CN106987580A - 一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸‑锌及其制备及应用 - Google Patents

一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸‑锌及其制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新材料技术领域，具体涉及一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸‑锌及其制备及应用。本发明将谷氨酸二钠水溶液逐滴加入到Zn(NO3)2的甲醇溶液中得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸‑锌；该方法具有谷氨酸‑锌晶体生成速度快、制备条件温和、制备得到的产物晶型好等特点，可以用于脂肪酶、蛋白酶、环氧化物水解酶等一系列含丰富氨基的酶，并具有作为蛋白质药物载体的潜质。将该产物加入到用EDC或EDC·HCl和NHS修饰后的黑曲霉脂肪酶磷酸缓冲液中震荡固定化，得到固定化黑曲霉脂肪酶。该方法固定化效率高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等。

Description

一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌及其制备及应用
本发明专利申请是申请号为“201610113094.2”的分案申请，原申请的申请日为“2016年02月29日”，申请号为“201610113094.2”，发明名称为“一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌及其制备及应用”。
技术领域
本发明属于新材料技术领域，具体涉及一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌及其制备及应用。
背景技术
金属-有机骨架材料(MOF)固定化酶是国内外的研究热点因为其独特多样的拓扑结构、孔隙度以及物理特性。金属有机骨架材料具有多孔、大比表面积和多金属位点等诸多性能，在气体贮存、分子分离、催化、药物缓释等领域有较好的应用前景。目前金属-有机骨架材料固定化酶常用的是封装和物理吸附的方法将酶固定在中孔载体上，采用的有机配体大多数为传统有机配体，但是随着MOF在固定化酶领域研究的深入，要求MOF是由具有生物相容性的模块构筑而成并且是环境友好型的生物相容金属有机骨架材料(MBiOF)。传统的合成谷氨酸-锌(Zn(L-Glu)(H2O)]H2O)的方法为水热法，采用谷氨酸与锌盐反应。谷氨酸是一种酸性氨基酸具有两个羧基和一个氨基，这些官能团均可与金属中心结合从而使得谷氨酸作为有机配体具有多种协调模式。谷氨酸与金属离子Zn2+生成Zn(L-Glu)(H2O)]H2O的速度取决于谷氨酸的羧基官能团与Zn2+的接触速度。而谷氨酸在冷水和有机溶剂中的溶解度都较小且其为弱酸不易电离为-COO-，导致与Zn2+生成Zn(L-Glu)(H2O)]H2O的速度非常缓慢。
发明内容
为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌。
本发明的再一目的在于提供上述生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌在酶固定化领域中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种固定化黑曲霉脂肪酶。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌的制备方法，包含如下步骤：
将谷氨酸二钠溶液逐滴加到含有Zn(NO3)2的甲醇中，滴加完成后离心分离并洗涤，干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌(Zn(L-Glu)(H2O)]H2O)；
所述的谷氨酸二钠溶液中的谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比为1:(1～3)；
所述的谷氨酸二钠溶液与甲醇的体积比为1：(0.5～10)；
所述的含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的浓度优选为0.05mol/L；
所述的干燥优选为冷冻干燥；
一种生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌，通过上述制备方法制备得到；
所述的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌在酶固定化领域中的应用；
一种固定化黑曲霉脂肪酶，是将上述生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌作为固定化载体，对黑曲霉脂肪酶进行固定化得到；
所述的固定化黑曲霉脂肪酶的制备方法，包含如下步骤：
(1)将黑曲霉脂肪酶分散在pH为5～9的缓冲溶液中，得到酶溶液；
(2)在10～35℃下，将EDC或EDC·HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)加入到步骤(1)所得的酶溶液中搅拌0.5～5h，得到混合溶液A；
(3)在10～35℃下，将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入到步骤(2)所得的混合溶液A中搅拌0.5～5h，得到混合溶液B；
(4)将步骤(3)中所得的混合溶液B与上述载体生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌混合，在10～35℃下搅拌固定1～12h，得到固定化黑曲霉脂肪酶；
