的荧光强度数值为95.60±1.71，叶酸修饰的香豆素靶向脂质体组4h的荧光强度数值为122.60±1.87，即，叶酸修饰的香豆素靶向脂质体组具有最高的荧光强度数值，这说明，用叶酸修饰脂质体，可以明显提高LPS处理的RAW264.7细胞对脂质体的摄取能力。
3.2 共聚焦显微镜测定细胞摄取。
为了评估脂质体在细胞内的分布情况，将经LPS处理的RAW264.7细胞与上述不同药物一起孵育。简言之，将指数生长期的RAW264.7细胞以每孔1.5×105个细胞的密度接种在6孔板中。在37°C下孵育12小时后，加入LPS诱导16小时，然后用香豆素脂质体和叶酸修饰的香豆素脂质体分别孵育RAW264.7细胞4 h，香豆素浓度为3μM，空白培养基用作对照。培养后，用冷PBS缓冲液洗涤细胞3次，在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，用PBS洗涤残留多聚甲醛，然后DAPI避光染色10分钟。最后，用共聚焦显微镜对样品进行拍照并观察。结果见图12。图12表明，与无靶头修饰的普通脂质体相比，叶酸修饰的靶向脂质体能够地被细胞摄取。该结果与流式细胞仪测定细胞摄取结果一致。
3.3 脂质体对细胞促炎因子表达水平的影响测定。
为了评估脂质体对细胞促炎因子表达水平的影响，将RAW264.7细胞以每孔1.5×105个细胞的密度接种在6孔板中孵育12小时后，给与不同组别的制剂，其中，PBS组作为空白对照组。孵育6小时后，除对照组外，其余各组均加入LPS进行活化。继续孵育16小时后，收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测上清液中如下三种促炎因子IL-1β、TNF-α及IL-6的表达水平，结果见图13。图13表明，与模型组相比，游离的雷公藤甲素组、无叶酸修饰的雷公藤甲素组，以及叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体组均能降低三种促炎因子的表达水平。其中，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体组能够最大程度地降低三种促炎因子的表达水平。即，与游离的雷公藤甲素和无叶酸修饰的雷公藤甲素相比，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体具有更好的抗炎效果。
3.4 脂质体抑制RAW264.7细胞向破骨细胞转化的测定。
为了评估脂质体对RAW264.7细胞向破骨细胞转化的影响，将RAW264.7细胞以每孔1×103个细胞的密度接种在96孔板中。除阴性对照组外，其余各组均加入核因子κ B受体活化因子配体（RANKL，100ng/mL）与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，100ng/mL），每两天换液一次。培养第七天后进行TRAP染色，在倒置显微镜下拍照观察，结果见图14。图14表明，与游离的雷公藤甲素组和无叶酸修饰的雷公藤甲素脂质体组相比，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体对应的破骨细胞数量最少，即，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体抑制破骨细胞生成的能力最强。
实施例3脂质体体内药效学研究。
1. CIA模型大鼠的建立。
将鸡Ⅱ型胶原溶于新鲜配置的的乙酸溶液中，在4℃搅拌过夜。次日于冰上将胶原溶液逐滴加入到弗氏完全佐剂中，搅拌约2h，将其乳化完全，用作初次免疫；继发免疫剂的制备方法同上，只需将胶原溶液加入弗氏不完全佐剂即可。在每只大鼠尾根部皮下注射100μL初次免疫剂，7d后，继续注射继发免疫剂加强免疫，观察大鼠关节出现了严重的肿胀，则认为造模成功。
2. 脂质体在CIA大鼠的活体状态下的组织分布情况。
通过光学成像系统进行观察，荧光探针选用DiR荧光染料。具体过程，将大鼠分为三组，每组随机选用3只（n=3）。不同组别的大鼠尾静脉分别注射生理盐水、DiR脂质体（DiR-Lips）和叶酸修饰的DiR脂质体（FA-DiR-Lips），DiR用量为400μg/kg，其中，生理盐水组（Blank control）为空白对照组。随后在不同时间点1h、12h和24h将大鼠进行麻醉，并使用活体荧光成像系统在1h、12h和24h分别捕获大鼠的荧光图像。结果见图15。由图15可知，FA-DiR-Lips组大鼠的荧光强烈集中在发炎的关节中，并且在24小时以上仍可观察到强烈荧光。而DiR-Lips组大鼠的荧光较弱，持续时间较FA-DiR-Lips更短。不同时间点的DiR荧光强度大小顺续如下：FA-DiR-Lips组>DiR-Lips组>生理盐水组。这说明，叶酸修饰的脂质体具有更好的关节靶向性。
3. CIA大鼠分组及给药情况。
取CIA造模成功的大鼠随机分成4组，模型组注射生理盐水(Model)，其余三组分别进行尾静脉注射游离雷公藤甲素(TP)、尾静脉注射无叶酸修饰的雷公藤甲素脂质体(TP-Lips)、叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体(FA-TP-Lips)，雷公藤甲素的给药量为30µg·kg-1，每隔三日给药一次，治疗周期为28天。另外，取未进行造模处理的大鼠作为空白对照组，正常喂养。
