CN114736895A - 一种利用UiO-66类金属有机框架制备固定化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用UiO‑66类金属有机框架制备固定化酶的方法，包括以下步骤：(1)将弱配体、金属盐和生物酶在溶液体系中混合反应，合成UiO‑66类MOF结构，并将生物酶封装至UiO‑66类MOF结构中，得到结构不稳定的MOF复合材料UiO‑66‑F4@酶；(2)将所述MOF复合材料UiO‑66‑F4@酶浸于含强配体的中性溶液体系中，进行配体交换反应，制得固定化酶UiO‑66‑R@酶。本发明提供了一种兼容性条件，既能够有效制备UiO类MOF也可以最大限度地保持生物酶的功能活性，最终在低温水相条件下利用UiO类MOF对生物酶分子进行原位封装，达到了拓宽此类MOF@酶复合材料使用范围的目的。
Description
技术领域
本发明属于酶复合材料技术领域，尤其涉及一种利用UiO-66类金属有机框架制备固定化酶的方法。
背景技术
在利用金属有机框架材料原位封装生物酶分子的方案中，目前绝大多数文献集中在以ZIF-8为代表的咪唑酯类MOF上。ZIF系列的MOF由金属离子(一般是Zn、Co)和咪唑类配体(2-甲基咪唑，2-咪唑甲醛等)合成得到，主要原因在于该类配体与金属盐均可以溶于水相环境，同时在室温水相条件下即可形成目标MOF结构，不需要高温高压的制备条件，这与生物酶所需的低温水相环境相吻合。但是，ZIF系列的MOF结构不耐酸性环境，在pH值低于7时会导致其配位结构的崩解，故该类ZIF@酶复合材料的实际应用受到限制，需要在碱性环境中使用。
相较于ZIF系列MOF，UiO系列是现有MOF材料中结构强度更高、对外界极端条件耐受性(如pH、温度)更好的一类MOF，是一种非常有前景的潜在酶固定化载体。但是现有UiO系列MOF的合成方法通常需要使用有机溶剂环境、强酸调节和高温高压条件，这样的制备条件无法使生物酶保持正常的功能活性，因此目前的文献报道中，研究者采取的方案是先行合成UiO类MOF，而后再将生物酶分子在适合的条件下负载于MOF结构的外表面或者固定于MOF的孔道结构。采用上述后修饰的方法，若使酶分子进入到材料的孔道里，需要材料孔径与酶的大小相匹配，对于二者(孔道/酶)差异很大的酶，则无法实现孔道固定，并且在利用过程中，仍会有酶分子渗漏脱出的可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种利用UiO-66类金属有机框架制备固定化酶的方法，利用UiO-66(Zr-MOF)类金属有机框架原位封装生物酶的方法及固定化酶，该方法提供了一种兼容性条件，既能够有效制备UiO类MOF也可以最大限度地保持生物酶的功能活性，最终在低温水相条件下利用UiO类MOF对生物酶分子进行原位封装，达到了拓宽此类MOF@酶复合材料使用范围的目的。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种利用UiO-66类金属有机框架制备固定化酶的方法，包括以下步骤：
(1)将弱配体、金属盐和生物酶在溶液体系中混合反应，合成UiO-66类MOF结构，并将生物酶封装至UiO-66类MOF结构中，得到结构不稳定的MOF复合材料UiO-66-F4@酶；
(2)将所述MOF复合材料UiO-66-F4@酶浸于含强配体的中性溶液体系中，进行配体交换反应，制得固定化酶UiO-66-R@酶。其中R可表示-NH2、-Cl、-Br、-I、-COOH等。
优选的，所述弱配体包括四氟对苯二甲酸，所述金属盐包括四氯化锆。
优选的，所述强配体包括1,4-对苯二甲酸、氨基取代的对苯二甲酸、卤素取代的对苯二甲酸中的一种或几种。
优选的，所述氨基取代的对苯二甲酸为2-氨基对苯二甲酸、2,5-二氨基对苯二甲酸中的一种或多种；所述卤素取代的对苯二甲酸为2-氯对苯二甲酸、2-溴对苯二甲酸、2-碘对苯二甲酸中的一种或多种。
以弱配体采用四氟对苯二甲酸，金属盐采用四氯化锆为例说明本发明的技术原理如下：
