CN114539310A - 一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，包括，硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶；磷脂溶解：取磷脂样品溶解于乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂为粗磷脂酰乙醇胺，其中磷脂酰乙醇胺含量76％，磷脂酰胆碱含量大于10％；硅胶吸附：在磷脂溶液中加入活化后的硅胶，搅拌吸附、过滤，取上清液浓缩干燥，制得吸附后样品；丙酮洗涤：将吸附后样品中加入冷丙酮进行洗涤，分离洗涤液和固形物，将固形物真空脱溶，即得高纯度磷脂酰乙醇胺。本发明工艺简单，原料处理量大，能实现工业化大规模生产，制得的磷脂酰乙醇胺纯度大于90％，有利于解决技术瓶颈问题，满足市场对高纯度磷脂酰乙醇胺的需求。
Description
技术领域
本发明属于磷脂深加工领域，具体涉及到一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法。
背景技术
磷脂酰乙醇胺(PE)又称脑磷脂，属于氨基磷脂，可作为乳化剂，应用于化妆品、食品工业。随着研究的不断深入，磷脂酰乙醇胺的生理功能被不断发现，具有抗氧化、维持线粒体形态等功能，也能改善智力、促进大脑发育、改善神经运动障碍综合症，在医药工业的应用越来越广泛。
高纯度的磷脂酰乙醇胺不仅自身可以作为脂质体制剂的重要辅料，也可以制备衍生物如DOPE、POPE等，用于脂质体制备。高纯度的磷脂酰乙醇胺还具有pH敏感性，可制备pH敏感脂质体，对肿瘤的治疗具有靶向性。也可作为仿生涂层，包覆于生物医用材料植入物表面，具有抗菌作用。
现有的制备磷脂酰乙醇胺的方法主要有溶剂萃取法、超临界流体萃取法和柱层析法等。溶剂萃取法和超临界流体萃取法得到的磷脂酰乙醇胺纯度不高，一般仍含有磷脂酰胆碱等杂质。柱层析法虽然制得的磷脂酰乙醇胺纯度较高，但是处理量小，无法进行工业化生产。如中国专利CN109096327和中国专利CN104592293通过硅胶柱层析制得纯度90％以上的磷脂酰乙醇胺，但是溶剂消耗大，产品得率低，且采用三元混合溶剂洗脱，溶剂难以回收。中国专利CN109438508通过溶剂萃取、金属离子沉淀、大孔树脂层析结合的方法制备磷脂酰乙醇胺，产品纯度达65％，操作复杂且磷脂酰乙醇胺纯度低。目前，关于去除磷脂酰乙醇胺中混杂的磷脂酰胆碱的方法仍然主要是柱层析法。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中针对目前市场磷脂酰乙醇胺纯度较低，且难以进行工业化生产等问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，包括，
硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶；
磷脂溶解：取磷脂样品溶解于乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂为粗磷脂酰乙醇胺，其中磷脂酰乙醇胺含量76％，磷脂酰胆碱含量大于10％；
硅胶吸附：在磷脂溶液中加入活化后的硅胶，搅拌吸附、过滤，取上清液浓缩干燥，制得吸附后样品；
丙酮洗涤：将吸附后样品中加入冷丙酮进行洗涤，分离洗涤液和固形物，将固形物真空脱溶，即得高纯度磷脂酰乙醇胺。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述硅胶，其粒径为100～200目。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述加热活化，其温度为110℃，时间为1.5h。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述乙醇溶液，体积分数90％～100％的乙醇。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述磷脂溶液，其中，磷脂样品与乙醇溶液料液比以g/mL计为1:20～1:50。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述在磷脂溶液中加入活化后的硅胶，其中，磷脂与活化后的硅胶的质量比以g/g计为1:0.5～1:2。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述搅拌吸附，搅拌吸附时间为15～60min，搅拌吸附温度为25～45℃，吸附次数为1～5次。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述将吸附后样品中加入冷丙酮进行洗涤，其中，丙酮温度为-20℃，洗涤方式为超声辅助洗涤。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述洗涤次数为3～5次。
作为本发明所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法的一种优选方案，其中：所述磷脂样品与丙酮料液比以g/mL计为1:3～1:10。
本发明有益效果：
(1)本发明为去除磷脂酰乙醇胺中的磷脂酰胆碱杂质，制备高纯度磷脂酰乙醇胺提供了一种可行的方法，高纯度磷脂酰乙醇胺可用于医药工业，能显著改善脂质体膜的相变温度、粒径、抑制脂质体的氧化，提高脂质体稳定性。
(2)本发明工艺简单，原料处理量大，能实现工业化大规模生产，制得的磷脂酰乙醇胺纯度大于90％，有利于解决技术瓶颈问题，满足市场对高纯度磷脂酰乙醇胺的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明磷脂原料的HPLC图。
图2为本发明磷脂原料硅胶吸附后的HPLC图。
