CN116982673A - 一种含复合酶的饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

一种含复合酶的饲料添加剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种含复合酶的饲料添加剂及其制备方法，属于饲料添加剂领域。所述含复合酶的饲料添加剂的制备方法，由以下步骤组成：载体预处理、第一酶固定处理、第二酶固定处理、植物源成分固定处理、制剂。本发明的含复合酶的饲料添加剂及其制备方法，能够提高复合酶中葡萄糖氧化酶‑过氧化氢酶的热稳定性和抗干扰能力，保证酶活性和施用效果；同时，进一步降低复合酶中葡萄糖氧化酶‑过氧化氢酶对畜禽动物消化道黏膜的刺激性，避免对畜禽动物消化系统的不利影响。

Description

一种含复合酶的饲料添加剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及饲料添加剂领域，尤其是涉及一种含复合酶的饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
霉菌毒素是霉菌的次级代谢产物，种类有几十种之多，在饲料的加工、运输和贮存过程中都会产生。养殖畜禽动物采食被霉菌毒素污染的饲料后，会引起畜禽动物免疫抑制、繁殖紊乱、内脏损伤等不良现象。比如黄曲霉素具有很强的致癌性，主要破坏畜禽动物的肝脏；赤霉烯酮，具有类似雌激素的作用，主要破坏畜禽动物的生殖器官；T-2毒素主要破坏畜禽动物免疫器官；呕吐毒素会影响畜禽动物的食欲，主要对消化器官造成损伤。同时，动物体内正常代谢产生的生物胺、饲料中添加的抗生素以及抗生素杀死肠道细菌后产生的内毒素等有毒物质，也难以完全在动物肝脏内被分解转化脱毒，其会进入动物血液导致正常生理机能紊乱。可以看出，霉菌毒素对养殖畜禽动物危害极大，会造成畜禽养殖业重大经济损失。同时，霉菌毒素还能够通过食物链进入人体，存在有致畸、致癌、致突变等潜在危险；比如奶牛摄入被黄曲霉素污染的饲料后，产生的牛奶中黄曲霉素含量大幅升高，该牛奶被人饮用后会进入人体，影响人的健康。因此，霉菌毒素污染畜禽动物饲料的问题，越来越受到现代化养殖业的重视，消除饲料中的霉菌毒素，保证养殖畜禽动物健康，对人们的食品健康安全具有重要意义。
现有技术中，葡萄糖氧化酶是一种用于饲料添加剂的酶类物质，其不仅能够帮助动物更好地消化和吸收葡萄糖，还能够破坏霉菌毒素的结构，使霉菌毒素失去活性，并配合动物肝脏代谢清理毒素。葡萄糖氧化酶能够将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢，但是过氧化氢的大量积累会影响葡萄糖氧化酶的活性，因此，现有技术中，通常将葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶联用，过氧化氢酶以葡萄糖氧化酶氧化生成的过氧化氢为底物，将其降解为水和氧气，进而保持葡萄糖氧化酶的活性，保证葡萄糖氧化酶的施用效果。
但是，发明人经研究发现，现有葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶在畜禽动物饲料的施用过程中，存在有热稳定性差的问题，葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶在饲料加工、储存过程中，易于受热降低活性，导致施用效果不佳；同时，葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶的抗干扰能力不理想，含有葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶的饲料被畜禽动物摄入后，胃酸环境、动物机体体温、饲料内其他元素（如抗生素、酚类物质）等因素会对葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶产生抑制作用，影响其活性和施用效果。进一步的，葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶还对畜禽动物的消化道黏膜具有一定的刺激性，针对于蛋鸡、妊娠母猪、奶牛等长周期饲喂动物，长期摄入会对其消化系统产生不利影响，不仅危害其机体健康，也影响动物的生产效率（如产奶效率、产蛋效率等）。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种含复合酶的饲料添加剂及其制备方法，能够提高复合酶中葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶的热稳定性和抗干扰能力，保证酶活性和施用效果；同时，进一步降低复合酶中葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶对畜禽动物消化道黏膜的刺激性，避免对畜禽动物消化系统的不利影响。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种含复合酶的饲料添加剂的制备方法，由以下步骤组成：载体预处理、第一酶固定处理、第二酶固定处理、植物源成分固定处理、制剂。
