CN110870882B - 一种分离制备银杏叶提取物中银杏黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

一种分离制备银杏叶提取物中银杏黄酮的方法。活性炭能有效将银杏叶提取物中的银杏内酯和银杏黄酮分开，活性炭吸附银杏总黄酮的性能极佳，最大吸附量为195.8 mg/g活性炭，但活性炭吸附银杏黄酮后产生了死吸附，利用不同浓度的乙醇等其他溶剂都无法达到解吸附作用。本发明建立了活性炭解吸银杏黄酮的方法和工艺研究，为实现银杏黄酮回收利用提供了一条可行的方法。适宜的解吸工艺条件为：洗脱液乙醇浓度为73.4%，氨水浓度5.7%，洗脱温度31.5℃，洗脱体积约为4倍柱体积。在此条件下银杏黄酮的解吸率达到70%以上。

Description

一种分离制备银杏叶提取物中银杏黄酮的方法

技术领域

本发明涉及天然产物深加工技术领域，尤其涉及活性炭分离制备银杏内酯和银杏黄酮及解吸活性炭吸附的银杏黄酮的方法。

背景技术

银杏叶提取物具有显著的生物活性和重要的应用价值，银杏黄酮是一种天然自由基清除剂和血管扩张剂，能显著降低缺血缺氧和衰老过程中过多自由基对心脑组织细胞的损伤，并能促进血液流变学的改善。银杏内酯是强效血小板活化因子（PAF）拮抗剂，可有效阻止心脑血管动脉粥样硬化内壁的异常血小板聚积和血栓形成，改善局部微循环，白果内酯具有神经元保护作用，可改善神经递质和受体结合力。现有银杏药品、大健康产品大都是以符合中国药典标准的银杏叶提取物（EGB）为主要原料进行开发研制。基于银杏总黄酮和银杏总内酯在生物活性上有着明显的差异，以功能为导向分别开发银杏内酯、银杏黄酮的药品或保健品，有望能实现银杏叶提取物功能的专一化、价值的高值化，产品的多元化。

银杏内酯是临床上治疗中枢神经和心血管等相关疾病最有效的天然药物之一，以银杏内酯为主要有效成分的注射液等产品已被国家药品监督管理局批准进入临床研究或已作为一种新药应用到临床中。因此，高得率、低成本的银杏内酯制备技术已成为相关产品开发、利用的关键。

目前还没有一种有效的方法用来同步分离制备银杏内酯和银杏黄酮，优选后的少数大孔树脂能较好地吸附银杏黄酮和银杏内酯，并能较好地通过乙醇梯度洗脱下来，但吸附和解吸银杏黄酮和银杏内酯的性能类似，区分度低，靠筛选大孔吸附树脂和改变用于洗脱的乙醇浓度无法将两者有效分离。聚酰胺树脂对银杏叶提取物EGB中黄酮和内酯的吸附、解吸附性能存在较大差异，有望能成为一种可行方法，但现有技术不够成熟，且制备成本高。现有相关企业生产银杏内酯的工艺之一就是采用活性炭吸附法，但存在的问题是活性炭吸附银杏叶提取物后，银杏内酯能被乙醇洗脱下来，而银杏黄酮形成死吸附，从而导致不能有效利用银杏黄酮，并增加了活性炭的使用量。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种分离制备银杏叶提取物中银杏黄酮的方法，建立了解吸活性炭银杏黄酮的工艺，实现了银杏黄酮有效回收利用。本发明为实现同步制备银杏内酯和银杏黄酮、解决目前生产面临的技术瓶颈提供技术支撑。

技术方案：一种分离制备银杏叶提取物中银杏黄酮的方法，银杏叶提取物经活性炭吸附后，通过含有1 wt.%-9 wt.%氨水的醇溶液洗脱获得银杏黄酮。

上述方法具体步骤为：用10wt.%-20wt.%醇溶解银杏叶提取物，利用活性炭在弱酸性或酸性的条件下，于25-35℃吸附银杏黄酮，分别用10%醇和40%醇洗涤后；再利用40wt.%-80wt.%醇及1wt.%-9wt.%氨水，在25-55℃条件下，洗脱吸附在活性炭中的银杏叶提取物中银杏黄酮，洗脱液体积为4倍柱体积。