采用的弱配体四氟对苯二甲酸易溶于水并且存在四个吸电子的氟原子，导致羧酸连接物与Zr金属中心之间的键较弱，很容易置换出来。采用四氟对苯二甲酸作为配体及四氯化锆作为金属盐时，其可在室温水相环境中形成UiO-66类MOF结构，在体系中加入生物酶液组分，即可在较低的温度和水相环境中将生物酶分子封装至UiO-66-F4结构中，得到结构不稳定的MOF复合材料UiO-66-F4@酶。之后，在中性条件下，将其浸于含强配体(例如氨基对苯二甲酸)的中性水溶液中，通过配体交换反应(即由强配体替换弱配体)，即可最终实现UiO-66类MOF封装酶分子的目的，得到固定化酶UiO-66-R@酶。
优选的，所述方法操作均是在常温常压下进行。
优选的，所述方法中的溶液体系均为水相环境体系或中性缓冲液体系。
本发明中，所使用的生物酶没有限制，在水溶液中有一定的溶解度即可(绝大多数生物酶可以满足)。优选的，所述生物酶包括水解酶、氧化还原酶、裂解酶中的至少一种；所述水解酶包括脂肪酶、腈水解酶、蛋白酶中的一种或多种；所述氧化还原酶包括葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、过氧化氢酶中的一种或多种；所述裂解酶包括核酸酶、溶菌酶、丙酮酸脱羧酶、醛缩酶中的一种或多种。
优选的，步骤(1)中，所述弱配体、金属盐、生物酶的质量比为(29.8-37.6):(44.8-54.8):1，所述反应的时间为24-36小时；步骤(2)中，所述强配体与MOF复合材料UiO-66-F4@酶的质量比为(0.61-0.64):1，所述配体交换反应的时间为12-20小时。上述各原料的质量比适宜，均能有效形成MOF@酶的复合物沉淀。
优选的，步骤(1)中，将弱配体、金属盐和生物酶在溶液体系中混合反应具体包括以下步骤：将弱配体溶于水中，使用碱液调节pH值至中性，加水定容，得溶液A；向溶液A中加入生物酶溶液，混匀，得溶液B；再将所述溶液B与金属盐水溶液混合，室温下搅拌；
所述溶液A中弱配体与溶液A的质量体积比为(295-305mg):(5.8-6.2mL)；所述生物酶溶液的浓度为0.45-0.55mg/mL；所述金属盐水溶液的浓度为18-19.5mg/mL；所述碱液为质量分数为3-5％的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液；
经所述混合反应后所得的反应体系通过离心收集固体，再经浓度为0.1-0.3g/mL的SDS溶液洗涤1-2次，清水洗涤2-3次，再经冷冻干燥得到MOF复合材料UiO-66-F4@酶。
优选的，步骤(2)中，所述含强配体的中性溶液体系由以下方法制备得到：将强配体溶于碱液中，用酸调节pH值至中性，即得；
所述强配体与碱液的质量体积比为(29.3-30.6)mg:(0.9-1.1)mL；所述碱液为质量分数为3-5％的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液；所述酸为浓度为0.98-1.02M的盐酸；
所述配体交换反应时进行搅拌，经配体交换反应后的反应体系通过离心收集固体沉淀，经去离子水洗涤多次，再经冷冻干燥得到固定化酶UiO-66-R@酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明无需使用有机溶剂、强酸调节剂和高温高压处理，仅在常温常压下，用缓冲液或者水作为溶剂即可完成全部制备过程。整个制备过程不涉及有机溶剂和高温高压设备的使用，在环境保护和降低能耗方面具有显著优势。
2、本发明在第一步由弱配体进行室温水相封装生物酶的过程中，生物酶分子的平均封装效率在95％以上，同时其功能活性相较于天然游离酶保持在90％以上；在第二步配体交换过程中，会有少量酶分子的渗漏损失，大约为3.5％，同时生物酶的活性相较于第一步的产物未见明显变化。本发明最终可以通过两步操作即可完成生物酶在UiO-66类刚性MOF中的封装。
3、通过本发明利用UiO-66类金属有机框架原位封装生物酶的方法，可以固定形状大小各异的酶，同时酶的渗漏量很小，所得产品固定化酶在利用过程中酶不会脱出。
