CN106632120B - R，s-告依春的制备方法 - Google Patents
R，s-告依春的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种R，S‑告依春的制备方法，所述制备方法为：S1.提取：取板蓝根药材为原料，蒸馏水超声提取，溶剂萃取后浓缩得到主含R，S‑告依春的提取物；S2.高速逆流色谱分离：提取物经高速逆流色谱洗脱分离，接收流份，收集含有目标产物的流份，得到R，S‑告依春粗品；S3.正相柱层析分离:正相柱层析分离R，S‑告依春粗品，得目标物。利用所述方法制备的R，S‑告依春质量高，单次制备量大，并对样品活性无影响，也无外加污染，产品可用于药品，化妆品，保健品等。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药有效成分的提取分离工艺领域，具体的，本发明涉及一种R，S-告依春的制备方法。
背景技术
R，S-告依春是板蓝根中的一种有效活性成分，具有显著的抗病毒活性。传统的制备R，S-告依春的方法基本采用大孔树脂柱分离，大多使用大孔树脂柱分离层析、正相柱层析及反相柱层析联用的方法，然而采用这种方法制备出的样品得率低、制备量小、纯度不高，无法进行规模化的制备。此外，这种方法还存在污染大，耗时长，成本高，且在制备过程中因使用到大量的吸附填料，使样品原有的生物活性大打折扣，所得R，S-告依春活性降低，生产效益低下，不适合推广使用。
发明内容
基于此，本发明在于克服现有技术的缺陷，提供一种用高速逆流大量制备R，S-告依春的方法，利用所述方法制备R，S-告依春质量高，单次制备量大，并对样品活性无影响，也无外加污染，可用于药品，化妆品，保健品等。
其技术方案如下：
一种制备R，S-告依春的方法，包括如下步骤：
S1.提取：取板蓝根药材为原料，蒸馏水超声提取，溶剂萃取后浓缩得到主含R，S-告依春的提取物；
S2.高速逆流色谱分离：配置体积比为7～9：0.5～1.5：0.5～1.5：8～10的乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的溶剂体系，所述溶剂体系包括作为固定相的上层和作为流动相的下层，取适量所述流动相溶解所述提取物，将所述溶剂体系泵入高速逆流色谱的色谱柱中，然后将溶解后的所述提取物泵入高速逆流色谱洗脱分离，并根据记录仪得到的逆流色谱图谱判定流份中是否含有R，S-告依春，收集含有R，S-告依春的流份，干燥得到R，S-告依春粗品，其中，所述高速逆流色谱的参数设置如下：转速为300～500rpm，分离温度为17～23℃，检测波长为240～260nm，流动相的流速为9～20ml/min；
S3.正相柱层析分离：以正相层析硅胶为填料、体积比为5～9：1～3的石油醚-乙酸乙酯为洗脱溶剂进行正相柱层析所述分离R，S-告依春粗品，洗脱体积为15～25倍柱体积，所述R，S-告依春粗品与填料的质量比为1:20～1:50，收集含有R，S-告依春的洗脱液，减压蒸馏即得。
本发明采用高速逆流色谱分离R，S-告依春，由于高速逆流色谱不需要固体支撑体，R，S-告依春的分离仅依据其在固定相、流动相中分配系数的不同就可实现，无需大量使用吸附填料，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使R，S-告依春能够充分回收，回收的R，S-告依春更能保持其本来的特性，且由于被分离的R，S-告依春提取物与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高。
在其中一个实施例中，步骤S2所述乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的混合溶液中乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的体积比为9：1：1：9。
在其中一个实施例中，步骤S2中所述固定相的保留值为80～90％。
在其中一个实施例中，步骤S2中所述固定相的保留值为82.4％。
在其中一个实施例中，步骤S2中所述流动相的流速为10～15ml/min。
在其中一个实施例中，步骤S2中所述转速为400～500rpm。
在其中一个实施例中，步骤S2中所述检测波长为254nm。
在其中一个实施例中，所述步骤S1为：取板蓝根药材为原料粉碎过筛，蒸馏水超声提取，过滤，取滤液调碱后采用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，浓缩除去乙酸乙酯得到主含R，S-告依春的提取物。
在其中一个实施例中，所述步骤S1为：取板蓝根药材为原料，粉碎过筛，按料液比1:3～1:10用蒸馏水溶解，30～70W的功率下超声30～60min，提取3～5次，过滤，取滤液，用氢氧化钠将滤液调pH为8～12，采用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，浓缩除去乙酸乙酯得到主含R，S-告依春的提取物。
在其中一个实施例中，步骤S3所述洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为8：2。
在其中一个实施例中，步骤S3中所述R，S-告依春粗品与填料的质量比为1:25。
在其中一个实施例中，所述步骤S3中采用正相薄层色谱判定洗脱液中是否含有R，S-告依春。
在其中一个实施例中，步骤S2中所述混合溶液泵入高速逆流色谱的色谱柱的过程为：混合溶液的上层液于仪器静态泵入高速逆流色谱柱中，混合溶液的下层液于仪器动态泵入色谱柱中，上相为固定相，下相为流动相。
在其中一个实施例中，步骤S2中所述溶解后的提取物在固定相、流动相平衡后被泵入色谱柱中。
在其中一个实施例中，所述高速逆流色谱柱的体积为1000ml。
在其中一个具体实施例中，单次通过单根高速逆流色谱柱的提取物质量为3～5g。
在其中一个实施例中，所述硅胶为100～200目硅胶。
在其中一个实施例中，步骤S3中R，S-告依春粗品经洗脱溶剂溶解后再进行正相柱层析分离。
在其中一个实施例中，步骤S3中减压蒸馏制备目标物的过程中同时回收溶剂。
本发明的有益效果在于：
本发明采用高速逆流色谱仪提纯分离制备R，S-告依春，再经正相柱层析制备得到高纯的R，S-告依春，该制备方法耗时短，R，S-告依春质量高，单次制备量大，可进行规模化的制备且成本低；该制备方法因未大量使用吸附填料，对样品活性影响较小，保留了原有的生物活性；制备出的产品也无外加污染，可用于药品，化妆品，保健品等。
附图说明
图1为制备R，S-告依春的工艺流程图。
图2为实施例1中记录仪记录的高速逆流色谱分离R，S-告依春的逆流色谱图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
图1为制备R，S-告依春的工艺流程图。以下各实施例所用原料均为普通市售产品，正相层析硅胶的目数为100～200目。
实施例1
