CN104592293A

CN104592293A - 一种高含量磷脂酰乙醇胺的制备方法

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Publication number: CN104592293A
Application number: CN201410841454.1A
Authority: CN
Inventors: 许文东; 唐顺之; 李继荣; 袁诚; 关伟键; 蔡鸿飞; 杨玉琼; 谭巧君; 牟肖男; 梁北梅; 王小妹
Original assignee: GUANGZHOU HANFANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU HANFANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2034-12-30
Also published as: CN104592293B

Abstract

本发明公开了一种高含量磷脂酰乙醇胺的制备方法。其步骤包括以脑磷脂粗品为原料，使用有机溶剂溶解，经过柱色谱以多卤代烷烃-低碳醇-水所组成的三元混合溶剂进行两次洗脱，干燥，得到磷脂酰乙醇胺产品。本发明所得产品磷脂酰乙醇胺含量高（96.0%~99.9%HPLC法），杂质含量低（磷脂酰胆碱含量少于0.5%、溶血磷脂酰胆碱含量少于0.5%、游离脂肪酸少于0.2%、甘油三酯少于0.2%），氧化指标低（酸值低于1.0、过氧化值低于1.0、甲氧基苯胺值低于5.0），产品质量满足注射用药用磷脂的质量要求。

Description

一种高含量磷脂酰乙醇胺的制备方法

技术领域

本发明属于制药工程技术领域，具体地说，涉及一种高含量磷脂酰乙醇胺的制备方法。

背景技术

磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine简称PE)又称乙醇胺磷酸甘油酯，结构上是由乙醇胺和磷脂酸两部分组成的一类磷脂化合物。较早时应用于食品加工及保健品研究等领域，随着研究的不断深入，磷脂酰乙醇胺逐渐的被人们应用到药物制剂领域，在如今最活跃的脂质体技术领域，不仅高纯度磷脂酰乙醇胺是脂质体制剂的重要辅料来源，也是其他重要的脂质体辅料如合成磷脂(DOPE、DEPE等)的关键起始原料。目前中国药典收载的药用磷脂主要控制指标包括甘油三酯、游离脂肪酸、过氧化值、酸值等，另外甲氧基苯胺值是过氧化物的再次氧化产物指标，在制剂中有严格控制，因此开发注射用磷脂酰乙醇胺需要严格控制上述关键指标。

目前分离磷脂酰乙醇胺的方法有CO₂超临界萃取法、溶剂萃取法、吸附法、柱层析法等。

CO₂超临界萃取法只适合制备混合磷脂，所得产品磷脂酰乙醇胺含量普遍偏低。磷脂酰乙醇胺与其他磷脂的分子量较接近，膜分离法要得到单一磷脂酰乙醇胺仍存在困难，其产品含量偏低不能满足药用磷脂要求。溶剂提取法是通过磷脂酰乙醇胺在两相溶剂中的溶解度的差异达到富集纯化的目的，对理化性质非常相似的各类磷脂杂质的选择性较差。

吸附法是一种较常用的纯化方法，通过选择不同理化特性的吸附剂对待吸附原料液进行搅拌吸附，达到纯化的效果，常见的吸附剂有：三氧化二铝、硅胶等，该方法只对磷脂酰胆碱、酸值等指标有一定的吸附效果，很难保证含量、溶血磷脂酰胆碱(LPC)等关键指标符合药用标准。

硅胶柱层析法是另一种较常用的分离纯化方法，固定相与待分离物质的比例、洗脱溶剂种类和比例对柱层析的分离效果与除杂能力有巨大的影响，柱层析方法的溶剂及比例选择与产品本身的性质以及杂质性质有关，该方法虽常见，但能够使产品纯度高同时又能符合注射用要求的方法未见报道。

采用柱层析纯化磷脂酰乙醇胺的专利较多，如中国专利CN100336818C、CN103183705A分别公开了不同来源的磷脂酰乙醇胺粗品经柱层析硅胶过柱，利用卤代烷烃-甲醇洗脱得到磷脂酰乙醇胺含量分别为96.2％、91.4％～94.5％的产品，这两篇专利均采用卤代烷烃-甲醇两相体系为洗脱液，所得产品含量偏低，其他指标如甘油三酯、脂肪酸、过氧化值、甲氧基苯胺值等指标无法得到有效控制，难以满足药用辅料要求。

