CN114712894B - 一种糖化血红蛋白层析柱的活化液、活化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及离子交换色谱柱的应用领域，提供了一种糖化血红蛋白层析柱的活化液、活化方法和应用。该活化液，由红细胞和溶血剂混合制得，其特征在于：所述红细胞与溶血剂的体积比为1：1～1：40；所述溶血剂为0.02％～0.2％w/v的防腐剂溶液或浓度为0.025％～0.9％w/v的氯化钠或季铵盐溶液。该活化方法的特征在于：在使用活化液测试后对层析柱进行空样测试洗脱，所述洗脱液为PH在5.0～6.5的酸性缓冲液，包括但不限于MES缓冲液、柠檬酸缓冲液。本发明克服了现有技术的不足，设计合理，解决了现有的糖化血红蛋白层析柱活化过程繁琐、耗时长、各组分保留时间不稳定的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及离子交换色谱柱的应用领域，特别是涉及一种糖化血红蛋白层析柱的活化液、活化方法和应用。
背景技术
糖化血红蛋白(HbA1c)是血红蛋白与血清中的糖类(主要是葡萄糖)通过非酶反应产生的，糖化血红蛋白的含量是由过去而非即时的血糖浓度决定的，而与患者是否空腹、是否使用胰岛素或抽血时间等因素无关。因而糖化血红蛋白的含量在糖尿病治疗及其并发症监测中具有重要价值。
使用离子交换高压液相色谱HPLC(high pressure liquid chromatography)来测定糖化血红蛋白的百分含量，目前被认为是分析HbA1c的金标准。HPLC检测方法因其快速、简便、精密度好,准确度高，线性范围宽等优点，受到越来越多用户的欢迎。现阶段用于糖化血红蛋白分析的色谱柱多采用高压匀浆法填制，即将填料悬浮在适宜的匀浆液中制成匀浆，在其尚未沉降之前，迅速以高压泵将其以高流速压进柱管中，制成填充均匀的层析柱。
目前，采用高压匀浆法制成的层析柱装填完成后，直接用层析柱进行糖化血红蛋白分析测试时无法产生正常的组分吸收峰(如图1所示)，不能直接用于样品分析，需要经过一系列“活化”过程，达到层析柱的正常应用状态(如图2所示)。这一“活化”过程原为使用装填完成的层析柱对样本进行正常测试，随着测试次数的增加，其分析图谱各组分的吸收峰由只有一个大吸收峰至开始出现较弱的各组分吸收峰。当测试达到几百甚至上千次后，糖化血红蛋白的各组分吸收峰才可被独立分离出，且各组分出峰时间飘移速度减弱。此过程繁琐且仍有各组分保留时间不稳定的风险。
为此，我们提出一种糖化血红蛋白层析柱的活化液、活化方法和应用。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法和应用，克服了现有技术的不足，设计合理，解决了现有的糖化血红蛋白层析柱活化过程繁琐、耗时长、各组分保留时间不稳定的技术问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种糖化血红蛋白层析柱的活化液，由红细胞和溶血剂混合制得，其特征在于：
所述红细胞与溶血剂的体积比为1：1～1：40；
所述溶血剂为0.02％～0.2％w/v的防腐剂溶液，所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、乙二胺四乙酸二钠、亚硝酸钠、柠檬酸钾及肝素钠，或者，所述溶血剂为0.025％～0.9％w/v的氯化钠或季铵盐溶液。
进一步的，所述红细胞为人红细胞。
优选地，所述人红细胞通过待测血液样品经离心或静置的方法分离得到。
进一步的，红细胞和溶血剂混合制备的活化液经过纯化处理，纯化过程包括离心和过滤；
离心条件包括，离心力10000～20000g，离心时间10～40min，离心温度4～30℃；
过滤条件包括，滤孔尺寸为0.2～0.8μm。
一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法，其特征在于：包括层析柱的活化，使用待活化的层析柱进行上述活化液的高效液相色谱分析测试，测试5～30次，之后使用洗脱液进行空样测试，直至分析图谱基线为0，获得活化的层析柱；
所述洗脱液为PH在5.0～6.5的酸性缓冲液，包括但不限于MES缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPSO缓冲液。
进一步的，所述洗脱液浓度为0.50％～10％(w/v)。
进一步的，所述活化方法还包括层析柱的测试，使用活化后的层析柱进行待测血液样本的高效液相色谱分析测试，对同一个样本进行重复测试10～50次，当最后连续10次测试结果，CV≤3％且Hb-A1c的保留时间(RT)极差＜2s，表明层析柱活化完成。
上述活化液在糖化血红蛋白层析柱的活化方法中的应用。