优选的，上述醇为乙醇。

优选的，上述吸附银杏黄酮的pH值为5。

优选的，上述吸附银杏黄酮的温度为30℃。

优选的，上述洗脱步骤中醇浓度为73.4%。

优选的，上述洗脱步骤中氨水浓度为5.7%。

优选的，上述洗脱步骤中洗脱温度为31.5℃。

有益效果：目前活性炭吸附银杏叶提取物后，银杏内酯能被乙醇洗脱下来，而银杏黄酮形成死吸附，从而导致不能有效利用银杏黄酮，并增加了活性炭的使用量。本发明建立的一种分离制备银杏叶提取物中银杏黄酮的方法，操作简单，能有效解吸活性炭中银杏黄酮，且解吸率高，在适宜条件下达到70%以上。

附图说明

图1 活性炭对EGB中银杏黄酮的静态吸附曲线；

图2 pH对活性炭静态吸附银杏黄酮的影响；

图3 氨水浓度对洗脱率的影响；

图4 乙醇浓度对洗脱率的影响；

图5 洗脱温度对洗脱率的影响；

图6 液体体积对洗脱率的影响；

图7 两因素交互作用对总黄酮解吸率影响的响应面图；

图8 70 %乙醇（B）和70 %乙醇+5 %氨水（C）洗脱液水解HPLC图（A 1.槲皮素，2.山柰酚，3.异鼠李素）；

图9 活性炭加氨水解吸黄酮前后微观形貌图（A1、A2为70%乙醇洗脱后放大1000和2000倍，B1、B2为加氨水解吸后放大1000和2000倍图，标尺为10 μm）；

图10 活性炭对银杏黄酮的静态解吸曲线；

图11 活性炭吸附银杏黄酮不同乙醇浓度洗脱动态解吸曲线。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

一种分离制备银杏叶提取物中银杏黄酮的方法，利用活性炭吸附银杏黄酮；利用一定浓度的醇及一定浓度的氨水，在适宜的条件下，洗脱吸附在活性炭中的银杏叶提取物中银杏黄酮。包括如下步骤：

1．建立活性炭静态吸附和解吸银杏总黄酮的方法。准确称取活性炭于磨口三角瓶中，称取银杏叶提取物用10%乙醇100 mL溶解，在不同时间下取样，测定其银杏总黄酮吸附量和柱载量。再将静态吸附饱和的树脂用20%乙醇洗2遍，添加5%氨水的洗脱液静态解吸，不同时间点下取样，测定其银杏黄酮解吸量。通过考察活性炭吸附银杏黄酮的吸附量随时间变化关系，掌握静态吸附过程的三个阶段，0-10 min黄酮吸附指数增加，线性增长周期，10-90 min临近吸附的平衡状态，为缓慢增长周期，90 min以后吸附和解吸量基本稳定在固定值。

2．研究pH值对活性炭吸附银杏黄酮的影响。将上样液的pH值调为不同酸度，称取活性炭和银杏叶提取物，用10%乙醇溶解。充分吸附达到平衡后，取样测定活性炭吸附银杏黄酮的量。结果表明，在弱酸性或酸性条件下有利于吸附效果，在pH值为5时候吸附量最大。

3．分析活性炭吸附银杏黄酮的等温线，确定最佳吸附温度。称取多份活性炭，分别加入质量不同质量的银杏叶提取物，在不同温度下达到吸附平衡后，测定银杏黄酮的浓度，以平衡吸附量为纵坐标，以平衡浓度为横坐标，得到不同条件下的吸附等温线。结果采用Langmuir方程和Freundlich方程进行拟合。Freundlich方程和Langmuir 方程表明活性炭对银杏总黄酮吸附较容易，且活性炭对于银杏黄酮的吸附更偏向于单层吸附。适宜吸附温度为25-35℃，最佳吸附温度为30℃。

4．研究活性炭吸附银杏黄酮的解吸工艺。

（1）单因素实验：每组称取银杏叶提取物溶于20%乙醇水溶液，采用活性炭吸附，以水为溶剂，氨水-乙醇-蒸馏水溶液体积、氨水浓度、乙醇浓度、提取温度进行单因素实验。最佳氨水浓度在5 %时达到最大值，乙醇浓度在70 %时活性炭解吸银杏黄酮解吸率取得最大值，黄酮解吸率随着温度的增加迅速增大，35 ℃比较合适，黄酮解吸率随液体体积的增大而升高，当液体体积呈线性增加，当液体体积超过一定量后增速缓慢。

