JPH06211680A

JPH06211680A - 神経細胞死抑制剤

Info

Publication number: JPH06211680A
Application number: JP5024931A
Authority: JP
Inventors: Zenji Kawakami; 善治川上; Masahiro Tabuchi; 雅宏田渕; Tetsuhiro Ookuma; 哲汪大熊
Original assignee: Tsumura and Co
Current assignee: Tsumura and Co
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1993-01-21
Publication date: 1994-08-02

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、神経細胞の細胞死を原因とする疾患
の医薬、詳しくはアルツハイマー病、ダウン症、血管性
痴呆症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等の治療
に有用な医薬を提供することを目的とする。【構成】本発明は、黄連解毒湯を有効成分として含有す
る神経細胞死抑制剤である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、神経細胞の細胞死を原
因とする疾患の医薬として利用可能な神経細胞死抑制剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術および課題】近年、神経組織の死と神経栄
養因子（ＮｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔｏｒ：Ｎ
ＴＦ）との関連が注目を浴びている。つまり、神経細胞
が神経栄養因子の中の代表的なものである神経成長因子
（ＮｅｒｖｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）
を受け取れなくなった（又は、不足した）場合、神経細
胞は、何らかの自殺機構が発現して細胞死に至ることが
確認されている。［ジャーナル・オブ・セル・バイオロ
ジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇ
ｙ），１０６巻，８２９〜８４４，１９８８］また、最
近は、このような神経細胞の自殺機構の発現を抑制する
ことによって、神経細胞を細胞死から救う生体物質とし
て、発癌遺伝子産物であるビー・シー・エル−２（Ｂｃ
ｌ−２）が見い出されている。［サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ），２５８巻，３０２〜３０４，１９９２］

【０００３】このような、神経栄養因子を受け取れなく
なった（又は、不足した）場合、誘起される神経細胞の
死から救うこと（神経細胞死抑制効果）ができる医薬を
開発することができれば、多くの疾患の治療に利用する
ことができ、神経細胞死抑制効果を有する化合物の開発
が望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の課
題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、黄連解毒湯に
顕著な神経細胞死抑制効果を有することを見いだし、本
発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は黄連解毒湯（以下、本
発明の有効成分という。）を有効成分として含有する神
経細胞死抑制剤である。

【０００６】本発明によれば上述した神経栄養因子を受
け取れなくなった（又は、不足した）場合、誘起される
神経細胞の死を成因とされている疾患、例えばアルツハイマー病［プロ．エヌ．エー．エス（Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．Ｓ．），
８３巻，９２３１〜９２３５，１９８６］、ダウン症［プロ．エヌ．エー．エス（Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．Ｓ．），
８８巻，１７９３〜１７９７，１９９１］、血管性痴呆症［ジャーナル・オブ・ニューロサイ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．），１１巻９号，２９１４〜２９１９，１９９
１］、パーキンソン病［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３５０巻，２３０〜２
３２，１９９１］、筋萎縮性側索硬化症［アン・ニューロル（Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．）１０
巻，４９９〜５０５，１９８１］等の治療が可能である。

【０００７】本発明の有効成分である黄連解毒湯の処方
は、漢方処方の古典（外台秘要方とう）に記載されてお
り、若干の差異があるが生薬の配合範囲は一般に次の通
りである。

【０００８】［黄連解毒湯］黄連１．５〜２．０黄柏１．５〜３．０オウゴン３．０山梔子２．０〜３．０

【０００９】また、黄連解毒湯は、病的血圧上昇の抑制
効果や胃酸分泌抑制効果などは知られているが、神経細
胞死抑制効果は、従来全く知られていなかったことであ
る。

【００１０】本発明の有効成分は、上記配合の黄連解毒
湯をそのまま、もしくはその抽出物を有効成分とし、こ
れを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればよい。

【００１１】黄連解毒湯の抽出物としては各種水系溶剤
抽出物が挙げられるが、水抽出物を用いることが好まし
い。具体的な黄連解毒湯の抽出物の調整例としては、上
記組成の黄連解毒湯を１０〜２０倍量の熱水で抽出し、
得られた抽出液を濾過する方法が挙げられる。この抽出
物は必要に応じて乾燥させ、乾燥粉末として用いること
ができる。