图3为本发明高纯度磷脂酰乙醇胺产品的HPLC图。
图4为本发明PE标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明中硅胶购买国药集团化学试剂有限公司，柱层析用，100-200目，其他原料均为普通市售产品。
本发明HPLC测定磷脂组分及含量：
(1)HPLC条件：Si-60色谱柱(250nm×4.6nm×5μm)，柱温40℃，流速1.0mL/min,载气流速：2L/min；检测器：蒸发光检测器，漂移管温度：72℃，进样量：10μL；流动相A：甲醇:水:冰醋酸：三乙胺(85:15:0.45:0.05，v/v/v/v)，流动相B：正己烷:异丙醇:流动相A(20:48:32，v/v/v)，梯度洗脱程序见表1。将PE标准品进样，记录出峰时间，根据标准品的保留时间对磷脂样品定性，采用外标法定量。
表1高效液相色谱流动相洗脱梯度
(2)标准溶液的配制：
将PE标准品用氯仿-甲醇(2:1)溶解、稀释和定容为20mg/mL的PE标准母液。分别吸取0.2mL、0.5mL、0.8mL、1.2mL、1.5mL、2.0mL PE标准母液于10mL容量瓶中，用氯仿-甲醇(2:1)混合溶液定容，配成浓度为0.4mg/mL、1mg/mL、1.6mg/mL、2.4mg/mL、3mg/mL、4.0mg/mL的PE标准液。将配制好的不同浓度的PE标准溶液以10μL进样，测定各组分的峰面积，以对照品溶液浓度的对数值与相应的峰面积对数值计算回归方程。
PE标准曲线见图4，以峰面积的对数Lg(S)和浓度的对数Lg(c)进行线性拟合，PE的回归方程为y＝0.5914x+2.2019，R2＝0.9968，在0.4mg/mL～4mg/mL线性关系良好，见图4。
实施例1
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于300mL乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％，图1为磷脂原料的HPLC图；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶15g，45℃水浴条件下搅拌吸附30min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品，图2为磷脂原料硅胶吸附后的HPLC图；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，得到高纯度的磷脂酰乙醇胺4.8g，纯度为94.65％，图3为高纯度磷脂酰乙醇胺产品的HPLC图。
实施例2
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于300mL乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶15g，35℃水浴条件下搅拌吸附45min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，得到高纯度的磷脂酰乙醇胺4.5g，纯度为93.63％。
实施例3
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于500mL体积分数为98％的乙醇中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶15g，45℃水浴条件下搅拌吸附30min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，得到高纯度的磷脂酰乙醇胺5.3g，纯度为88.26％。
实施例4
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于300mL体积分数为98％的乙醇中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶20g，45℃水浴条件下搅拌吸附60min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入50mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，得到高纯度的磷脂酰乙醇胺4.1g，纯度为85.99％。
实施例5
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于300mL乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶2g，45℃水浴条件下搅拌吸附30min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品，硅胶吸附后磷脂酰乙醇胺纯度76.87％；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，磷脂酰乙醇胺纯度为81.77％，得到产品7.0g。
实施例6
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于300mL乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶30g，45℃水浴条件下搅拌吸附30min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品，硅胶吸附后磷脂酰乙醇胺纯度75.76％；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，磷脂酰乙醇胺纯度为79.75％，得到产品3.8g。
实施例7