4、本发明根据所封装生物酶的催化功能的差异，所得复合材料固定化酶适用基于酶催化的绝大多数过程场景，行业包括工业生物催化、分析诊断、传感测试等。例如UiO-66-NH2@Lps可以应用于利用脂肪酶催化的水解或酯化反应的相关过程，该催化过程即可以是平台化学品的生产(如生物柴油的制备、手性化合物的拆分)，也可以是对特定催化产物的检测(该产物可以是某种指标分子)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中方法的制备流程图；
图2是实施例1中不同材料的扫描电镜图；其中，(a)为UiO-66-F4的扫描电镜图；(b)为UiO-66-F4@Lps的扫描电镜图；(c)为UiO-66-NH2@Lps的扫描电镜图；
图3实施例1中不同材料的X射线粉末衍射谱图和红外谱图；其中，(a)为X射线粉末衍射谱图；(b)为红外谱图；
图4是游离酶(Lps)与固定化酶(UiO-66-NH2@Lps)的活性对比柱形图；
图5是温度对酶活性的影响曲线图；
图6是pH值对酶活性的影响曲线图；
图7是蛋白酶对酶活性的影响曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种利用UiO-66类金属有机框架原位封装生物酶的方法，包括以下步骤：
(1)合成UiO-66-F4@Lps(即先由弱配体在水相环境中封装酶分子)
称取300mg的四氟对苯二甲酸溶于适量的超纯水中，然后使用质量分数为4％的氢氧化钾将该溶液pH值调节至中性，随后用去离子水将总体积定容至6mL，得溶液A。取1mL上述溶液A，加入至3mL已溶解好的米曲霉脂肪酶溶液中混匀，得溶液B，米曲霉脂肪酶液浓度为0.5mg/mL。
另一方面，将73.4mg的四氯化锆粉末超声溶于4mL超纯水中，得四氯化锆溶液。将溶液B和四氯化锆溶液迅速混合，室温下搅拌24小时。反应结束后，12000rpm离心5min收集固体沉淀，用SDS溶液(0.1g/mL)洗涤2次，然后清水洗3次，随后进行冷冻干燥，时长12小时，获得白色产物UiO-66-F4@Lps(UiO-66-F4@酶)。此过程的蛋白封装效率由Bradford法商业化试剂盒进行检测。
(2)合成UiO-66-NH2@Lps(即由强配体进行配体交换反应)
取45mg 2-氨基对苯二甲酸(强配体)溶于1.5mL质量分数为4％的氢氧化钾溶液中，然后用浓度为1M的盐酸调节溶液pH值至中性。向上述溶液中加入72mg步骤(1)中制备得到的UiO-66-F4@Lps粉末，搅拌12h，进行充分的配体交换反应。12000rpm离心5min收集固体颗粒物后，使用去离子水洗涤多次，除去游离的四氟对苯二甲酸配体，随后进行冷冻干燥，时长12小时，获得棕色固体终产物固定化酶UiO-66-NH2@Lps。配体交换过程中的蛋白渗漏情况依然通过Bradford法商业化试剂盒进行检测分析。
本实施例中，利用UiO-66类金属有机框架原位封装生物酶的方法的核心步骤如图1所示，即通过配体交换反应，于合适条件下完成酶分子由UiO-66类稳定MOF封装的目的，图1中：RT表示室温，PSE表示配体交换反应过程，Lipase表示脂肪酶(Lps)，Zr4+表示锆盐，UiO-66-F4表示基于四氟配体形成的过渡性MOF，UiO-66-NH2表示基于氨基取代配体形成的稳定MOF。
本实施例使用四氟对苯二甲酸(F4)作为配体在水相条件下制备的MOF粒子(UiO-66-F4)以及引入第三组份生物酶后制备得到的复合MOF粒子(UiO-66-F4@Lps)，后者经过配体交换后得到的最终目标产物UiO-66-NH2@Lps。
实施例1中不同材料的扫描电镜图如图2所示；其中，(a)为UiO-66-F4的扫描电镜图；(b)为UiO-66-F4@Lps的扫描电镜图；(c)为UiO-66-NH2@Lps的扫描电镜图。由图可知，各粒子形貌基本一致，没有产生较明显的变化，说明其相互间结构是类似的。