上述活化方法在人血样本的糖化血红蛋白测试中的应用。
(三)有益效果
本发明实施例提供了一种糖化血红蛋白层析柱的活化液、活化方法和应用，具备以下有益效果：
(1)采用高倍浓缩的活化液来活化用于糖化血红蛋白检测的层析柱，可实现层析柱由装填至稳定应用状态的快速转变，大幅减少活化测试次数，缩短活化时间，提高检测效率；而且使用活化后的层析柱进行测试的各组分保留时间保持稳定；
(2)若活化液中红细胞的比例大于1:1，则有活化过程中，分析仪过滤片或层析柱筛板堵塞的风险；若比例小于1:40，则有活化后RT飘移的风险。
附图说明
图1为层析柱未经活化，直接进行糖化血红蛋白分析测试后的图谱；
图2为层析柱经过现有方法活化后，进行糖化血红蛋白分析测试后的图谱；
图3为本发明实施例1的糖化血红蛋白分析测试后的图谱；
图4为本发明实施例2的糖化血红蛋白分析测试后的图谱；
图5为本发明实施例3的糖化血红蛋白分析测试后的图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂和设备说明：
新鲜血样本：本公司员工捐献。
洗脱液：在500ml的超纯水中加入3.20g吗啉乙磺酸(MES)，混合搅拌，获得0.64％的MES溶液洗脱液，调节PH至5.0～6.5。
0.03％叠氮钠溶液：在100ml的超纯水中加入0.03g叠氮钠，混合搅拌，获得0.03％叠氮钠溶液。
0.25％的氯化钠溶液：在100ml的超纯水中加入0.25g氯化钠，混合搅拌，获得0.25％的氯化钠溶液。
待活化的层析柱：博慧斯生物医药科技有限公司，型号为BH-CC12。层析柱为磺酸基阳离子交换色谱柱/层析柱，柱型(尺寸)：4.6×20mm，粒径尺寸：5μm。
糖化血红蛋白分析仪：博慧斯生物医药科技有限公司，型号为BH-60。检测原理：高效液相色谱法(HPLC)，检测器：UV415nm，样本测试温度：38～40℃，检测项目：Hb-A1c(s-A1C)、HbF，测试范围3％～20％。
糖化血红蛋白分析仪的稀释模式所对应的高效液相色谱测试过程：
将盛有活化液稀释杯的管架放在糖化血红蛋白分析仪的待测区，点击启动键，仪器将自动识别为稀释模式并开始测试。
糖化血红蛋白分析仪的标准模式所对应的高效液相色谱过程：
将放有抗凝管的管架放在糖化血红蛋白分析仪的待测区，点击启动键，仪器将自动识别为标准模式并开始测试。
实施例1
一种糖化血红蛋白层析柱的活化液，其由以下方法制备得到：
第一步、红细胞和溶血剂混合，将2ml新鲜血样本静置24h后去除上层血清，取下层红细胞1ml置于50ml离心管中，用40ml的浓度为0.03％的叠氮钠溶液稀释红细胞，并静置10min以达到完全溶血的效果(即红细胞胞内物质全部溶出)，获得初混的活化液。
第二步、活化液纯化，将第一步制备的初混的活化液用离心机进行离心纯化，离心力为10000g，离心温度为4℃，离心时间30min。离心后取上层清液于50ml的烧杯中，用规格为0.25μm的一次性针头过滤器过滤后，获得纯化的活化液。
一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法，包括以下步骤：
第一步、层析柱的活化，将本实施例制备的纯化后的活化液置于4个稀释杯中，每个稀释杯中2ml，作为活化液样本。将待活化的层析柱装载于糖化血红蛋白分析仪中，稀释模式下重复测试20次活化液样本，之后标准模式下，使用浓度为0.64％的洗脱液测试空抗凝管18次，基线为0，获得活化的层析柱。若基线不为0，则层析柱中可能有血红蛋白残留，会影响层析柱正常使用时的样本分析，比如出峰杂乱，无法正常计算Hb-A1c的含量。
第二步、层析柱的测试，将第一步活化完成后的层析柱用于正常待测全血样本(即本实施例制备活化液所用新鲜血样本)测试。将正常待测全血样本装在全自动糖化血红蛋白分析仪中，点击启动，选择标准模式开始样本测试，在样本测试30次后停止测试，计算后10次测试结果的CV与Hb-A1c的RT极差，CV为0.2％，RT极差为0.3s，表明活化完成。样本测试第30次的测试图谱如图3所示，RT为27.15s。
实施例2：
一种糖化血红蛋白层析柱的活化液，其由以下方法制备得到：
第一步、红细胞和溶血剂混合，将10ml新鲜血样本在8℃条件下通过3000g离心力离心，去除上层血清，取下层红细胞5ml置于50ml离心管中，用5ml的浓度为0.25％的氯化钠溶液稀释红细胞，并搅拌6min以达到完全溶血的效果，获得初混的活化液。
第二步、活化液纯化，将第一步制备的初混的活化液用离心机进行离心纯化，离心力为20000g，离心温度为10℃，离心时间25min。离心后取上层清液于25ml的烧杯中，用规格为0.8μm的过滤器过滤，获得纯化的活化液。
一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法，包括以下步骤：