4. 脂质体对CIA大鼠关节炎的治疗情况。
分别于0天（给药前）、7天、14天、21天及28天相同时间段对各组大鼠关节进行关节炎指数评分，评分依据为：关节无肿胀计0分；关节轻微肿胀计1分；关节中度红肿计2分；关节严重肿胀计3分；关节严重肿胀并出现功能障碍计4分。评分结果见图16。由图16可知，与模型组相比，游离雷公藤甲素组、无叶酸修饰的雷公藤甲素脂质体组、叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体组均能降低关节炎指数，其中以叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体组(FA-TP-Lips)组效果最好。于给药28天后对CIA大鼠的后肢进行拍照，结果见图17。由图17可知，不同给药组大鼠的足爪肿胀程度的大小顺序为：模型组>TP组>TP-Lips组>FA-TP-Lips组>空白对照组。即，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体组改善CIA大鼠足爪肿胀的能力最为显著。
5. 脂质体对CIA大鼠治疗后的软骨组织HE、TRAP和免疫组织化学染色情况。
治疗28天后，将大鼠处死。完整分离大鼠关节膝关节软骨组织，将其放置脱钙液中脱钙，用4%多聚甲醛进行固定、乙醇脱水、二甲苯透明、放入石蜡中进行包埋，然后切片、脱蜡，进行HE染色，于显微镜下观察，结果见图18。结果表明：空白对照组软骨表面平整光滑，细胞排列均匀整齐、软骨陷窝清晰可见，细胞核清晰可见，软骨基质深染、着色均匀，潮线清晰完整；而模型组软骨表面不光整且出现了增生，部分软骨陷窝消失，部分细胞核坏死，软骨基质浅染且着色不均，潮线模糊；各给药组相比于模型组，症状有所改善，其中FA-TP-Lips组对大鼠滑膜改善作用最为显著。
治疗28天后，将大鼠处死。完整分离大鼠关节膝关节软骨组织，将其放置脱钙液中脱钙，用4%多聚甲醛进行固定、乙醇脱水、二甲苯透明、放入石蜡中进行包埋，然后切片、脱蜡，组织进行TRAP染色，于显微镜下观察，结果见图19。结果表明：模型组大鼠的软骨TRAP阳性细胞明显增多。与模型组相比，各给药组均能减少破骨细胞数量，其中FA-TP-Lips组作用最为显著。
治疗28天后，将大鼠处死。完整分离大鼠关节膝关节软骨组织，将其放置脱钙液中脱钙，用4%多聚甲醛进行固定、乙醇脱水、二甲苯透明、放入石蜡中进行包埋，然后切片、脱蜡，组织进行免疫组织化学染色，于显微镜下观察，检测大鼠软骨组织中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，结果见图20。结果表明：模型组MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显高于空白对照组，与模型组相比，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体(FA-TP-Lips)能明显降低关节软骨中MMP-2和MMP-9的表达。
6.脂质体对CIA大鼠治疗后血清炎症因子的测定情况。
大鼠连续治疗28天后，摘取眼球取血，3000rpm/min离心5min后取上清，于-20℃条件保存。用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α及IL-6的表达水平，样品处理和实验操作按说明书进行，结果见图21。由图21可知：与空白对照组相比，模型组大鼠的血清促炎细胞因子水平显著升高。与模型组相比，各给药组血清促炎细胞因子水平均显著降低，其中，叶酸修饰雷公藤甲素靶向脂质体组（FA-TP-Lips）的促炎细胞因子水平降低最为显著。
综上所述，通过以上实施实例可知，叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体可以明显提高药物在CIA大鼠关节炎部位的靶向性，可以明显降低CIA大鼠关节软骨中MMP-2和MMP-9的表达，减少破骨细胞数量，改善滑膜作用，且显著降低血清中促炎细胞因子的水平，明显改善CIA大鼠足爪的肿胀情况。

Claims (7)

1.一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体，其特征在于，所述长循环靶向脂质体由雷公藤甲素，膜材以及靶向配体组成；
所述长循环靶向脂质体为磷脂双分子层疏水结构，包载雷公藤甲素于双分子层疏水结构中；
所述的膜材包括蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇；所述的靶向配体为二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-叶酸；
所述叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体的制备方法包括如下步骤：
步骤1、将FA、DCC、NHS按比例溶解于二甲基亚砜中进行酰基化反应，将反应产物以8000-12000r/min离心20-30min，离心1-5次，离心所得上清液移到新的离心管中后加入溶液A混匀，再次采用上述条件离心，获得黄色固体；然后将上述黄色固体用溶液A重悬后采用上述离心条件离心进行洗涤，洗涤1-5次，最后一次离心所得固体产物真空干燥，得到FA-NHS；