所述载体预处理的方法为，按3-4:5-6:0.2-0.25的重量份比值，将壳聚糖、纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）投入至5-7倍体积的去离子水中，超声分散均匀后，搅拌升温至40-50℃，保温搅拌2-3h后，投入聚乙烯醇PVA-117，继续搅拌30-50min后，以0.3-0.5mL/min的滴加速率，滴入戊二醛，至去离子水中戊二醛浓度为2-2.5wt%，保温搅拌14-18h后，滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无戊二醛，制得预处理载体。
所述载体预处理中，聚乙烯醇PVA-117的添加量为去离子水重量的0.6-0.7%。
所述第一酶固定处理的方法为，将预处理载体投入至6-7倍重量份的第一酶液中，升温至23-25℃，保温，100-120rpm搅拌2-3h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得第一冻干物；然后将第一冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第一分散液；将第一分散液投入至1.8-2.2倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至2-3倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第一酶固定物。
所述第一酶固定处理中，第一酶液的配置方法为：将浓度为14-15mg/mL的葡萄糖氧化酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得；
葡萄糖氧化酶原液中葡萄糖氧化酶活力为400-500U/g。
第一酶液中，葡萄糖氧化酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:11-12。
所述第一酶固定处理中，第一冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为16-18:0.15-0.2:100-110；
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为1.8-2wt%；
氯化钙溶液的浓度为0.1-0.12mol/L。
所述第二酶固定处理的方法为，将预处理载体投入至6-7倍重量份的第二酶液中，升温至23-25℃，保温，100-120rpm搅拌2-3h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得第二冻干物；然后将第二冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第二分散液；将第二分散液投入至1.8-2.2倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至2-3倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第二酶固定物。
所述第二酶固定处理中，第二酶液的配置方法为：将浓度为3.5-3.8mg/mL的过氧化氢酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得；
过氧化氢酶原液中过氧化氢酶活力为500-600U/g。
第二酶液中，过氧化氢酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:20-22。
所述第二酶固定处理中，第二冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为13-15:0.15-0.2:100-110；
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为1.8-2wt%；
氯化钙溶液的浓度为0.1-0.12mol/L。
所述植物源成分固定处理的方法为，将预处理载体干燥至恒重，在搅拌条件下，将干燥后的预处理载体、吐温-80投入至去离子水中，搅拌均匀，获得第三分散液；在搅拌条件下，以8-10mL/min的投料速率，将复合植物源成分液投入至第三分散液中；复合植物源成分液投入完成后，继续搅拌5-7h，喷雾干燥，制得植物源成分固定物。
所述植物源成分固定处理中，第三分散液中，干燥后的预处理载体、吐温-80、去离子水的重量份比值为14-16:0.2-0.25:100-110；
第三分散液与复合植物源成分液的体积比为1:0.4-0.45。
所述植物源成分固定处理中，复合植物源成分液为分散有厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的去离子水。复合植物源成分液中，厚朴提取物的添加量为去离子水重量的2.4-2.6wt%；木香提取物的添加量为去离子水重量的3-3.5wt%；甘草提取物的添加量为去离子水重量的2-2.2wt%；党参提取物的添加量为去离子水重量的2.4-2.6wt%；白术提取物的添加量为去离子水重量的3.5-4.0wt%；
厚朴提取物的粒径规格为80-100目，提取比例为10-20:1；
木香提取物的粒径规格为80-100目，提取比例为10-20:1；
甘草提取物的粒径规格为80-100目，提取比例为10-20:1；
党参提取物的粒径规格为80-100目，提取比例为10-20:1；
白术提取物的粒径规格为80-100目，提取比例为10-20:1。
所述制剂的方法为，将第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁混合均匀，制得含复合酶的饲料添加剂。