步骤(1)中所述的黑曲霉脂肪酶优选为黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外产黑曲霉脂肪酶或细胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的发酵液；
步骤(1)中所述的缓冲液优选为磷酸缓冲液；
步骤(1)中所述的酶溶液的浓度优选为20mg/mL；
步骤(2)中所述的EDC或EDC·HCl与酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的质量比为(1～3):20；
步骤(2)中所述的EDC或EDC·HCl与酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的质量比优选为1：10；
步骤(3)中所述的NHS与酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的质量比为(1～4):20；
步骤(3)中所述的NHS与酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的质量比优选为3:25；
步骤(4)中所述的混合溶液B中的黑曲霉脂肪酶与载体的质量比优选为0.5:1；
步骤(2)、(3)、(4)中所述的搅拌的速率为50～300rpm；
一种黑曲霉脂肪酶制剂，是将上述固定化黑曲霉脂肪酶冷冻干燥后得到；
本发明原理：
本发明用易溶于水的谷氨酸二钠盐代替谷氨酸，使羧基转变为-COO-，然后将其与Zn2+混合，由于其均为溶液大大增加了二者的接触机会和速度从而提高了Zn(L-Glu)(H2O)]H2O的生成速度，而甲醇的存在，更利于生成的Zn(L-Glu)(H2O)]H2O结晶从而节省大量的时间。Zn(L-Glu)(H2O)]H2O纳米晶体表面含有游离的氨基，而脂肪酶蛋白中含有游离的羧基，二者较难主动脱水缩合生成酰胺键。通过用耦合剂EDC或EDC·HCl和NHS对酶进行修饰使得脂肪酶的羧基和Zn(L-Glu)(H2O)]H2O纳米晶体表面含有游离的氨基较快的发生脱水缩合反应生成酰胺键，从而实现脂肪酶的固定化，形成一种特定结构的固定化酶。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明使用常温易溶的谷氨酸二钠代替微溶的谷氨酸作为原料，降低了反应温度，反应条件温和，谷氨酸-锌晶体生成速度快，操作简便，极大地缩短了反应时间，降低了制备Zn(L-Glu)(H2O)]H2O纳米晶体的成本。
(2)本发明制备方法所制备的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌材料晶型好、用于固定化脂肪酶载酶量高等优点。
(3)本发明提供的定化黑曲霉脂肪酶的制备方法，操作简便，反应温和、成本较低、固定化效率高、酶的稳定性好、载酶量高，酶活回收率高。能够用于脂肪酶、蛋白酶、环氧化物水解酶等一系列含丰富氨基的酶，并具有作为蛋白质药物载体的潜质。
附图说明
图1是实施例1中制备的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌晶体冷冻干燥后的SEM图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将15mL含有1.8mmol的谷氨酸二钠水溶液逐滴加入到45mL含有3mmol Zn(NO3)2的甲醇中(谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比3:5；谷氨酸二钠水溶液与甲醇的体积比1:3，含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的浓度为0.05mol/L)，立即得到白色沉淀，离心分离并洗涤后冷冻干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌载体材料(Zn(L-Glu)(H2O)]H2O)(图1)；
(2)将黑曲霉脂肪酶分散在pH为8的磷酸缓冲液中，得到酶溶液(20mg/mL)；
(3)在25℃下，将2mg的EDC·HCl加入到1mL酶溶液中150rpm搅拌1h，得到混合溶液A；
(4)在25℃下，将2.4mg的NHS加入到步骤(3)所得的混合溶液A中继续搅拌1h，得到混合溶液B；
(5)取44mg步骤(1)所得的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌与步骤(4)中所得混合溶液B混合，在25℃下150rpm搅拌固定3.5h，得到固定化黑曲霉脂肪酶；其中，酶活回收率98.021％，该载体(生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌)的负载量为153mg酶/g载体。
实施例2
(1)将15mL含有1.5mmol谷氨酸二钠的水溶液逐滴加入到45mL含有3mmol Zn(NO3)2的甲醇中(谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比1:2；谷氨酸二钠水溶液与甲醇的体积比1:3，含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的浓度为0.05mol/L)，立即得到白色沉淀，离心分离并洗涤后冷冻干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌载体材料(Zn(L-Glu)(H2O)]H2O)；
(2)将黑曲霉脂肪酶分散在pH为8的磷酸缓冲液中，得到酶溶液(20mg/mL)；
(3)在25℃下，将2mg的EDC·HCl加入到1mL酶溶液中150rpm搅拌1h，得到混合溶液A；