（2）响应面法优化活性炭解吸银杏黄酮工艺：每组称取银杏叶提取物溶于20%乙醇溶液，用活性炭饱和吸附。根据单因素实验结果和Box-Behnken 设计原理，洗脱时选取液体体积、氨水浓度、乙醇浓度、提取温度等四因素三水平进行研究。银杏总黄酮提取量为响应值进行四因素三水平响应面设计实验。其中，乙醇浓度为40-80%，氨水浓度1-9%，洗脱温度为25-55℃。通过软件对数据进一步分析确定最佳条件和回归模型，获得活性炭中银杏黄酮的解吸最佳工艺条件为：洗脱液体积为116.75 mL，乙醇浓度为73.4 %，洗脱温度为31.5℃，氨水浓度5.7 %。在此条件下得到的理论总黄酮解吸率为73.25 %。按最优条件进行三次试验验证，所有活性炭吸附银杏黄酮的解吸率为74.56%±1.24 %。

5．建立动态解吸活性炭吸附的银杏黄酮规律。称取活性炭，装入层析柱中，称取银杏叶提取物，用10%乙醇溶解，充分吸附后，分别用10%乙醇和40%乙醇洗涤后分别用不同乙醇浓度+5%氨水进行洗脱。随着时间的增加，活性炭对银杏黄酮的解吸量显著增大，整个过程分为三个阶段，0-10 min黄酮解吸量指数增加，线性增长周期，10-90 min临近解吸的平衡状态，为缓慢增长周期，90 min以后解吸量基本稳定在固定值。40%乙醇+5%氨水洗脱2BV（柱体积）时黄酮浓度最高，60%乙醇+5%氨水2 BV洗脱后虽然银杏黄酮维持平缓，但是浓度显著下降。

实施例1

1.材料与仪器

1.1试剂及材料

银杏叶提取物 （符合2015药典版标准）；活性炭（符合国家一级标准的光华牌GH-15颗杏壳炭，粒度为25-50目）；无水乙醇（≥99.7% 分析纯南京化学试剂有限公司）；槲皮素、山柰酚和异鼠李素均购买于四川成都曼斯特生物公司。

1.2仪器

COXEM-30PLUS扫描电镜（韩国库赛姆公司）；Autosorb-iQ2吸附仪(美国Quantachrome公司)；摇床（ZHWY-2102C上海智成分析仪器制造有限公司）；Agilent1260Series，高效液相色谱仪，Aglient G1311C四元泵，AilgentG1329B自动进样器，Chenmstation C.01.01色谱工作站；色谱柱，Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)（美国Aglient公司）；数显恒温水浴锅（HH-4国华电器有限公司）；超声波清洗器（KH3200B昆山禾创超声仪器有限公司）；HPLC-UV（美国安捷伦公司）；3cm×30 cm层析柱（大光明试剂有限公司）；旋转蒸发仪（上海金叶仪器有限公司）。

2 方法

2.1活性炭静态吸附和解吸曲线测定

活性炭吸附解吸的动力学曲线测定：准确称取活性炭1.5 g置于250 mL具塞磨口三角瓶中，精密加入1.5 g的EGB，用10%乙醇100 mL溶解，避光密封，置恒温振荡器中，在 30℃条件下，以180 r/min 振荡，分别在10、20、30、60、90、120、150、180、240、300 和360 min时候取样1 mL，测定其银杏总黄酮吸附量和柱载量。

将静态吸附饱和的树脂用20%乙醇200 mL洗涤2遍，加80%乙醇+5%氨水的200 mL洗脱液静态解吸，在30 ℃条件下，以180 r/min振荡，分别在10、20、30、60、90、120、150、180、240、300 和360 min的时候取样1mL，测定其银杏黄酮解吸量。

pH值对活性炭吸附银杏黄酮的影响

将EGB上样液的pH值调为3、5、7和9等，精密称取活性炭0.2 g，EGB 0.2 g用10%乙醇100 mL溶解。避光密封，置恒温振荡器中，在30 ℃条件下，以180 r/min振荡6 h达到吸附平衡后，取样测定活性炭吸附银杏黄酮的量。2.2活性炭吸附银杏黄酮的等温线