【００１２】本発明の有効成分の製造の具体例を示すと
次のごとくである。

【００１３】具体例１黄連６．０ｇ、黄柏４．５ｇ、オウゴン９．０ｇ及び山
梔子６．０の混合生薬（黄連解毒湯：２５．５ｇ）に２
６０ｇの精製水を加え、１００°Ｃで１時間加熱抽出し
た。得られた抽出液を濾過後、スプレードライして４．
５ｇの乾燥エキス粉末を得た。

【００１４】具体例２黄連６００ｇ、黄柏４５０ｇ、オウゴン９００ｇ及び山
梔子６００ｇの混合生薬（黄連解毒湯：２．５５ｋｇ）
に２６ｌの精製水を加え、加熱し、１００°Ｃになって
から１時間抽出した。得られた抽出液を遠心分離機にか
け、残渣を分離して溶液を得た。

【００１５】この溶液を０．３μｍのメンブランフィル
ター（東洋濾紙社製）により無菌清澄濾過した。得られ
た濾液をダイアフィルターＧ−１０Ｔ（バイオエンジニ
アリング社製：分画分子量１００００）を用いて限外濾
過した。この限外濾過は、内容積２．０ｌの容器の下面
に直径１５２ｍｍの膜をセットし、圧力３ｋｇ／ｃｍ²
で行い、容器内の液が濃縮されるにつれ精製水を添加す
るというように実施した。この結果、限外濾過液を得
た。

【００１６】次に、本発明の有効成分が神経細胞死抑制
効果を有することを実験例を挙げて説明する。

【００１７】実験例本実験は、ピー・ディー・マーチン（Ｐ．Ｄ．Ｍａｒｔ
ｉｎ）らの方法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジ
ィ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇ
ｙ），１０６巻，８２９−８４４，１９８８」に従っ
た。つまり、胎生２１日目のラット胎仔から取り出した
上頸交感神経節（ＳｕｐｅｒｉｏｒＣｅｒｖｉｃａｌ
Ｇａｎｇｌｉｏｎ、ＳＣＧ）の神経細胞をマウス神経成
長因子（ＮＧＦ）を５０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた培養
液で７日間、前培養し、その後２日間の培養期間中、Ｎ
ＧＦ５０ｎｇ／ｍｌが存在していれば神経細胞は生存し
ているが、ＮＧＦが存在していなければ全神経細胞は死
滅する。ＮＧＦが存在しない状態で、蛋白合成やＲＮＡ
合成を阻害した場合、全ての神経細胞は、生存するの
で、この場合は、細胞死を引き起こす蛋白質が合成され
ていないために神経細胞が生存していると考える事がで
きる。一方、ＮＧＦ存在下では、細胞死を引き起こす蛋
白質の合成及びその細胞死効果が抑制されていると考え
られる。

【００１８】解剖とＳＣＧの採取方法。解剖用緩衝液：ハンクス・バランスト・ソルト・ソリュ
ーション［Ｈａｎｋｓ’ ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）社の１ｌ用粉末］を１ｌの１５ｍＭヘペス（ＨＥＰ
ＥＳ、和光）液（ｐＨ７．２）に溶解後、０．２２μｍ
フィルターを通して滅菌したもの（以下ＨＢＳＳ液と
いう）を使った。ラット：スペシィフィック・パソジェン・フリー（ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ，ＳＰＦ）
のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系の確定妊娠１２日目の
ラット（日本ＳＬＣ）を購入し、妊娠２１日目のものを
使った。方法：妊娠２１日目のラットを約５分間エーテル麻酔し
た後、解剖台にあお向けに乗せ、左右の頸動脈を切断し
て瀉血した。腹部を７０％アルコールで噴霧消毒後、解
剖バサミで皮膚を大きく切開し、露出した腹膜を腹筋ご
と小さく（約２ｃｍ）十字に切開して腹腔を露出させ
た。平均して合計約１０匹前後の胎仔が入っている左右
の子宮角を、火炎滅菌したピンセットと滅菌解剖バサミ
で取り出して、上記ＨＢＳＳ液が入った１００ｍｍ径の
シャーレ（Ｆａｌｃｏｎ社）に入れた。シャーレ中で子
宮膜と胎仔膜を切り、さらに各胎盤から切り離した胎仔
を一匹ずつ取り出して、別の新しいＨＢＳＳ液入りシャ
ーレに胎仔を集めた。胎仔は、胸部から上を切り取り、
その顎部を腹方から注射針で貫通後、ワックス台の上に
あお向けに固定した。滲み出す体液や血液を滅菌ガーゼ
で吸い取りながら、胸部から頸部にかけての皮膚、筋
肉、腺を滅菌ピンセットと滅菌解剖バサミで取り除いて
いくと、外頸動脈と内頸動脈の分岐付近に乳白色・根棒
形のやや固いＳＣＧがある。胎仔１匹あたり１対あるこ
のＳＣＧを、ＨＢＳＳ液を入れた３５ｍｍシャーレに全
胎仔分集めた。