第一步、层析柱的活化，将本实施例制备的纯化后的活化液置于8个样品杯中，每个样品杯中1ml，作为活化液样本。将待活化的层析柱装载于糖化血红蛋白分析仪中，稀释模式下测试10次活化液样本，之后标准模式下，使用浓度为0.64％的洗脱液测试空抗凝管15次，基线为0，获得活化的层析柱。
第二步、层析柱的测试，将活化完成后的层析柱用于正常待测全血样本(即本实施例制备活化液所用新鲜血样本)测试。将正常待测全血样本装在全自动糖化血红蛋白分析仪中，点击启动，选择标准模式开始样本测试，在样本测试20次后停止测试，计算后10次测试结果的CV与Hb-A1c的RT极差，CV为0.37％，RT极差为0.4s，表明活化完成。样本测试第20次的测试图谱如图4所示，RT为29.35s。
实施例3：
一种糖化血红蛋白层析柱的活化液，其由以下方法制备得到：
第一步、红细胞和溶血剂混合，将6ml新鲜血样本在8℃条件下通过3000g离心力离心5min，去除上层血清，取下层红细胞3ml置于50ml离心管中，用27ml的浓度为0.25％的氯化钠溶液稀释红细胞，并搅拌6min以达到完全溶血的效果，获得初混的活化液。
第二步、活化液纯化，将第一步制备的初混的活化液用离心机进行离心纯化，离心力为15000g，离心温度为4℃，离心时间25min。离心后取上层清液于50ml的烧杯中，用规格为0.4μm的过滤器过滤，获得纯化的活化液。
一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法，包括以下步骤：
第一步、层析柱的活化，将本实施例制备的纯化后的活化液置于10个样品杯中，每个样品杯中1ml，作为活化液样本。将待活化的层析柱装载于糖化血红蛋白分析仪中，稀释模式下测试15次活化液样本，之后标准模式下，使用浓度为0.64％的洗脱液测试空抗凝管16次，基线为0，获得活化的层析柱。
第二步、层析柱的测试，将活化完成后的层析柱用于正常待测全血样本(即本实施例制备活化液所用新鲜血样本)测试。将正常待测全血样本装在全自动糖化血红蛋白分析仪中，点击启动，选择标准模式开始样本重复测试，在样本重复测试25次后停止测试，计算后10次测试结果的CV与Hb-A1c的RT极差，CV为0.31％，RT极差为0.3s，表明层析柱活化完成。样本测试第25次的测试图谱如图5所示，RT为22.75s。
由图3～图5可见，本发明活化后的层析柱出峰时间稳定，能够有效避免各组分出峰时间飘移的问题，该方法具有很好的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法，所述层析柱为磺酸基阳离子交换层析柱，其特征在于：包括层析柱的活化，使用待活化的层析柱进行活化液的高效液相色谱分析测试，测试5~30次，之后使用洗脱液进行空样测试，直至分析图谱基线为0，获得活化的层析柱；
所述活化液由红细胞和溶血剂混合制得，所述红细胞与溶血剂的体积比为1：1~1：40；所述溶血剂为0.02%~0.2% w/v的防腐剂溶液，所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、乙二胺四乙酸二钠、亚硝酸钠、柠檬酸钾及肝素钠，或者，所述溶血剂为0.025%~0.9% w/v的氯化钠或季铵盐溶液；
红细胞和溶血剂混合制备的活化液经过纯化处理，纯化过程包括离心和过滤；
离心条件包括，离心力10000~20000g，离心时间10~40min，离心温度4~30℃；
过滤条件包括，滤孔尺寸为0.2~0.8μm；
所述洗脱液为PH在5.0~6.5的酸性缓冲液，包括但不限于MES缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPSO缓冲液；
所述活化方法还包括层析柱的测试，使用活化后的层析柱进行待测血液样本的高效液相色谱分析测试，对同一个样本进行重复测试10~50次，当最后连续10次测试结果，CV≤3%且Hb-A1c的保留时间极差＜2s，表明层析柱活化完成。
2.如权利要求1所述的一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法，其特征在于：所述洗脱液浓度为0.50%~10% w/v。
3.如权利要求1所述的一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法，其特征在于：所述红细胞为人红细胞。
4.如权利要求3所述的一种糖化血红蛋白层析柱的活化方法，其特征在于：所述人红细胞通过待测血液样品经离心或静置的方法分离得到。
5.如权利要求1或2所述的活化方法在人血样本的糖化血红蛋白测试中的应用。
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