步骤2、将步骤1所得的FA-NHS与DSPE-PEG-NH2和吡啶按比例在DMSO溶剂中反应，将所得反应产物在隔膜泵中真空放置，除去吡啶，制得混合物A；然后将所得混合物A在蒸馏水中透析，最终得到的靶向配体DSPE-PEG-FA；
步骤3、将步骤2所得的靶向配体DSPE-PEG-FA与蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和雷公藤甲素溶解于甲醇溶剂中，得到混合物B；所得的混合物B在40℃水浴中旋转蒸发，通过薄膜分散法制得脂质膜；然后将所得脂质膜用1-10mL PBS水溶液充分水化，得到水化液；将所得水化液置超声细胞捣碎机中进行超声；将所得超声产物用聚碳酸酯膜过滤两次，即得叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体；
所述步骤3中EPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-FA、雷公藤甲素的物质的量之比为(80-120)：(22-40)：(0.3-1.5)：(0.3-1.5)：(3-8)；所述超声功率为100-700W，超声1-50min；所述聚碳酸酯膜的孔径为0.22μm；
所述FA为叶酸，所述DCC为二环己基碳二亚胺，所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；所述DSPE为二硬脂酰磷脂酰乙酰胺；所述EPC为蛋黄卵磷脂，所述Chol为胆固醇。
2.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体，其特征在于，所述长循环脂质体经过叶酸的修饰具有增加脂质体在体内的循环时间及病变部位的靶向性的作用；所述雷公藤甲素包封于磷脂双分子层疏水结构中具有免疫抑制、抗炎、保护软骨组织的作用。
3.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体，其特征在于，所述长循环脂质体在制备在用于治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
4.一种根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、将FA、DCC、NHS按比例溶解于二甲基亚砜中进行酰基化反应，将反应产物以8000-12000r/min离心20-30min，离心1-5次，离心所得上清液移到新的离心管中后加入溶液A混匀，再次采用上述条件离心，获得黄色固体；然后将上述黄色固体用溶液A重悬后采用上述离心条件离心进行洗涤，洗涤1-5次，最后一次离心所得固体产物真空干燥，得到FA-NHS；
步骤2、将步骤1所得的FA-NHS与DSPE-PEG-NH2和吡啶按比例在DMSO溶剂中反应，将所得反应产物在隔膜泵中真空放置，除去吡啶，制得混合物A；然后将所得混合物A在蒸馏水中透析，最终得到的靶向配体DSPE-PEG-FA；
步骤3、将步骤2所得的靶向配体DSPE-PEG-FA与蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和雷公藤甲素溶解于甲醇溶剂中，得到混合物B；所得的混合物B在40℃水浴中旋转蒸发，通过薄膜分散法制得脂质膜；然后将所得脂质膜用1-10mL PBS水溶液充分水化，得到水化液；将所得水化液置超声细胞捣碎机中进行超声；将所得超声产物用聚碳酸酯膜过滤两次，即得叶酸修饰的雷公藤甲素靶向脂质体；
所述步骤3中EPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-FA、雷公藤甲素的物质的量之比为(80-120)：(22-40)：(0.3-1.5)：(0.3-1.5)：(3-8)；所述超声功率为100-700W，超声1-50min；所述聚碳酸酯膜的孔径为0.22μm；
所述FA为叶酸，所述DCC为二环己基碳二亚胺，所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；所述DSPE为二硬脂酰磷脂酰乙酰胺；所述EPC为蛋黄卵磷脂，所述Chol为胆固醇。
5.根据权利要求4所述的一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中FA、DCC和NHS的物质的量之比为（0.2-2）:（0.5-4）:(0.2-3）；所述酰基化反应的温度为15℃-50℃，反应的时间为2h-6h；所述干燥条件为30-80℃下真空过夜干燥。
6.根据权利要求4所述的一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的溶液A为体积比为7:3的0℃-10℃的无水乙醚和丙酮的混合液。
7.根据权利要求4所述的一种叶酸修饰的雷公藤甲素长循环靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中FA-NHS与DSPE-PEG-NH2物质的量之比为（1-3）:（0.3-3）；所述反应条件为5℃-50℃温度下反应10h-48h；所述真空条件为30-90℃；所述透析截留分子量为25000Da，透析12-60h。
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