(4)在25℃下，将2.4mg的NHS加入到步骤(3)所得的混合溶液A中继续150rpm搅拌1h，得到混合溶液B；
(5)取44mg步骤(1)所得的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌与步骤(4)中所得混合溶液B混合，在25℃下150rpm搅拌固定3.5h，得到固定化黑曲霉脂肪酶；其中，酶活回收率90.109％，该载体(生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌)的负载量为123.3mg酶/g载体。
实施例3
(1)将15mL含有1.0mmol谷氨酸二钠的水溶液逐滴加入到45mL含有3mmol Zn(NO3)2的甲醇中(谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比1:3；谷氨酸二钠水溶液与甲醇的体积比1:3，含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的浓度为0.05mol/L)，立即得到白色沉淀，离心分离并洗涤后冷冻干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌载体材料(Zn(L-Glu)(H2O)]H2O)；
(2)将黑曲霉脂肪酶分散在pH为8的磷酸缓冲液中，得到酶溶液(20mg/mL)；
(3)在25℃下，将2mg的EDC·HCl加入到1mL酶溶液中150rpm搅拌1h，得到混合溶液A；
(4)在25℃下，将2.4mg的NHS加入到步骤(3)所得的混合溶液A中继续150rpm搅拌1h，得到混合溶液B；
(5)取44mg步骤(1)所得的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌与步骤(4)中所得混合溶液B混合，在25℃下150rpm搅拌固定3.5h，得到固定化黑曲霉脂肪酶；其中，酶活回收率88.345％，该载体(生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌)的负载量为100.2mg酶/g载体。
实施例4
(1)将45mL含有2.7mmol谷氨酸二钠的水溶液逐滴加入到45mL含有4.5mmol Zn(NO3)2的甲醇中(谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比3:5；谷氨酸二钠水溶液与甲醇的体积比1:1，含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的浓度为0.05mol/L)，立即得到白色沉淀，离心分离并洗涤后冷冻干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌载体材料(Zn(L-Glu)(H2O)]H2O)；
(2)将黑曲霉脂肪酶分散在pH为8的磷酸缓冲液中，得到酶溶液(20mg/mL)；
(3)在10℃下，将2mg的EDC·HCl加入到1mL酶溶液中150rpm搅拌5h，得到混合溶液A；
(4)在10℃下，将2.4mg的NHS加入到步骤(3)所得的混合溶液A中继续150rpm搅拌5h，得到混合溶液B；
(5)取44mg步骤(1)所得的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌与步骤(4)中所得混合溶液B混合，在10℃下150rpm搅拌固定1h，得到固定化黑曲霉脂肪酶；其中，酶活回收率76.247％，该载体(生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌)的负载量为90.7mg酶/g载体。
(6)进一步冷冻干燥后得到黑曲霉脂肪酶制剂。
实施例5
(1)将22.5mL含有2.025mmol谷氨酸二钠的水溶液逐滴加入到45mL含有3.375mmolZn(NO3)2的甲醇中(谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比3:5；谷氨酸二钠水溶液与甲醇的体积比1:2，含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的浓度为0.05mol/L)，立即得到白色沉淀，离心分离并洗涤后冷冻干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌载体材料(Zn(L-Glu)(H2O)]H2O)；
(2)将黑曲霉脂肪酶分散在pH为8的磷酸缓冲液中，得到酶溶液(20mg/mL)；
(3)在35℃下，将2mg的EDC·HCl加入到1mL酶溶液中300rpm搅拌0.5h，得到混合溶液A；
(4)在35℃下，将2.4mg的NHS加入到步骤(3)所得的混合溶液A中继续300rpm搅拌2h，得到混合溶液B；
(5)取44mg步骤(1)所得的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌与步骤(4)中所得混合溶液B混合，在35℃下300rpm搅拌固定12h，得到固定化黑曲霉脂肪酶；其中，酶活回收率80.245％，该载体(生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌)的负载量为110.5mg酶/g载体。
(6)进一步冷冻干燥后得到黑曲霉脂肪酶制剂。
实施例6
(1)将9mL含有1.62mmol谷氨酸二钠的水溶液逐滴加入到45mL含有2.7mmol Zn(NO3)2的甲醇中(谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比3:5；谷氨酸二钠水溶液与甲醇的体积比1:5，含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的浓度为0.05mol/L)，立即得到白色沉淀，离心分离并洗涤后冷冻干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌载体材料(Zn(L-Glu)(H2O)]H2O)；