实施例1中不同材料的XRD谱图和红外谱图如图3所示；由XRD谱图可见，封装生物酶分子后，复合MOF粒子的主要衍射峰与纯MOF粒子结果类似，说明其晶体结构基本一致。由红外谱图可见，在经过配体交换后，MOF复合粒子在约1000cm-1处的C-F键振动基本消失，证明弱配体四氟对苯二甲酸得到了比较充分的置换。
生物酶的功能活性比较如图4所示。脂肪酶活性测试通过紫外光谱进行分析检测，以对硝基苯乙酯为底物，检测水解产物对硝基苯酚的生成速率作为活性评价指标。将游离酶(Lps)活性定义为100％，经由UiO-66-NH2封装后的酶分子(UiO-66-NH2@Lps)活性保持率为91.2％，说明本发明所提供的复合材料制备方案可以较好的保持生物酶分子的原始催化活性。
不同温度条件下的酶活性比较如图5所示，游离酶(Lps)最适温度为50℃，且在环境温度高于此值时活性迅速下降；而固定化酶(UiO-66-NH2@Lps)的最适温度为60℃，且在70℃时的活性保持率接近90％，这说明固定化酶对外界温度变化的稳定性得到明显的提升。
不同pH值条件下的酶活性比较如图6所示，游离酶和固定化酶最适pH均为7，但是前者在偏离中性环境后其活性呈现明显的下降。在pH为4时，游离酶的酶活保持率仅有不到50％，而通过UiO-66-NH2结构封装的酶活保持率为90％，且其在试验范围内均保持了较为平稳的态势，体现出该类MOF结构对环境pH变化的稳定性优势。
在封装生物酶分子的过程中，通过表面活性剂的洗涤处理除去了吸附在MOF表面的酶分子。为了进一步证明本发明方案是将生物酶分子封装在MOF内部而非吸附在其外表面，还进行了蛋白酶降解试验。通过蛋白酶的处理，游离于溶液本体和吸附在MOF外表面的那些酶分子将会被蛋白酶水解掉，其活性也将随之丧失。
图7是使用蛋白酶处理不同时间后的样品活性比较结果，游离酶随着处理时间的增加，其蛋白质结构不断被降解，导致其功能活性也在不下降(处理12小时后残余活性约20％)，而MOF封装的酶样品(UiO-66-NH2@Lps)并未表现出活性的明显损失，说明通过UiO-66-NH2框架包覆后，可以有效抑制外界蛋白酶的降解影响。此外，也进一步证明了本发明固定化酶UiO-66-NH2@Lps的酶分子是封装在MOF结构内部的(UiO类MOF的自身孔道结构也不足以容纳脂肪酶分子)，否则将会受蛋白酶降解的影响而不可逆的丢失酶活性。
实施例2：
一种利用UiO-66类金属有机框架原位封装生物酶的方法，包括以下步骤：
(1)合成UiO-66-F4@酶(即先由弱配体在水相环境中封装酶分子)
称取300mg的四氟对苯二甲酸溶于适量的超纯水中，然后使用质量分数为4％的氢氧化钾将该溶液pH值调节至中性，随后用去离子水将总体积定容至6mL，得溶液A。取1mL上述溶液A，加入至3mL已溶解好的葡萄糖氧化酶溶液中混匀，得溶液B，葡萄糖氧化酶液浓度为0.5mg/mL。
另一方面，将73.4mg的四氯化锆粉末超声溶于4mL超纯水中，得四氯化锆溶液。将溶液B和四氯化锆溶液迅速混合，室温下搅拌24小时。反应结束后，12000rpm离心5min收集固体沉淀，用SDS溶液(0.1g/mL)洗涤2次，然后清水洗3次，随后进行冷冻干燥，时长12小时，获得白色产物UiO-66-F4@酶。此过程的蛋白封装效率由Bradford法商业化试剂盒进行检测。
(2)合成UiO-66-NH2@酶(即由强配体进行配体交换反应)
取45mg 2-氨基对苯二甲酸(强配体)溶于1.5mL质量分数为4％的氢氧化钾溶液中，然后用浓度为1M的盐酸调节溶液pH值至中性。向上述溶液中加入72mg步骤(1)中制备得到的UiO-66-F4@酶粉末，搅拌12h，进行充分的配体交换反应。12000rpm离心5min收集固体颗粒物后，使用去离子水洗涤多次，除去游离的四氟对苯二甲酸配体，随后进行冷冻干燥，时长12小时，获得棕色固体终产物UiO-66-NH2@酶。配体交换过程中的蛋白渗漏情况依然通过Bradford法商业化试剂盒进行检测分析。
实施例3：
一种利用UiO-66类金属有机框架原位封装生物酶的方法，包括以下步骤：
(1)合成UiO-66-F4@酶(即先由弱配体在水相环境中封装酶分子)