称取三组5份0.3 g活性炭，分别加入质量为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g的EGB，每组分别在25 ℃，30 ℃和35 ℃下，在180 r/min恒温振荡器中震荡6 h，达到吸附平衡后，测定银杏黄酮的浓度，以平衡吸附量为纵坐标，以平衡浓度为横坐标，得到不同条件下的吸附等温线。实验结果采用Langmuir方程和Freundlich方程进行拟合：

2.3活性炭的SEM结构表征

分别取吸附后活性炭和解吸后活性炭对比，样品经处理后分别在1000和2000放大倍数下用SEM拍照。

2.4活性炭吸附银杏黄酮的动态解吸曲线

称取活性炭约30 g，装入层析柱中（柱高约为10 cm，直径为3 cm，体积为70 mL），称取EGB约20 g，配成50 mg/mL含10%乙醇的液体400 mL，充分吸附6 h后，分别用10%乙醇和40%乙醇洗涤140 mL后，分别用40%乙醇+5%氨水，60%乙醇+5%氨水和80%乙醇+5%氨水洗脱，控制流速为2 BV/h。间隔7 mL取样1 mL，收集所有洗脱液浓缩为固形物冷藏。以银杏总黄酮的含量为纵坐标，以洗脱体积作为横坐标作解吸动态曲线。

2.5活性炭分离银杏黄酮工艺研究

2.5.1单因素实验

每组均取0.75 gEGB溶于50 mL的20%乙醇水溶液，以1.5 g活性炭吸附，用于洗脱实验。以水为溶剂，氨水-乙醇-蒸馏水溶液体积、氨水浓度、乙醇浓度、提取温度进行单因素实验。实验方案设计如下：

溶液体积对提取率的影响实验：50 mL，75 mL，100 mL，125 mL，150 mL。

氨水浓度对提取率的影响实验：1%，3%，5%，7%，9%。

乙醇浓度对提取率的影响实验：40%，50%，60%，70%，80%。

提取温度对提取率的影响实验：25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，45 ℃，50 ℃，55 ℃。

2.5.2响应面法优化活性炭解吸银杏黄酮工艺

每组均取0.75 g EGB溶于50mL的20%乙醇溶液，以1.5 g活性炭吸附，用于洗脱实验。根据单因素实验结果和Box-Behnken 设计原理，洗脱时选取液体体积、氨水浓度、乙醇浓度、提取温度等四因素三水平进行研究。银杏总黄酮提取量为响应值进行四因素三水平响应面设计实验。如表1、2：

2.6银杏黄酮标样和供试品制备

取银杏总黄酮粗品液（粗品5 mL甲醇溶解）100 μL并补25%盐酸甲醇溶液至1 mL，于70 ℃水浴中进行酸水解2 h。将水解后的样品经0.22μm的有机滤膜过滤待测。

2.7银杏总黄酮苷测定方法

紫外检测器(UV)，检测波长360 nm；流动相，甲醇-水(梯度)，流速0.8 mL/min；柱温，30 ℃，进样量，10 μL，运行时间33 min。流动相条件见表3。

标准贮备液：精确称取槲皮素、山柰酚和异鼠李素标准品各50 mg置于100 mL棕色容量瓶中，用少量甲醇摇匀溶解，定容至刻度，即5 00μg/mL浓度。放置于冰箱冷藏室保存。

标准使用液：从上述标准储备液都准确移取各2、4、6、8、10 mL置于5个50mL容量瓶中，分别加水定容至50mL，则各容量瓶中标准使用液的浓度为20、40、60、、80、、100 μg/mL。

准确吸取所有的对照品溶液与供试品溶液适量，按照上述色谱条件进行色谱分析，计算槲皮素、山柰酚和异鼠李素的含量，按照以下公式计算总黄酮苷的含量：

总黄酮苷含量=(槲皮素含量+山柰酚含量+异鼠李素含量)×稀释倍数×2.51。

从混合对照品中准确移取各0.5、1、1.5、2、2.5 mL置于5个10mL容量瓶中，分别加甲醇定容至10mL，配制成系列标准浓度的工作液体，将工作液平行测定3次，峰面积均取平均值，并绘制峰面积与浓度的标准曲线，测得槲皮素、山柰酚和异鼠李素的标准曲线分别为y=23847x-526.66（R2=0.9997），y=25922x-552.3（R2=0.9997）和Y=22085x-440.49（R2=0.9998）。结果表明槲皮素在21-100μg/mL、山柰酚21-100μg/mL和异鼠李素在19-95μg/mL范围内性关系良好。