所述制剂中，第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁的重量份比值为40-45:40-45:10-12:0.15-0.2:0.2-0.25。
一种含复合酶的饲料添加剂，采用前述的制备方法制得。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，通过在载体预处理中将壳聚糖、纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）结合，经聚乙烯醇PVA-117和戊二醛处理后，分别对含有葡萄糖氧化酶的第一酶液和含有过氧化氢酶的第二酶液进行酶固定处理，制得第一酶固定物、第二酶固定物；以及采用预处理载体与复合植物源成分结合，进行植物源成分固定处理，制得植物源成分固定物；并将第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物配合用于饲料添加剂的制备中；能够提高复合酶中葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶的热稳定性和抗干扰能力，保证酶活性和施用效果；同时，进一步降低复合酶中葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶对畜禽动物消化道黏膜的刺激性，避免对畜禽动物消化系统的不利影响。
（2）本发明的含复合酶的饲料添加剂，在温度为65℃，相对湿度为70%环境中，静置168h后，酶活性衰减率为2.7-3.0%；在温度为40℃，pH=4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液中，静置24h后，酶活性衰减率为3.6-4.1%；在温度为40℃，浓度为100mg/L的磷酸替米考星水溶液中，静置24h后，酶活性衰减率为3.0-3.3%。
（3）采用本发明的含复合酶的饲料添加剂用于奶牛的饲喂过程中，在平均采食量为21.8-22.3kg/d条件下，奶牛日增重为185-197g，呕吐率为0%，腹泻率为0%，进食后对食道无刺激，进食1h后对食道无刺激，进食2h后对食道无刺激。
（4）采用本发明的含复合酶的饲料添加剂，与发霉饲料配合用于奶牛的饲喂过程中，在平均采食量为21.5-22.1kg/d条件下，奶牛日增重为171-182g，呕吐率为0%，腹泻率为0%；相比于常规饲料，产奶衰减率为4.4-5.4%，牛奶中黄曲霉素增加率为6.0-6.8%。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
实施例1
一种含复合酶的饲料添加剂的制备方法，具体为：
1、载体预处理
按3:5:0.2的重量份比值，将壳聚糖、纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）投入至5倍体积的去离子水中，超声分散均匀后，搅拌升温至40℃，保温搅拌2h后，投入聚乙烯醇PVA-117，继续搅拌30min后，以0.3mL/min的滴加速率，滴入戊二醛，至去离子水中戊二醛浓度为2wt%，保温搅拌14h后，滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无戊二醛，制得预处理载体。
其中，聚乙烯醇PVA-117的添加量为去离子水重量的0.6%。
2、第一酶固定处理
将预处理载体投入至6倍重量份的第一酶液中，升温至23℃，保温，100rpm搅拌2h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得第一冻干物；然后将第一冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第一分散液；将第一分散液投入至1.8倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至2倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第一酶固定物。
其中，第一酶液的配置方法为：将浓度为14mg/mL的葡萄糖氧化酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得。
葡萄糖氧化酶原液中葡萄糖氧化酶活力为400U/g。
第一酶液中，葡萄糖氧化酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:11。
第一冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为16:0.15:100。
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为1.8wt%。
氯化钙溶液的浓度为0.1mol/L。
3、第二酶固定处理
将预处理载体投入至6倍重量份的第二酶液中，升温至23℃，保温，100rpm搅拌2h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得第二冻干物；然后将第二冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第二分散液；将第二分散液投入至1.8倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至2倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第二酶固定物。