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：取板蓝根药材13.3千克为原料，粉碎过筛，按料液比1:6用蒸馏水溶解，60W的功率下超声提取60min，每隔20分钟搅拌，每超声提取一次后静置60分钟，期间每隔30分钟搅拌一次，如此操作提取4次，过滤，取滤液，另置，滤渣按上述操作反复提取3次，合并滤液。用氢氧化钠将水提液调pH为10时，采用乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯层，低压浓缩除去乙酸乙酯得到主含R，S-告依春的提取物27.21克。
S2.高速逆流色谱分离：配置大量体积比为9：1：1：9的乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的溶剂体系，所述溶剂体系包括作为固定相的上层和作为流动相的下层，取280mL流动相溶解上述提取物，将溶剂体系的上层液于仪器静态泵入高速逆流色谱柱中，溶剂体系的下层液于仪器动态泵入色谱柱中，溶解后的提取物在固定相、流动相平衡后被泵入色谱柱中，经高速逆流色谱洗脱分离，接收流份，并根据记录仪得到的逆流色谱图谱判定流份中是否含有目标产物，收集含有目标产物的流份，干燥得到R，S-告依春粗品，其中，所述高速逆流色谱的参数设置如下：转速为400rpm，分离温度为17～23℃，检测波长为254nm，流动相的流速为10ml/min，固定相保留值为82.4％；
S3.正相柱层析分离：以正相层析硅胶为填料、体积比为8：2的石油醚-乙酸乙酯为洗脱溶剂进行正相柱层析分离R，S-告依春粗品，所述R，S-告依春粗品层析前用洗脱溶剂溶解。洗脱体积为15～25倍柱体积，根据正相薄层色谱判定洗脱液中是否含有R，S-告依春，收集含有R，S-告依春的洗脱液(第11～22柱体积)，减压蒸馏得目标物9.5克，其中，所述R，S-告依春粗品与填料的质量比为1:25。
图2为实施例1中记录仪记录的高速逆流色谱分离R，S-告依春的逆流色谱图谱，当观察到出现此峰型的图谱时表明流份中含有R，S-告依春。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.9％。
所得R，S-告依春粗品的核磁数据：6.01(ddd,J＝17.1,10.3,6.7,1H)，5.48(d,J＝17.1,1H)，5.37(d,J＝10.5,2H)，3.91(t,J＝9.6,1H)，3.48(dd,J＝10.1,7.6,1H)。
R，S-告依春化学结构式如式1所示：
实施例2
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相似，区别在于乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的体积比为7：1.5：0.5：8，固定相保留值为81.3％；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相同，得到R，S-告依春9.48g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.7％。
实施例3
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相似，区别在于乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的体积比为9：0.5：1.5：10，固定相保留值为83.7％；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相同，得到R，S-告依春9.53g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.3％。
实施例4
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相似，区别在于转速为500rpm；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相同，得到R，S-告依春9.47g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.5％。
实施例5
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相似，区别在于转速为300rpm；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相同，得到R，S-告依春9.54g；
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.1％。
实施例6
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相似，区别在于流动相的流速为15ml/min；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相同，得到R，S-告依春9.5g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.8％。
实施例7
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相似，区别在于流动相的流速为20ml/min；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相同，得到R，S-告依春9.52g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.3％。
实施例8
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相似，区别在于流动相的流速为9ml/min；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相同，得到R，S-告依春9.54g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.1％。
实施例9
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相同；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相似，区别在于石油醚-乙酸乙酯的体积比为5：3，得到R，S-告依春9.53g；
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.3％。
实施例10
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相同；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相似，区别在于石油醚-乙酸乙酯的体积比为9：1，得到R，S-告依春9.52g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.4％。
实施例11
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相同；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相似，区别在于R，S-告依春粗品与填料的质量比为1:1，得到R，S-告依春9.56g；