【００１９】ＳＣＧ神経細胞の採取・幡種・培養方法細胞培養液：ミニマム・エッセンシャル・メディウム
（ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕ
ｍ，Ｇｉｂｃｏ社）に牛胎仔血清（Ｆｌｏｗ社）を１０
％加え、さらにペニシリンＧカリウム（明治製菓）とス
トレプトマイシン（萬有製薬株式会社）を各々１００ユ
ニット（ｕｎｉｔｓ）／ｍｌと１００μｇ／ｍｌ、ウリ
ジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ社）とフルオロデオ
キシウリジン（Ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎ
ｅ、Ｓｉｇｍａ社）を各々２０μＭとなるように加えた
ものを使った（以下、培養液という）。ＳＣＧ神経細胞：集めたＳＣＧｓについて、各ＳＣＧの
周囲に付いている余分な結合組織を実体顕微鏡（Ｎｉｋ
ｏｎ社）下で滅菌ピンセットにより取り除き、シャーレ
の中で新しいＨＢＳＳ液により３回洗った後に、コラゲ
ナーゼ（和光）が１ｍｇ／ｍｌ濃度の入った１ｍｌのＨ
ＢＳＳ液にＳＣＧｓを入れ、３７°Ｃで３０分間インキ
ュベーションした。その間、液を２〜３回撹拌した。そ
の後、バーナーによって先端付近をさらにほそくしたパ
スツールピペットを用いてＳＣＧｓを７０〜８０回出し
入れすることにより、ＳＣＧ神経細胞を解離させた。こ
のＳＣＧ神経細胞浮遊液の細胞濃度を、トリパン青染色
によるセルカウント法により知った。方法：マウス２．５Ｓ神経成長因子（ＮＧＦ、宝酒造）
を５０ｎｇ／ｍｌとなるように上記培養液に加えた液を
用いて、６００μｌにＳＣＧ１／２〜１／３個相当の
細胞が入っている希釈液を作った。この細胞浮遊液を、
コラーゲンコーテッド２４穴細胞培養プレート（Ｃｏａ
ｓｔａｒ社、ｃａｔ．Ｎｏ．２５８２０ｃｏｌ１）に
１ウェル当たり６００μｌずつ幡種して、３７°Ｃ、５
％二酸化炭素（ＣＯ₂）下で培養を開始した。ＮＧＦが
５０ｎｇ／ｍｌの濃度で入っている新しい培養液で１日
おきに培地を全量交換しながら７日間の前培養を行っ
た。

【００２０】サンプル検定方法具体例１で得られた本発明の有効成分を秤量後、培養液
で使用濃度（５０μｇ／ｍｌ）になるように溶解した。
前培養の７日目に、未使用培養液を１ウェル当たり６０
０μｌ使用して１回洗った後に、３０ｎｇのマウスＮＧ
Ｆを中和する抗マウスＮＧＦ抗体を加えた未使用培養
液、または本発明の有効成分をウェルに入れ、さらに２
日間の培養を続けた。２日間の培養試験終了後、トリパ
ン青染色によるセルカウント法によって各ウェル内の生
残細胞数と死亡細胞数を顕微鏡下で数え、生残細胞数の
比率を計算した。

【００２１】結果を表１に示した。

【００２２】表１

【００２３】上述の結果より、本発明の有効成分が顕著
な神経細胞死抑制効果を有することが確認された。従っ
て、本発明の有効成分である黄連解毒湯は、アルツハイ
マー病、ダウン症、血管性痴呆症、パーキンソン病、筋
萎縮性側索硬化症等の治療に利用可能な神経細胞死抑制
剤として有用であることが確認された。