2.8 统计分析方法

使用 GraphPad Prism 5 软件进行银杏黄酮含量、活性炭性能等数据分析，数据以平均值±标准差表示，组间采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。等温线吸附Freundlich和 Langmuir方程采用Origin 2018软件进行拟合分析。

3.结果

3.1 活性炭吸附银杏黄酮的吸附条件研究

3.1.1 活性炭静态吸附银杏黄酮的动力学曲线。不同时间点采集吸附的洗脱液，得出活性炭对EGB中的银杏黄酮的静态吸附曲线如图1所示。根据活性炭吸附动力学曲线可知，随着时间的增加，活性炭对银杏黄酮的吸附量显著增大，整个过程分为三个阶段，0-10min黄酮吸附指数增加，线性增长周期，10-90 min临近吸附的平衡状态，为缓慢增长周期，90 min以后吸附和解吸量基本稳定在固定值，为稳定周期。

3.1.2 pH对活性炭静态吸附银杏黄酮的影响。将EGB的上样液的pH值调节为3、5、7、9，吸附时间为4 h，吸附温度为35 ℃，分别计算三种银杏黄酮苷的吸附量和总黄酮苷的含量，结果见图2。pH对活性炭吸附银杏黄酮的影响较大，银杏总黄酮的在pH值为5时候吸附量最大，槲皮素和山柰酚在pH为5时候也达到较高的量。

3.1.3 活性炭吸附银杏黄酮的等温线常数。将银杏总黄酮和三种银杏黄酮苷元的各温度下的数据拟合成Freundlich和Langmuir方程，具体常数见表4和表5：

研究表明，Freundlich方程中的1/n值在0.1-0.5之间表示吸附剂容易吸附，而当1/n值大于1时候，表示该吸附剂不易于被吸附分子的吸附。Langmuir 方程中常数KL表示吸附剂与被吸附分子之间的结合能力，Qm 表示吸附剂对被吸附分子的最大吸附能力，KL和Qm越大表示该银杏黄酮越容易被活性炭吸附。另外吸附是放热反应，温度低有利于吸附，但温度过低，银杏黄酮和其他物质的溶液黏度增大不利于被吸附。由上表可以看出，Freundlich方程的银杏总黄酮吸附常数1/n值介于0.1-0.55之间，表明活性炭对银杏总黄酮吸附较容易。而活性炭对银杏叶提取物中的银杏黄酮吸附的Langmuir 高于Freundlich模拟吸附系数，说明活性炭对于银杏黄酮的吸附更偏向于单层吸附。同时，最佳吸附温度为30℃。

3.2 解吸活性炭中银杏黄酮工艺研究

活性炭吸附EGB组分中银杏黄酮组分主要依赖分子间的范德华力作用力的可逆吸附和表面酸性氧化合物不可逆吸附作用为主，这两种作用力都是吸附极性化合物优于非极性化合物。其解吸银杏黄酮的方法主要由升温解吸（沸水）、置换解吸（用苯酚、氨水或CaCl₂）和超声解吸等方式。沸水对银杏黄酮的稳定性影响大，对比几种解吸剂，氨水效果较显著。当氨水浓度为0时，银杏黄酮解吸率为0，当氨水浓度达到5左右时，银杏黄酮解吸率达到最大值。

3.2.1 单因素条件优化。由图3可知，氨水浓度在5 %时达到最大值，但超过5 %后逐渐降低。由于黄酮类物质有较广的极性范围，在5 ％左右氨水-乙醇-水溶液中，黄酮类物质能达到最大解吸率。由图4可知，乙醇浓度在70 %时活性炭解吸银杏黄酮解吸率取得最大值，但60 %到80 %之间得率差距很小。由于黄酮类物质有较广的极性范围，在70 ％左右乙醇溶液中，醇溶性和水溶性的黄酮类物质能达到最大解吸率。超过乙醇浓度70 %后缓慢降低。由图5可知，25 ℃~35 ℃时，黄酮解吸率随着温度的增加迅速增大，而35 ℃之后，温度对黄酮解吸率影响不大，而温度较高时，会增加制备成本，所以35 ℃比较合适。由图6可知，黄酮解吸率随液体体积的增大而升高，当液体体积在50~100之间时呈线性增加，当液体体积超过100 mL后增速缓慢。