(2)将黑曲霉脂肪酶分散在pH为8的磷酸缓冲液中，得到酶溶液(20mg/mL)；
(3)在25℃下，将2mg的EDC·HCl加入到1mL酶溶液中150rpm搅拌1h，得到混合溶液A；
(4)在25℃下，将2.4mg的NHS加入到步骤(3)所得的混合溶液A中继续150rpm搅拌1h，得到混合溶液B；
(5)取44mg步骤(1)所得的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌与步骤(4)中所得混合溶液B混合，在25℃下150rpm搅拌固定3.5h，得到固定化黑曲霉脂肪酶；其中，酶活回收率81.563％，该载体(生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌)的负载量为102.6mg酶/g载体。
(6)进一步冷冻干燥后得到黑曲霉脂肪酶制剂。
对比实施例1
(1)将15mL含有1.8mmol的谷氨酸二钠水溶液逐滴加入到45mL含有3mmol Zn(NO3)2的乙醇中(谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比3:5；谷氨酸二钠水溶液与乙醇的体积比1:3，含有Zn(NO3)2的乙醇中Zn(NO3)2的浓度为0.05mol/L)，得到白色沉淀，离心分离并洗涤后冷冻干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌载体材料，该材料结晶不好、无定形状态以及团聚现象严重，以其为载体固定化黑曲霉脂肪酶(具体操作步骤同实施例1)负载量低仅为35.4mg酶/g载体。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌在酶固定化领域中的应用，其特征在于：所述的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌通过如下方法制备得到：将谷氨酸二钠溶液逐滴加到含有Zn(NO3)2的甲醇中，滴加完成后离心分离并洗涤，干燥，得到生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌。
2.根据权利要求1所述的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌在酶固定化领域中的应用，其特征在于：所述的谷氨酸二钠溶液中的谷氨酸二钠与Zn(NO3)2的摩尔比为1:(1～3)。
3.根据权利要求1所述的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌在酶固定化领域中的应用，其特征在于，所述的谷氨酸二钠溶液与甲醇的体积比为1：(0.5～10)。
4.根据权利要求1所述的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌在酶固定化领域中的应用，其特征在于：所述的应用为在固定化黑曲霉脂肪酶中的应用。
5.一种固定化黑曲霉脂肪酶，基于权利要求1～3任一项所述的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌在酶固定化领域中的应用得以实现，其特征在于：将生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌作为固定化载体，对黑曲霉脂肪酶进行固定化得到。
6.权利要求5所述的固定化黑曲霉脂肪酶的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将黑曲霉脂肪酶分散在pH为5～9的缓冲溶液中，得到酶溶液；
(2)在10～35℃下，将EDC或EDC·HCl加入到步骤(1)所得的酶溶液中搅拌0.5～5h，得到混合溶液A；
(3)在10～35℃下，将NHS加入到步骤(2)所得的混合溶液A中搅拌0.5～5h，得到混合溶液B；
(4)将步骤(3)中所得的混合溶液B与权利要求3所述的生物相容金属有机骨架材料谷氨酸-锌混合，在10～35℃下搅拌固定1～12h，得到固定化黑曲霉脂肪酶。
7.根据权利要求6所述的固定化黑曲霉脂肪酶的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的黑曲霉脂肪酶为黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外产黑曲霉脂肪酶或细胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的发酵液。
8.根据权利要求6所述的固定化黑曲霉脂肪酶的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的EDC或EDC·HCl与酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的质量比为(1～3):20。
9.根据权利要求6所述的固定化黑曲霉脂肪酶的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的NHS与酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的质量比为(1～4):20。
10.根据权利要求6所述的固定化黑曲霉脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的混合溶液B中的黑曲霉脂肪酶与载体的质量比为0.5:1。
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