其中，第二酶液的配置方法为：将浓度为3.5mg/mL的过氧化氢酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得。
过氧化氢酶原液中过氧化氢酶活力为500U/g。
第二酶液中，过氧化氢酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:20。
第二冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为13:0.15:100。
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为1.8wt%。
氯化钙溶液的浓度为0.1mol/L。
4、植物源成分固定处理
将预处理载体干燥至恒重，在搅拌条件下，将干燥后的预处理载体、吐温-80投入至去离子水中，搅拌均匀，获得第三分散液；在搅拌条件下，以8mL/min的投料速率，将复合植物源成分液投入至第三分散液中；复合植物源成分液投入完成后，继续搅拌5h，喷雾干燥，制得植物源成分固定物。
其中，第三分散液中，干燥后的预处理载体、吐温-80、去离子水的重量份比值为14:0.2:100。
第三分散液与复合植物源成分液的体积比为1:0.4。
复合植物源成分液为分散有厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的去离子水。复合植物源成分液中，厚朴提取物的添加量为去离子水重量的2.4wt%；木香提取物的添加量为去离子水重量的3wt%；甘草提取物的添加量为去离子水重量的2wt%；党参提取物的添加量为去离子水重量的2.4wt%；白术提取物的添加量为去离子水重量的3.5wt%。
其中，厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的粒径规格均为80目，提取比例均为10:1。
5、制剂
将第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁混合均匀，制得含复合酶的饲料添加剂。
其中，第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁的重量份比值为40:42:10:0.15:0.2。
实施例2
一种含复合酶的饲料添加剂的制备方法，具体为：
1、载体预处理
按3.5:5.5:0.23的重量份比值，将壳聚糖、纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）投入至6倍体积的去离子水中，超声分散均匀后，搅拌升温至45℃，保温搅拌2.5h后，投入聚乙烯醇PVA-117，继续搅拌40min后，以0.4mL/min的滴加速率，滴入戊二醛，至去离子水中戊二醛浓度为2.2wt%，保温搅拌16h后，滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无戊二醛，制得预处理载体。
其中，聚乙烯醇PVA-117的添加量为去离子水重量的0.65%。
2、第一酶固定处理
将预处理载体投入至6.5倍重量份的第一酶液中，升温至24℃，保温，110rpm搅拌2.5h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得第一冻干物；然后将第一冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第一分散液；将第一分散液投入至2倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至2.5倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第一酶固定物。
其中，第一酶液的配置方法为：将浓度为14.5mg/mL的葡萄糖氧化酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得。
葡萄糖氧化酶原液中葡萄糖氧化酶活力为450U/g。
第一酶液中，葡萄糖氧化酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:11.5。
第一冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为17:0.18:105。
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为1.9wt%。
氯化钙溶液的浓度为0.11mol/L。
3、第二酶固定处理
将预处理载体投入至6.5倍重量份的第二酶液中，升温至24℃，保温，110rpm搅拌2.5h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得第二冻干物；然后将第二冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第二分散液；将第二分散液投入至2倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至2.5倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第二酶固定物。
其中，第二酶液的配置方法为：将浓度为3.7mg/mL的过氧化氢酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得。
过氧化氢酶原液中过氧化氢酶活力为550U/g。