3.2.2 Box-Behnken响应面分析方案。在单因素优化的基础上，采用了Box-Behnken响应面数据分析法进行条件优化。结果见表6：

3.2.3 响应面方差分析

运用Design Expert V8.0软件，对表3-6数据回归方程各项的方差做出分析，结果见表7：

P值＜0.05，说明对应的因素对响应值影响显著。从方差分析结果可以看出，模型P值＜0.05，失拟项P＞0.1，模型的相关系数Ｒ平方为0.9912，调整复相关系数为0.9825，因此所选的模型显著，失拟项不显著，可以初步判断模型可信度高。所得二次回归方程能很好的对应响应值进行预测，拟合度较好。在响应面研究的4因素中，乙醇体积、乙醇浓度、温度影响显著，而氨水的浓度影响不显著。F值的大小反应了各个因素对于总黄酮解吸率的影响。F值越大，说明该因素对于总黄酮的解吸率越大。各个因素对银杏总黄酮的得率的影响顺序为乙醇浓度，液体体积，温度，氨水浓度。

观察响应面的变化趋势和等高线的稀疏程度可见A洗脱液体体积、B乙醇浓度、C温度、D氨水浓度之间的相互作用对EGB总黄酮解吸率的影响，依据模型预测回归方程拟合获得相应的曲面图如图7所示：

当等高线呈圆形时表示两因素相互作用不明显，而呈椭圆形或马鞍形时则表示两因素相互作用明显。对各因素的响应面的交互影响分析如下：

（1）洗脱乙醇体积与乙醇浓度交互影响。乙醇的浓度与银杏黄酮的解吸率呈明显的二次抛物线关系，且乙醇洗脱体积与乙醇浓度的响应曲面呈椭圆形，响应面坡度较陡，乙醇洗脱体积和乙醇浓度的交互作用极显著。银杏总黄酮的解吸率随着乙醇洗脱体积与乙醇浓度的增加而增加，由曲面图上可知，较高的乙醇浓度和较大的乙醇洗脱体积有利于银杏黄酮的解吸量增加。依据相似相溶的原理，乙醇浓度在60-80%范围，此时洗脱剂的极性和主要银杏黄酮极性一致，促进解吸作用，解吸率达到峰值。

（2）洗脱乙醇体积与温度交互影响。响应面呈圆形，响应面坡度较平缓，洗脱液体积与温度两因素交互作用显著。在洗脱温度不变的前提下，总黄酮解吸率随着洗脱体积的增大而增大；洗脱体积不变时候，温度升高对银杏黄酮的解吸率影响不明显。

（3）氨水浓度与洗脱乙醇体积交互影响。响应面呈圆形，响应面坡度较平缓，氨水浓度与洗脱液体积交互作用不明显。在氨水浓度不变的前提下，总黄酮解吸率随着液体体积增大而增大。在洗脱乙醇体积较少情况下，随氨水浓度的增大，银杏黄酮解吸率稍微降低。虽然氨水浓度增大有利于解吸，但乙醇体积减少，溶解的银杏黄酮载量减少，不利于解吸率增大。

（4）乙醇浓度与温度交互影响。响应面呈椭圆形，响应面坡度较陡峭，乙醇浓度与温度两因素交互作用显著。在乙醇浓度不变的前提下，总黄酮解吸率随着温度增大而缓慢增大；在温度不变的前提下，总黄酮解吸率随着乙醇浓度的增大而显著增大。在乙醇浓度60%-80%，银杏黄酮解吸率达峰值。

（5）氨水浓度与温度交互影响。响应面呈椭圆形，响应面坡度较平缓，氨水浓度与温度两因素交互作用不明显。在氨水浓度不变的前提下，总黄酮解吸率随着温度增大而缓慢增大；在适宜温度不变的前提下，总黄酮解吸率随着氨水浓度的变化而出现峰值。较高温度不变下，解吸率随氨水浓度增大达峰值后降低，说明温度增大会增加氨水的挥发，另外增加其他物质溶入洗脱液中增加黏度导致黄酮溶出率低解吸率减小。

（6）乙醇浓度与氨水浓度交互影响。响应面呈椭圆形，响应面坡度较陡峭，乙醇浓度与氨水浓度两因素交互作用明显。在氨水浓度很低前提下，需要很大的乙醇浓度才能提高银杏总黄酮解吸率；在乙醇浓度不变的前提下，总黄酮解吸率随着氨水浓度的变化而出现极大值。当乙醇浓度为约40 %，氨水浓度增大反而黄酮解吸率降低，原因在于乙醇浓度低不利于银杏黄酮溶解，而降低解吸率。