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.0％。
实施例12
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相同；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相似，区别在于R，S-告依春粗品与填料的质量比为1:50，得到R，S-告依春9.53g；
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为99.4％。
对比例1
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相似，区别在于乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的体积比为10：1：2：9，固定相保留值为71.2％；
S3.正相柱层析分离：与实施例1中的步骤S3相同，得到R，S-告依春为9.9g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为89.1％。
对比例2
按下列步骤制备告依春：
S1.提取：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.高速逆流色谱分离：与实施例1中的步骤S2相同，得到R，S-告依春9.7g。
所得R，S-告依春经HPLC检测纯度为97.5％。
从实施例1至12可知，利用本发明所述方法制备的R，S-告依春的纯度高达99％且单次产量高，此外，由于该制备过程仅通过高速逆流色谱与正相层析柱，比传统工艺更加简便和省时。通过实施例1和对比例1的对比可知，步骤S2中乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的用量比例对R，S-告依春的纯度影响较大，超过一定范围，其纯度会显著下降。通过实施例1和对比例2的对比可知，步骤S3对R，S-告依春的纯度影响也较大，正相柱层析可进一步提高R，S-告依春的纯度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种制备R，S-告依春的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取：取板蓝根药材为原料，蒸馏水超声提取，过滤，取滤液调碱后采用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，浓缩除去乙酸乙酯得到主含R，S-告依春的提取物；
S2.高速逆流色谱分离：配置体积比为7～9：0.5～1.5：0.5～1.5：8～10的乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的溶剂体系，所述溶剂体系包括作为固定相的上层和作为流动相的下层，取适量所述流动相溶解所述提取物，将所述溶剂体系泵入高速逆流色谱的色谱柱中，然后将溶解后的所述提取物泵入高速逆流色谱洗脱分离，并根据记录仪得到的逆流色谱图谱判定流份中是否含有R，S-告依春，收集含有R，S-告依春的流份，干燥得到R，S-告依春粗品，其中，所述高速逆流色谱的参数设置如下：转速为300～500rpm，分离温度为17～23℃，检测波长为240～260nm，流动相的流速为9~20mL/min；
S3.正相柱层析分离：以正相层析硅胶为填料、体积比为5～9：1～3的石油醚-乙酸乙酯为洗脱溶剂进行正相柱层析分离所述R，S-告依春粗品，洗脱体积为15～25倍柱体积，所述R，S-告依春粗品与填料的质量比为1:20～1:50，收集含有R，S-告依春的洗脱液，减压蒸馏即得。
2.根据权利要求1所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，步骤S2所述乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的混合溶液中乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水的体积比为9：1：1：9。
3.根据权利要求1所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，步骤S2中所述固定相的保留值为80～90%。
4.根据权利要求1所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，步骤S2中所述流动相的流速为10～15mL/min。
5.根据权利要求1所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，步骤S2中所述转速为400～500rpm。
6.根据权利要求1所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，步骤S2中所述检测波长为254nm。
7.根据权利要求1-6任一项所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，所述步骤S1为：取板蓝根药材为原料粉碎过筛，蒸馏水超声提取，过滤，取滤液调碱后采用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，浓缩除去乙酸乙酯得到主含R，S-告依春的提取物。
8.根据权利要求7所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，所述步骤S1为：取板蓝根药材为原料，粉碎过筛，按料液比1:3～1:10用蒸馏水溶解，30～70W的功率下超声30～60min，提取3～5次，过滤，取滤液，用氢氧化钠将滤液调pH为8～12，采用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，浓缩除去乙酸乙酯得到主含R，S-告依春的提取物。
9.根据权利要求1-6任一项所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，步骤S3所述洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为8：2。
10.根据权利要求1-6任一项所述制备R，S-告依春的方法，其特征在于，步骤S3中所述R，S-告依春粗品与填料的质量比为1:25。
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| 基于表告依春的板蓝根水提正交试验研究;吴国军等;《黑龙江八一农垦大学学报》;20141231;第26卷(第6期);第29-33页 * |
| 超临界CO2萃取-高速逆流色谱快速分离制备板蓝根中的表告依春;段文娟等;《中华中医药学刊》;20101130;第28卷(第11 期);第2282-2284页 * |
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