第二酶液中，过氧化氢酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:21。
第二冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为14:0.17:105。
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为1.9wt%。
氯化钙溶液的浓度为0.11mol/L。
4、植物源成分固定处理
将预处理载体干燥至恒重，在搅拌条件下，将干燥后的预处理载体、吐温-80投入至去离子水中，搅拌均匀，获得第三分散液；在搅拌条件下，以9mL/min的投料速率，将复合植物源成分液投入至第三分散液中；复合植物源成分液投入完成后，继续搅拌6h，喷雾干燥，制得植物源成分固定物。
其中，第三分散液中，干燥后的预处理载体、吐温-80、去离子水的重量份比值为15:0.22:105。
第三分散液与复合植物源成分液的体积比为1:0.43。
复合植物源成分液为分散有厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的去离子水。复合植物源成分液中，厚朴提取物的添加量为去离子水重量的2.5wt%；木香提取物的添加量为去离子水重量的3.2wt%；甘草提取物的添加量为去离子水重量的2.1wt%；党参提取物的添加量为去离子水重量的2.5wt%；白术提取物的添加量为去离子水重量的3.7wt%。
其中，厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的粒径规格均为90目，提取比例均为20:1。
5、制剂
将第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁混合均匀，制得含复合酶的饲料添加剂。
其中，第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁的重量份比值为45:45:12:0.18:0.23。
实施例3
一种含复合酶的饲料添加剂的制备方法，具体为：
1、载体预处理
按4:6:0.25的重量份比值，将壳聚糖、纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）投入至7倍体积的去离子水中，超声分散均匀后，搅拌升温至50℃，保温搅拌3h后，投入聚乙烯醇PVA-117，继续搅拌50min后，以0.5mL/min的滴加速率，滴入戊二醛，至去离子水中戊二醛浓度为2.5wt%，保温搅拌18h后，滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无戊二醛，制得预处理载体。
其中，聚乙烯醇PVA-117的添加量为去离子水重量的0.7%。
2、第一酶固定处理
将预处理载体投入至7倍重量份的第一酶液中，升温至25℃，保温，120rpm搅拌3h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得第一冻干物；然后将第一冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第一分散液；将第一分散液投入至2.2倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至3倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第一酶固定物。
其中，第一酶液的配置方法为：将浓度为15mg/mL的葡萄糖氧化酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得。
葡萄糖氧化酶原液中葡萄糖氧化酶活力为500U/g。
第一酶液中，葡萄糖氧化酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:12。
第一冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为18:0.2:110。
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为2wt%。
氯化钙溶液的浓度为0.12mol/L。
3、第二酶固定处理
将预处理载体投入至7倍重量份的第二酶液中，升温至25℃，保温，120rpm搅拌3h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得第二冻干物；然后将第二冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第二分散液；将第二分散液投入至2.2倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至3倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第二酶固定物。
其中，第二酶液的配置方法为：将浓度为3.8mg/mL的过氧化氢酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得。
过氧化氢酶原液中过氧化氢酶活力为600U/g。
第二酶液中，过氧化氢酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:22。
第二冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为15:0.2:110。