3.3.2.4 解吸最佳条件预测与验证

通过软件对数据进一步分析确定最佳条件和回归模型，分析活性炭中银杏黄酮的解吸最佳工艺条件为：洗脱液体积为116.75 mL，乙醇浓度为73.4 %，洗脱温度为31.5 ℃，氨水浓度5.7 %.为在此条件下得到的理论总黄酮解吸率为73.25 %。按最优条件进行三次试验验证，所有活性炭吸附银杏黄酮的解吸率为74.56%±1.24 %。

3.3.2.5 活性炭解吸银杏黄酮样品色谱分析及其微观形貌分析

将活性炭饱和静态吸附EGB中的银杏总黄酮，吸附4 h后用70 %乙醇洗脱后检测溶液中黄酮含量，再添加70 %乙醇+5 %氨水进行洗脱后分别取样1 mL样品水解后，结果如图8所示。由上图可以看出，活性炭吸附银杏黄酮后70 %乙醇洗脱不了，而70 %+5 %氨水能洗脱吸附银杏黄酮，且银杏黄酮以槲皮素，山柰酚和异鼠李素三种黄酮苷为主，和银杏提取物中黄酮类型一致。

活性炭的SEM结构表征。在1000和2000的放大倍数下用SEM扫描表层的结构见图9：由图可看见A与B的外观区别比较大，在显微观察时候明显看到A有淡黄色物质吸附在表面，初步推断是银杏黄酮吸附物未洗脱下来，B图则看不到明显的淡黄斑点。经洗脱后B的粒径明显比较大，半径小的也超过5 μm的，大的长度接近100微米。而A图在1000和2000放大后看见半径小于5 μm的小颗粒。A与B图活性炭还是大部分堆积在一起，颗粒大小分布不均匀，大小约在1 μm-100 μm之间。不同浓度乙醇都解吸不了活性炭中吸附的银杏黄酮，但可以被乙醇和氨水混合液洗脱干净。说明活性炭表面含氧官能团中的酸性化合物越丰富，吸附极性化合物的效率越高，活性炭极易与银杏黄酮形成死吸附，加氨水可能与活性炭的酸性含氧基团作用后置换解吸银杏黄酮。

3.3.3 活性炭吸附银杏黄酮的静态解吸和动态解吸曲线

不同时间点采集吸附和解吸的洗脱液，得出活性炭对EGB中的银杏黄酮的静态吸附和解吸的动力学曲线（图10）。随着时间的增加，活性炭对银杏黄酮的解吸量显著增大，整个过程分为三个阶段，0-10 min黄酮解吸量指数增加，线性增长周期，10-90 min临近解吸的平衡状态，为缓慢增长周期，90 min以后解吸量基本稳定在固定值，为稳定周期。为了解在最佳解吸工艺条件下活性炭解吸下来银杏黄酮的分布情况，先吸附银杏黄酮达到饱和后，用2倍体积的蒸馏水和40%酒精分别洗脱后，再用不同浓度的乙醇+5%氨水进行梯度洗脱，分段收集解吸液，测定流出液中三种黄酮苷和总黄酮的浓度。从结果（图11）可以看出40%乙醇+5%氨水洗脱2BV时黄酮浓度最高，60%乙醇+5%氨水2 BV洗脱后虽然银杏黄酮维持平缓，但是浓度显著下降。通过动态解吸曲线可表明活性炭吸附银杏黄酮动态完全解吸60%乙醇+5%氨水洗脱4倍柱体积，柱子中银杏黄酮基本解吸下来。其中40%乙醇+5%氨水解吸时候银杏黄酮最大浓度可达到3.75 mg/mL。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种分离制备银杏叶提取物中银杏黄酮的方法，其特征在于步骤为：用10wt.%-20wt.%乙醇溶解银杏叶提取物，利用活性炭在pH值为5的条件下，于30℃吸附银杏黄酮，分别用10%醇和40%醇洗涤后；再利用73.4 wt.%醇及5.7 wt.%氨水，在31.5℃条件下，洗脱吸附在活性炭中的银杏叶提取物中银杏黄酮，洗脱液体积为4倍柱体积。

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