称取300mg的四氟对苯二甲酸溶于适量的超纯水中，然后使用质量分数为4％的氢氧化钾将该溶液pH值调节至中性，随后用去离子水将总体积定容至6mL，得溶液A。取1mL上述溶液A，加入至3mL已溶解好的过氧化氢酶溶液中混匀，得溶液B，过氧化氢酶液浓度为0.5mg/mL。
另一方面，将73.4mg的四氯化锆粉末超声溶于4mL超纯水中，得四氯化锆溶液。将溶液B和四氯化锆溶液迅速混合，室温下搅拌24小时。反应结束后，12000rpm离心5min收集固体沉淀，用SDS溶液(0.1g/mL)洗涤2次，然后清水洗3次，随后进行冷冻干燥，时长12小时，获得白色产物UiO-66-F4@酶。此过程的蛋白封装效率由Bradford法商业化试剂盒进行检测。
(2)合成UiO-66-NH2@酶(即由强配体进行配体交换反应)
取45mg 2-氨基对苯二甲酸(强配体)溶于1.5mL质量分数为4％的氢氧化钾溶液中，然后用浓度为1M的盐酸调节溶液pH值至中性。向上述溶液中加入72mg步骤(1)中制备得到的UiO-66-F4@酶粉末，搅拌12h，进行充分的配体交换反应。12000rpm离心5min收集固体颗粒物后，使用去离子水洗涤多次，除去游离的四氟对苯二甲酸配体，随后进行冷冻干燥，时长12小时，获得棕色固体终产物UiO-66-NH2@酶。配体交换过程中的蛋白渗漏情况依然通过Bradford法商业化试剂盒进行检测分析。
Claims (10)
1.一种利用UiO-66类金属有机框架制备固定化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将弱配体、金属盐和生物酶在溶液体系中混合反应，合成UiO-66类MOF结构，并将生物酶封装至UiO-66类MOF结构中，得到结构不稳定的MOF复合材料UiO-66-F4@酶；
(2)将所述MOF复合材料UiO-66-F4@酶浸于含强配体的中性溶液体系中，进行配体交换反应，制得固定化酶UiO-66-R@酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱配体包括四氟对苯二甲酸，所述金属盐包括四氯化锆。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强配体包括1,4-对苯二甲酸、氨基取代的对苯二甲酸、卤素取代的对苯二甲酸中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氨基取代的对苯二甲酸为2-氨基对苯二甲酸、2,5-二氨基对苯二甲酸中的一种或多种；所述卤素取代的对苯二甲酸为2-氯对苯二甲酸、2-溴对苯二甲酸、2-碘对苯二甲酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法操作均是在常温常压下进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的溶液体系均为水相环境体系或中性缓冲液体系。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物酶包括水解酶、氧化还原酶、裂解酶中的至少一种；所述水解酶包括脂肪酶、腈水解酶、蛋白酶中的一种或多种；所述氧化还原酶包括葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、过氧化氢酶中的一种或多种；所述裂解酶包括核酸酶、溶菌酶、丙酮酸脱羧酶、醛缩酶中的一种或多种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述弱配体、金属盐、生物酶的质量比为(29.8-37.6):(44.8-54.8):1，所述反应的时间为24-36小时；步骤(2)中，所述强配体与MOF复合材料UiO-66-F4@酶的质量比为(0.61-0.64):1，所述配体交换反应的时间为12-20小时。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将弱配体、金属盐和生物酶在溶液体系中混合反应具体包括以下步骤：将弱配体溶于水中，使用碱液调节pH值至中性，加水定容，得溶液A；向溶液A中加入生物酶溶液，混匀，得溶液B；再将所述溶液B与金属盐水溶液混合，室温下搅拌；