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为2wt%。
氯化钙溶液的浓度为0.12mol/L。
4、植物源成分固定处理
将预处理载体干燥至恒重，在搅拌条件下，将干燥后的预处理载体、吐温-80投入至去离子水中，搅拌均匀，获得第三分散液；在搅拌条件下，以10mL/min的投料速率，将复合植物源成分液投入至第三分散液中；复合植物源成分液投入完成后，继续搅拌7h，喷雾干燥，制得植物源成分固定物。
其中，第三分散液中，干燥后的预处理载体、吐温-80、去离子水的重量份比值为16:0.25:110。
第三分散液与复合植物源成分液的体积比为1:0.45。
复合植物源成分液为分散有厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的去离子水。复合植物源成分液中，厚朴提取物的添加量为去离子水重量的2.6wt%；木香提取物的添加量为去离子水重量的3.5wt%；甘草提取物的添加量为去离子水重量的2.2wt%；党参提取物的添加量为去离子水重量的2.6wt%；白术提取物的添加量为去离子水重量的4.0wt%。
其中，厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的粒径规格均为100目，提取比例均为15:1。
5、制剂
将第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁混合均匀，制得含复合酶的饲料添加剂。
其中，第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁的重量份比值为42:40:11:0.2:0.25。
对比例1
采用实施例2的技术方案，其不同在于：1）载体预处理步骤中，省略纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）、聚乙烯醇PVA-117的使用；2）省略植物源成分固定处理步骤，以及在制剂步骤中，采用厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的混合物替代植物源成分固定物。
其中，厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的重量比为2.5:3.2:2.1:2.5:3.7。
对比例2
采用实施例2的技术方案，其不同在于：1）省略第二酶固定处理步骤，将第一酶固定处理步骤修改为：将预处理载体投入至6.5倍重量份的第一酶液中，升温至24℃，保温，110rpm搅拌2.5h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，投入至第二酶液中，升温至24℃，保温，110rpm搅拌2.5h后滤出固体物；采用足量的pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗固体物至滤液中无游离酶后，冷冻干燥，获得冻干物；然后将冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得分散液；将分散液投入至2倍体积的海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至2.5倍体积的氯化钙溶液中，搅拌固化，制得酶固定物。相应的，在制剂步骤中，采用酶固定物替代第一酶固定物和第二酶固定物。2）省略植物源成分固定处理步骤，以及省略制剂步骤中植物源成分固定物的添加。
对实施例1-3、对比例1-2制得的含复合酶的饲料添加剂的热稳定性、抗干扰能力进行检测。具体的，将浓度为0.001mol/L的靛蓝胭脂红溶液投入至2.5倍体积的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH=5.2）中，然后投入重量为乙酸-乙酸钠缓冲液3%的含复合酶的饲料添加剂，置于35℃的水浴环境中，保温5min后；投入等体积的葡萄糖溶液（浓度0.12mol/L，温度35℃），保温10min后，检测吸光度。采用上述方法，分别检测实施例1-3、对比例1-2制得的含复合酶的饲料添加剂的初始吸光度A1（即酶活性基准值）。
分别将实施例1-3、对比例1-2制得的含复合酶的饲料添加剂置于温度为65℃，相对湿度为70%环境中，静置168h后，采用前述方法分别检测吸光度A2（即热储存后的酶活性相对参考值）；计算酶活性衰减率以反映热稳定性能，所述酶活性衰减率的计算方法为：[(︱A1-A2︱)/A1]×100%。
分别将实施例1-3、对比例1-2制得的含复合酶的饲料添加剂置于温度为40℃，pH=4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液中，静置24h后，采用前述方法分别检测吸光度A3（即酸处理后的酶活性相对参考值）；计算酶活性衰减率以反映抗干扰能力，所述酶活性衰减率的计算方法为：[(︱A1-A3︱)/A1]×100%。
分别将实施例1-3、对比例1-2制得的含复合酶的饲料添加剂置于温度为40℃，浓度为100mg/L的磷酸替米考星水溶液中，静置24h后，采用前述方法分别检测吸光度A4（即抗生素处理后的酶活性参考值）；计算酶活性衰减率以反映抗干扰能力，所述酶活性衰减率的计算方法为：[(︱A1-A4︱)/A1]×100%。
具体检测结果如下：