中国专利CN103102366A公开了一种于醇溶性磷脂中分离磷脂酰乙醇胺的方法，该方法以硅胶为填充剂，乙醇为洗脱剂，得到磷脂酰乙醇胺含量为86％～96.2％的产品。此方法采用单组分溶剂进行分离洗脱，受极性影响，很难控制产品中甘油三酯、脂肪酸、过氧化值、甲氧基苯胺值等指标，且该方法很难实现产业化生产。

以上三篇专利技术无论是用低碳醇洗脱，还是用卤代烷烃-甲醇洗脱，所得到磷脂酰乙醇胺产品仍然存在缺陷，含量、杂质限度与氧化指标等不能同时满足注射药用磷脂的要求。

在现有专利技术纯化磷脂酰乙醇胺的应用中，其产品杂质(磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆)、氧化指标(酸值、过氧化值、甲氧基苯胺值)不能完全符合药用磷脂的要求。目前开发药用磷脂的技术领域里，没有专门针对控制过氧化值、甲氧基苯胺值等理化指标的方法，磷脂酰乙醇胺具有高不稳定性，开发该类产品需要过度依赖于起始原料的新鲜度。受技术约束，目前国内药用磷脂酰乙醇胺主要依赖进口，且价格昂贵，供货周期长，导致磷脂酰乙醇胺相关产品开发周期长、成本高，不利于市场的普及应用。

因此，开发以脑磷脂粗品为原料，通过柱层析并对三元混合溶剂比例进行控制，经过两次洗脱，即可以提高产品含量又可以降低甘油三酯、游离脂肪酸、酸值、过氧化值、甲氧基苯胺值等关键指标，使得产品质量符合药用要求，对新型靶向制剂的发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高含量磷脂酰乙醇胺的制备方法。本发明通过柱层析以三元混合溶剂为洗脱剂进行两次洗脱，一步提高磷脂酰乙醇胺含量并且有效控制产品中杂质限度(磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、游离脂肪酸、甘油三酯)和氧化指标(酸值、过氧化值、甲氧基苯胺值)。

方法的步骤如下：

以脑磷脂粗品为原料，加入多卤代烷烃溶解，经过柱层析以多卤代烷烃-低碳醇-水所组成的三元混合溶剂进行两次洗脱处理，干燥，得到高纯度磷脂酰乙醇胺产品。

方法所用脑磷脂粗品原料为来源于大豆、蛋黄的磷脂粗品，其中磷脂酰乙醇胺含量大于50％。

所用填料包括硅胶或二醇基硅胶。

所用填料与原料的比例为1:1～10:1(kg/kg)。

所用的多卤代烷烃包括二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷。

所用的低碳醇包括无水乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇。

第一次洗脱所用的三元混合溶剂包括多卤代烷烃，低碳醇和水。其中多卤代烷烃占混合溶剂的比例为85.7％～98.0％，水占混合溶剂的比例为0.1％～0.2％，其余为低碳醇。

第二次洗脱所用的三元混合溶剂包括多卤代烷烃，低碳醇和水。其中多卤代烷烃占混合溶剂的比例为73.5％～85.0％，水占混合溶剂的比例为0.3％～2.0％，其余为低碳醇。

第一次洗脱体积用量(v)与原料重量(w)比为6:1～18:1(L/Kg)。

第二次洗脱体积用量(v)与原料重量(w)比为10:1～45:1(L/Kg)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用三元混合溶剂体系，结合两次洗脱，就可以保证磷脂酰乙醇胺含量符合要求的同时达到脱色、除杂(降低磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、甘油三酯、游离脂肪酸含量等杂质限度)、降值(降低酸值、过氧化值、甲氧基苯胺值)的效果。

(2)本发明解决了现有同类专利技术所存在的技术瓶颈，从技术层面解决了降低过氧化值、甲氧基苯胺值等理化指标的难题，大大减少了磷脂酰乙醇胺产品对起始原料新鲜程度的过度依赖。

(3)本发明对原料的处理量大，生产操作简便，可商业化大生产得到符合药用磷脂要求合格产品，填补国内空白，打破国外的技术和产品垄断，有利于国内市场上的普及应用。

具体实施方式

以下实施例所得产品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、甘油三酯、游离脂肪酸含量以及酸值、过氧化值等关键均按照中国药典收载的磷脂检测方法进行测定，甲氧基苯胺值按照欧洲药典8.0版2.5.36方法测定。