【００２４】尚、本発明の有効成分である黄連解毒湯
は、漢方薬として長い歴史を有し、安全性が確認された
ものであるので安心して使用することができる。例え
ば、マウス及びラットに対し、限界投与である１５ｇ／
ｋｇの経口投与で死亡例が認められないことから明らか
なように極めて安全性の高いものである。

【００２５】次に、本発明の有効成分の投与量及び製剤
化について説明する。

【００２６】本発明の有効成分の投与形態としては、特
に限定がなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注
射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。

【００２７】所期の効果を発揮するためには、患者の年
令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で本発
明の有効成分の重量として３〜１５ｇを、１日数回に分
けての服用が適当と思われる。

【００２８】本発明の有効成分は、錠剤、カプセル剤、
顆粒剤等の経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マ
ンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスター
チ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。

【００２９】この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他
に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、活沢剤、流動性促進
剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。
それぞれの具体例は以下に示すごとくである。

【００３０】［結合剤］デンプン、デキストリン、アラ
ビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロー
ス、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロ
ゴール。

【００３１】［崩壊剤］デンプン、ヒドロキシプロピル
スターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カ
ルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチ
ルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。

【００３２】［界面活性剤］ラウリル硫酸ナトリウム、
大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート
８０。

【００３３】［滑沢剤］タルク、ロウ類、水素添加植物
油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウ
ム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウ
ム、ポリエチレングリコール。

【００３４】［流動性促進剤］軽質無水ケイ酸、乾燥水
酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ
酸マグネシウム。

【００３５】また、本発明の有効成分は、懸濁液、エマ
ルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与す
ることができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着
色剤を含有してもよい。

【００３６】一方、非経口剤は常法に従って製造され、
希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ
糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイ
ズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール等を用いることができる。さらに必要
に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。ま
た、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填
後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使
用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもでき
る。さらに、必要に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防
腐剤、無痛化剤等を加えても良い。

【００３７】次に本発明の有効成分の製剤の実施例を示
して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれ
により何ら制限されるものではない。

【００３８】実施例１コーンスターチ２１ｇ結晶セルロース１０ｇカルボキシメチルセルロースカルシウム７ｇ軽質無水ケイ酸１ｇステアリン酸マグネシウム１ｇ具体例１で得られた黄連解毒湯１６０ｇ計２００ｇ上記の処方に従って〜を均一に混合し、打錠機にて
圧縮成型して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。この錠剤一
錠には、具体例１でえられた黄連解毒湯１６０ｍｇが含
有されており、成人１日２０〜８０錠を数回にわけて服
用する。

【００３９】実施例２コーンスターチ２９ｇステアリン酸マグネシウム２ｇカルボキシメチルセルロースカルシウム８ｇ軽質無水ケイ酸１ｇ具体例１で得られた黄連解毒湯１６０ｇ計２００ｇ上記の処方に従って〜を均一に混合し、圧縮成型機
にて圧縮成型後、破砕機により粉砕し、篩別して顆粒剤
を得た。この顆粒剤１ｇには、具体例１で得られた黄連
解毒湯８００ｍｇが含有されており、成人１日４〜１８
ｇを数回にわけて服用する。

【００４０】実施例３コーンスターチ１９ｇ軽質無水ケイ酸１ｇ具体例１で得られた黄連解毒湯１８０ｇ計２００ｇ上記の処方に従って〜を均一に混合し、２００ｍｇ
を２号カプセルに充填した。このカプセル剤１カプセル
には、具体例１で得られた黄連解毒湯２０ｍｇが含有さ
れており、成人１日２０〜８０カプセルを数回にわけて
服用する。

【００４１】実施例４具体例２で得られた黄連解毒湯２０ｌにアラニン（発熱
物質不含）３００ｇを添加、溶解し、凍結乾燥する。こ
の凍結乾燥物を９００本のバイアル瓶に分注して注射剤
を得た。この注射剤１バイアルには、凍結乾燥物４０６
ｍｇが含まれており、１０ｍｌの精製水に容易に溶解し
た。また、溶解後の注射液は、９２％（５５０ｎｍ）の
透過度を有しており、日本薬局方の発熱性物質試験法に
合格していた。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】黄連解毒湯を有効成分として含有する神経
細胞死抑制剤。