进一步的，选取年龄相近，产犊后55-65天的健康成年奶牛50头，随机分为5组，每组10头，采用普通全价奶牛饲料进行常规饲喂，并在饲料中添加质量分数为4%的含复合酶的饲料添加剂，连续饲喂30天，统计饲喂期间（0-30d）的平均采食量、平均日增重、呕吐率、腹泻率、第一平均日产奶量，及第30天时牛奶中黄曲霉素含量；同时，分别在各奶牛进食后、进食1h后、进食2h后，采用食道黏膜探测器对奶牛的食道黏膜进行探测，判断食道刺激情况。
连续饲喂30天后，采用65wt%普通全价奶牛饲料+35wt%发霉的普通全价奶牛饲料进行常规饲喂，并在饲料中添加质量分数为4%的含复合酶的饲料添加剂，继续饲喂30天，统计饲喂期间（31-60d）的平均采食量、平均日增重、呕吐率、腹泻率、第二平均日产奶量，及第60天时牛奶中黄曲霉素含量。计算产奶衰减率、牛奶中黄曲霉素增加率。
其中，产奶衰减率的计算方法为：[（第一平均日产奶量-第二平均日产奶量）/第一平均日产奶量]×100%。
牛奶中黄曲霉素增加率的计算方法为：[（第60天时牛奶中黄曲霉素含量-第30天时牛奶中黄曲霉素含量）/第30天时牛奶中黄曲霉素含量]×100%。
具体结果如下：
可以看出，本发明的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，通过在载体预处理中将壳聚糖、纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）结合，经聚乙烯醇PVA-117和戊二醛处理后，分别对含有葡萄糖氧化酶的第一酶液和含有过氧化氢酶的第二酶液进行酶固定处理，制得第一酶固定物、第二酶固定物；以及采用预处理载体与复合植物源成分结合，进行植物源成分固定处理，制得植物源成分固定物；并将第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物配合用于饲料添加剂的制备中；能够提高复合酶中葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶的热稳定性和抗干扰能力，保证酶活性和施用效果；同时，进一步降低复合酶中葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶对畜禽动物消化道黏膜的刺激性，避免对畜禽动物消化系统的不利影响。
通过对比例1可以看出，相比于实施例1-3，其在载体预处理步骤中，省略纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）、聚乙烯醇PVA-117的使用；以及省略植物源成分固定处理步骤，并直接添加植物源成分后，对于葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的固定效果，以及第一酶固定物、第二酶固定物中酶的配合效果，以及对动物消化系统的刺激性均出现不同程度的劣化；同时，饲料添加剂中有效成分的热稳定性、抗干扰能力也出现明显降低；具体表现为热储存、酸处理、抗生素处理后酶活性的降低；以及在奶牛饲喂过程中，刺激奶牛消化道，且在奶牛进食发霉饲料后，无法有效祛除、富集霉菌毒素，导致牛奶中黄曲霉素增加、产奶量降低等情况发生。
通过对比例2可以看出，相比于实施例1-3，其省略第二酶固定处理步骤，在采用预处理载体对葡萄糖氧化酶进行酶固定处理后，继续进行过氧化氢酶的酶固定处理；同时，省略植物源成分固定物的制备及添加。酶固定物中葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶的配合效果降低，且无法与植物源成分配合消除葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶及发霉饲料对动物消化系统的刺激和不利影响。具体表现为热储存、酸处理、抗生素处理后酶活性的略微衰退；以及在奶牛饲喂过程中，出现对奶牛消化道的轻微刺激；且在奶牛进食发霉饲料后，出现日增重降低、呕吐率上升、腹泻率上升、牛奶中黄曲霉素增加、产奶量降低。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法，由以下步骤组成：载体预处理、第一酶固定处理、第二酶固定处理、植物源成分固定处理、制剂；
所述载体预处理的方法为，将壳聚糖、纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）投入至去离子水中，分散均匀后，搅拌升温至40-50℃，保温搅拌；投入聚乙烯醇PVA-117，继续搅拌；滴入戊二醛，至去离子水中戊二醛浓度为2-2.5wt%，保温搅拌14-18h后，滤出固体物；固体物经乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗，制得预处理载体；
所述第一酶固定处理的方法为，将预处理载体投入至第一酶液中，升温至23-25℃，保温搅拌后滤出固体物；固体物经乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗，冷冻干燥，获得第一冻干物；然后将第一冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第一分散液；将第一分散液投入至海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第一酶固定物；
所述第一酶液，为分散有葡萄糖氧化酶的乙酸-乙酸钠缓冲液；
所述第二酶固定处理的方法为，将预处理载体投入至第二酶液中，升温至23-25℃，保温搅拌后滤出固体物；固体物经乙酸-乙酸钠缓冲液淋洗，冷冻干燥，获得第二冻干物；然后将第二冻干物、吐温-80投入至去离子水中分散均匀，获得第二分散液；将第二分散液投入至海藻酸钠囊壁液中，搅拌均匀后，喷雾至氯化钙溶液中，搅拌固化，制得第二酶固定物；