实施例1：

取大豆脑磷脂粗品(PE≥50％)1公斤，加入二氯甲烷溶解配成原料液，填装10公斤硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(二氯甲烷85.7％、乙醇14.2％、水0.1％)洗脱18升，第二次再以洗脱剂(三氯甲烷73.5％、丙醇24.5、水2.0％)洗脱45升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为85.4％，磷脂酰乙醇胺含量为99.5％、磷脂酰胆碱含量为0.3％、溶血磷脂酰胆碱含量为未检出，酸值为0.8、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为3.6，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例2：

取蛋黄脑磷脂粗品(PE≥50％)1公斤，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填装7公斤二醇基硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(三氯甲烷90.0％、丙醇9.8％、水0.2％)洗脱15升，第二次再以洗脱剂(二氯甲烷75.0％、丙醇24.5％、水0.5％)洗脱30升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为83.5％，磷脂酰乙醇胺含量为99.0％、磷脂酰胆碱含量为0.5％、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0.4、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为1.0，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例3：

取大豆脑磷脂粗品(PE≥50％)10公斤，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填装50公斤二醇基硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(二氯乙烷93.0％、乙醇6.8％、水0.2％)洗脱460升，第二次再以洗脱剂(二氯乙烷80.0％、乙醇19.0％、水1.0％)洗脱440升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为82.2％，磷脂酰乙醇胺含量为98.5％、磷脂酰胆碱含量为0.2％、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为1.0、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为3.0，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例4：

取蛋黄脑磷脂粗品(PE≥50％)10公斤，加入二氯甲烷溶解配成原料液，填装30公斤二醇基硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(二氯甲烷88.2％、丙醇11.6％、水0.2％)洗脱150升，第二次再以洗脱剂(二氯甲烷83.0％、乙醇16.7％、水0.3％)洗脱400升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为77.3％，磷脂酰乙醇胺含量为98.3％、磷脂酰胆碱含量为0.4％、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0.5、过氧化值为未检出、甲氧基苯胺值为4.0，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例5：

取大豆脑磷脂粗品(PE≥50％)50公斤，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填装50公斤二醇基硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(二氯乙烷98.0％、异丙醇1.9％、水0.1％)洗脱300升，第二次再以洗脱剂(二氯乙烷77.0％、正丁醇21.0％、水2.0％)洗脱750升收集洗脱液，溶剂经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为81.7％，磷脂酰乙醇胺含量为98.8％、磷脂酰胆碱含量未检出、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0.8、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为2.0，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例6：

取蛋黄脑磷脂粗品(PE≥50％)50公斤，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填装200公斤硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(三氯甲烷95.0％、乙醇4.8％、水0.2％)洗脱400升，第二次再以洗脱剂(三氯甲烷79.0％、乙醇19.0％、水2.0％)洗脱1000升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为79.0％，磷脂酰乙醇胺含量为99.0％、磷脂酰胆碱含量为0.2％、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为1.0、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为3.4，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例7：

取大豆脑磷脂粗品(PE≥50％)100公斤，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填装100公斤硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(三氯甲烷85.7％、乙醇14.2％、水0.1％)洗脱600升，第二次再以洗脱剂(二氯乙烷81.0％、乙醇17.0％、水2.0％)洗脱1000升收集洗脱液，溶剂经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为78.6％，磷脂酰乙醇胺含量为98.0％、磷脂酰胆碱含量为0.3％、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为1.0、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为3.7，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例8：

取蛋黄脑磷脂粗品(PE≥50％)100公斤，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填装600公斤硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(三氯甲烷88.0％、正丁醇11.8％、水0.2％)洗脱1800升，第二次再以洗脱剂(三氯甲烷75.0％、正丁醇23.0％、水2.0％)洗脱3000升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为85.2％，磷脂酰乙醇胺含量为99.5％、磷脂酰胆碱含量未检出、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0.8、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为3.6，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例9：

取大豆脑磷脂粗品(PE≥50％)150公斤，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填装600公斤二醇基硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(三氯甲烷91.0％、乙醇8.8％、水0.2％)洗脱1200升，第二次再以洗脱剂(二氯乙烷73.5％、正丁醇24.5％、水2.0％)洗脱1800升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为75.5％，磷脂酰乙醇胺含量为99.0％、磷脂酰胆碱含量未检出、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0.7、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为2.4，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例10：

取蛋黄脑磷脂粗品(PE≥50％)150公斤，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填装750公斤硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(三氯甲烷88.7％、正丁醇11.1％、水0.2％)洗脱2550升，第二次再以洗脱剂(二氯甲烷85.0％、乙醇13.0％、水2.0％)洗脱6600升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为87.2％，磷脂酰乙醇胺含量为99.2％、磷脂酰胆碱含量为0.1％、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0.9、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为2.2，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例11：