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于100mL乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶15g，45℃水浴条件下搅拌吸附30min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，磷脂酰乙醇胺纯度为81.84％，得到产品3.2g。
实施例8
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于300mL乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶15g，45℃水浴条件下搅拌吸附90min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，磷脂酰乙醇胺纯度为82.50％，得到产品5.1g。
实施例9
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于300mL乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶15g，15℃水浴条件下搅拌吸附30min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，磷脂酰乙醇胺纯度为81.99％，得到产品4.5g。
实施例10
本实施例提供一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，主要步骤：
(1)硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶，加热活化温度为110℃，时间为1.5h；
(2)磷脂溶解：取磷脂样品10g溶解于300mL乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂样品为粗磷脂酰乙醇胺，其中，磷脂酰乙醇胺含量76.56％，磷脂酰胆碱含量12.66％；
(3)硅胶吸附：在(2)中制得的磷脂溶液中加入活化后的硅胶15g，55℃水浴条件下搅拌吸附30min，过滤，过滤后的滤液于50℃下真空脱溶，制得吸附后样品；
(4)丙酮洗涤：将(3)制得的吸附后样品中加入30mL-20℃的冷丙酮洗涤三次，所得固形物在50℃下真空干燥，得到磷脂酰乙醇胺纯度为83.84％，得到产品5.4g。
本发明方法首次提出一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，磷脂酰乙醇胺的含量高，达到90％以上，且工艺简单。与传统柱层析相比处理量大，溶剂用量少；本发明优选磷脂与活化后的硅胶的质量比，实现最佳的提取效果；本发明通过-20℃的丙酮相比4℃下的丙酮，能更多地去除脂质。
综上，本发明首次提出了一种硅胶吸附去除磷脂酰乙醇胺中混杂的磷脂酰胆碱杂质，以制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，操作简单，溶剂用量少，样品处理量大，易于工业化生产。对磷脂酰乙醇胺纯化及其在医药工业的应用具有重要意义。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：包括，
硅胶活化：将硅胶加热活化，制得活化后的硅胶；
磷脂溶解：取磷脂样品溶解于乙醇溶液中，制得磷脂溶液；磷脂为粗磷脂酰乙醇胺，其中磷脂酰乙醇胺含量76％，磷脂酰胆碱含量大于10％；
硅胶吸附：在磷脂溶液中加入活化后的硅胶，搅拌吸附、过滤，取上清液浓缩干燥，制得吸附后样品；
丙酮洗涤：将吸附后样品中加入冷丙酮进行洗涤，分离洗涤液和固形物，将固形物真空脱溶，即得高纯度磷脂酰乙醇胺。
2.如权利要求1所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：所述硅胶，其粒径为100～200目。
3.如权利要求1或2所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：所述加热活化，其温度为110℃，时间为1.5h。
4.如权利要求1所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：所述乙醇溶液，体积分数90％～100％的乙醇。
5.如权利要求1或4所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：所述磷脂溶液，其中，磷脂样品与乙醇溶液料液比以g/mL计为1:20～1:50。
6.如权利要求1所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：所述在磷脂溶液中加入活化后的硅胶，其中，磷脂与活化后的硅胶的质量比以g/g计为1:0.5～1:2。
7.如权利要求1或6所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：所述搅拌吸附，搅拌吸附时间为15～60min，搅拌吸附温度为25～45℃，吸附次数为1～5次。
8.如权利要求1所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：所述将吸附后样品中加入冷丙酮进行洗涤，其中，丙酮温度为-20℃，洗涤方式为超声辅助洗涤。
9.如权利要求8所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：洗涤次数为3～5次。
10.如权利要求1、8或9所述吸附法制备高纯度磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：磷脂样品与丙酮料液比以g/mL计为1:3～1:10。
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