所述第二酶液，为分散有过氧化氢酶的乙酸-乙酸钠缓冲液；
所述植物源成分固定处理的方法为，将预处理载体干燥至恒重，在搅拌条件下，将干燥后的预处理载体、吐温-80投入至去离子水中，搅拌均匀，获得第三分散液；在搅拌条件下，将复合植物源成分液投入至第三分散液中；复合植物源成分液投入完成后，继续搅拌，喷雾干燥，制得植物源成分固定物；
所述复合植物源成分液，为分散有厚朴提取物、木香提取物、甘草提取物、党参提取物、白术提取物的去离子水；
所述制剂的方法为，采用第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物，制得含复合酶的饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述载体预处理中，壳聚糖、纳米羟基磷灰石、UiO-66-NH2（Zr）的重量份比值为3-4:5-6:0.2-0.25；
戊二醛的滴加速率为0.3-0.5mL/min；
聚乙烯醇PVA-117的添加量为去离子水重量的0.6-0.7%。
3.根据权利要求1所述的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述第一酶固定处理中，预处理载体与第一酶液的重量比为1:6-7；
第一分散液与海藻酸钠囊壁液的体积比为1:1.8-2.2；
第一酶液的配置方法为，将浓度为14-15mg/mL的葡萄糖氧化酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得；
葡萄糖氧化酶原液中葡萄糖氧化酶活力为400-500U/g；
第一酶液中，葡萄糖氧化酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:11-12。
4.根据权利要求1所述的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述第一酶固定处理中，第一冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为16-18:0.15-0.2:100-110；
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为1.8-2wt%；
氯化钙溶液的浓度为0.1-0.12mol/L。
5.根据权利要求1所述的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述第二酶固定处理中，预处理载体与第二酶液的重量比为1:6-7；
第二分散液与海藻酸钠囊壁液的体积比为1:1.8-2.2；
第二酶液的配置方法为，将浓度为3.5-3.8mg/mL的过氧化氢酶原液投入至pH=5.7的乙酸-乙酸钠缓冲液中，分散均匀制得；
过氧化氢酶原液中过氧化氢酶活力为500-600U/g；
第二酶液中，过氧化氢酶原液与乙酸-乙酸钠缓冲液的体积比为1:20-22。
6.根据权利要求1所述的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述第二酶固定处理中，第二冻干物、吐温-80、去离子水的重量份比值为13-15:0.15-0.2:100-110；
海藻酸钠囊壁液为分散有海藻酸钠的去离子水；海藻酸钠囊壁液中，海藻酸钠浓度为1.8-2wt%；
氯化钙溶液的浓度为0.1-0.12mol/L。
7.根据权利要求1所述的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述植物源成分固定处理中，复合植物源成分液的投料速率为8-10mL/min；
第三分散液中，干燥后的预处理载体、吐温-80、去离子水的重量份比值为14-16:0.2-0.25:100-110；
第三分散液与复合植物源成分液的体积比为1:0.4-0.45。
8.根据权利要求1所述的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述植物源成分固定处理中，复合植物源成分液中，厚朴提取物的添加量为去离子水重量的2.4-2.6wt%；木香提取物的添加量为去离子水重量的3-3.5wt%；甘草提取物的添加量为去离子水重量的2-2.2wt%；党参提取物的添加量为去离子水重量的2.4-2.6wt%；白术提取物的添加量为去离子水重量的3.5-4.0wt%。
9.根据权利要求1所述的含复合酶的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述制剂的方法为，将第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁混合均匀，制得含复合酶的饲料添加剂；
第一酶固定物、第二酶固定物、植物源成分固定物、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁的重量份比值为40-45:40-45:10-12:0.15-0.2:0.2-0.25。
10.一种含复合酶的饲料添加剂，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的制备方法制得。
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GR01 Patent grant
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