取大豆脑磷脂粗品(PE≥50％)200公斤，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填装400公斤硅胶柱进行层析，第一次以洗脱剂(二氯乙烷85.7％、正丁醇14.1％、水0.2％)洗脱3600升，第二次再以洗脱剂(二氯乙烷74.0％、异丙醇25.7％、水0.3％)洗脱7000升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为80.2％，磷脂酰乙醇胺含量为98.9％、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0.5、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为4.1，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

实施例12：

取蛋黄脑磷脂粗品(PE≥50％)200公斤，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填装1400公斤硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂(三氯甲烷87.0％、丙醇12.8％、水0.2％)洗脱3000升，第二次再以洗脱剂(三氯甲烷83.0％、丙醇25.5％、水1.5％)洗脱8000升收集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为83.3％，磷脂酰乙醇胺含量为99.0％、磷脂酰胆碱含量未检出、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0.4、过氧化值未检出、甲氧基苯胺值为1.0，甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。

由于已有专利技术所得到的产品个别指标在注射用药用磷脂范围内，所以根据已有专利技术实施例方法制备产品，并按照中国药典收载的磷脂检测方法测定磷脂酰乙醇胺含量(PE)、有关物质磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、甘油三酯、游离脂肪酸、过氧化值等关键指标，甲氧基苯胺值按照欧洲药典8.0版2.5.36方法测定。并与本发明产品的检测数据进行对比，结果如下所示：

按中国专利CN100336818C实施例7所述分离方法实施，以脑磷脂粗品为原料，得到磷脂酰乙醇胺样品1。

按中国专利CN103102366A实施例2所述分离方法实施，以脑磷脂粗品为原料，得到磷脂酰乙醇胺样品2。

按中国专利CN103183705A实施例2所述分离方法实施，以脑磷脂粗品为原料，得到磷脂酰乙醇胺样品3。

根据上述专利实施例制备所得样品，按质量要求检测关键指标，结果如表1所示。

表1

使用现有专利技术报道的卤代烷烃-甲醇或醇水洗脱硅胶柱的方法，并不能将酸值、过氧化值、甲氧基苯胺值等关键指标降低到注射用药用磷脂要求的水平。本发明选用硅胶、二醇基硅胶等5种填料，对溶剂体系、洗脱方式、洗脱条件、填料用量等因素进行了大量的实验探索，加入多卤代烷烃与调节洗脱剂中水的含量后通过两次洗脱就能得到低杂质(磷脂酰胆碱含量少于0.5％、溶血磷脂酰胆碱含量少于0.5％、游离脂肪酸少于0.2％、甘油三酯少于0.2％)、低氧化指标(酸值低于1.0、过氧化值低于1.0、甲氧基苯胺值低于5.0)的产品，达到现有专利技术所不能达到的效果。

Claims

1.一种磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是以脑磷脂粗品为原料，经过柱层析以多卤代烷烃-低碳醇-水所组成的三元混合溶剂进行两次洗脱处理，干燥，得到高含量磷脂酰乙醇胺。

2.根据权利要求1所述磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是：柱层析所用的填料为硅胶或二醇基硅胶。

3.根据权利要求2所述磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是：所用填料与原料的质量比例为1:1~10:1。

4.根据权利要求1所述磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是：所用的多卤代烷烃为二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷。

5.根据权利要求1所述磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是：所用的低碳醇为无水乙醇、丙醇、异丙醇或正丁醇。

6.根据权利要求1所述磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是：第一次洗脱所用的三元混合溶剂包括多卤代烷烃，低碳醇和水；其中多卤代烷烃占混合溶剂的比例为85.7%~98.0%，水占混合溶剂的比例为0.1%~0.2%，其余为低碳醇。

7.根据权利要求1所述磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是：第二次洗脱所用的三元混合溶剂包括多卤代烷烃，低碳醇和水；其中多卤代烷烃占混合溶剂的比例为73.5%~85.0%，水占混合溶剂的比例为0.3%~2.0%，其余为低碳醇。

8.根据权利要求1所述磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是：第一次洗脱体积用量与原料重量比为6:1~18:1（L/Kg）。

9.根据权利要求1所述磷脂酰乙醇胺的制备方法，其特征是：第二次洗脱体积用量与原料重量比为10:1~45:1（L/Kg）。