所述溶液A中弱配体与溶液A的质量体积比为(295-305mg):(5.8-6.2mL)；所述生物酶溶液的浓度为0.45-0.55mg/mL；所述金属盐水溶液的浓度为18-19.5mg/mL；所述碱液为质量分数为3-5％的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液；
经所述混合反应所得的反应体系通过离心收集固体，再经浓度为0.1-0.3g/mL的SDS溶液洗涤1-2次，清水洗涤2-3次，再经冷冻干燥得到MOF复合材料UiO-66-F4@酶。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含强配体的中性溶液体系由以下方法制备得到：将强配体溶于碱液中，用酸调节pH值至中性，即得；
所述强配体与碱液的质量体积比为(29.3-30.6)mg:(0.9-1.1)mL；所述碱液为质量分数为3-5％的氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液；所述酸为浓度为0.98-1.02M的盐酸；
所述配体交换反应时进行搅拌，经配体交换反应后的反应体系通过离心收集固体沉淀，经去离子水洗涤多次，再经冷冻干燥得到固定化酶UiO-66-R@酶。
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| 张玮玮;杨慧霞;薛屏;: "功能化磁性纳米粒子在固定化酶研究中的应用", 中国生物化学与分子生物学报, no. 04, pages 392 * |
| 张玮玮;杨慧霞;薛屏;: "功能化磁性纳米粒子在固定化酶研究中的应用", 中国生物化学与分子生物学报, vol. 36, no. 04, 30 April 2020 (2020-04-30), pages 392 - 400 * |
| 李天佑;: "金属有机骨架材料(MOFs)优化方法综述", 广州化工, vol. 48, no. 15, pages 58 * |
| 高霞;潘会宾;乔成芳;陈凤英;周元;杨文华;: "基于多级孔金属有机骨架构筑HRP固定化酶反应器及其染料降解应用", 高等学校化学学报, no. 07, pages 1591 - 1599 * |
| 高霞;潘会宾;乔成芳;陈凤英;周元;杨文华;: "基于多级孔金属有机骨架构筑HRP固定化酶反应器及其染料降解应用", 高等学校化学学报, vol. 41, no. 07, 10 July 2020 (2020-07-10), pages 1591 - 1599 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116496506A (zh) * | 2023-04-21 | 2023-07-28 | 武汉大学 | 一类具有超大原生三维笼结构的介孔晶态材料的制备方法及应用 |
| CN116496506B (zh) * | 2023-04-21 | 2024-05-03 | 武汉大学 | 一类具有超大原生三维笼结构的介孔晶态材料的制备方法及应用 |
| CN116982673A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-03 | 山东广元药业科技有限公司 | 一种含复合酶的饲料添加剂及其制备方法 |
| CN116982673B (zh) * | 2023-09-27 | 2024-02-20 | 山东广元药业科技有限公司 | 一种含复合酶的饲料添加剂及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114736895B (zh) | 2024-04-02 |
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