CN114532364B - 一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法 - Google Patents

一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法，是将油橄榄叶粉末分散在水中，水浴加热提取活性物质，过滤后得到油橄榄叶提取物溶液；在搅拌下将凹凸棒石粉末加入油橄榄叶提取物，超声处理后滴加亚硒酸钠溶液，然后于室温下反应12~72h，所得产物离心洗涤，真空干燥后得到纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料。本发明所得复合抗菌材料环境友好，生物相容性高，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出较好的抗菌活性，同时对自由基具有较强的清除能力，可作为动物健康养殖用抗菌材料。

Description

一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材 料的方法
技术领域
本发明属于纳米复合材料制备技术领域，具体涉及一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法。
背景技术
硒是人体和动物体内必不可少的微量元素之一，作为机体内谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分的形式参与机体内分泌、炎症反应、免疫、生殖等生理过程。研究表明，在畜禽日粮中添加适量的硒可以提高生长性能并增加肌肉等组织中硒的沉积，可生产富硒动物产品。在自然界中无机硒和有机硒是硒的主要存在形式。无机硒包括硒酸盐、亚硒酸盐以及硒的氧化物；有机硒则主要存在于谷类等绿色蔬菜中，常见如硒蛋白和硒氨基酸等。其中，无机硒具有较大毒性，不易被机体吸收，生物利用率低，不适合人和动物使用。有机硒比无机硒的毒性低，但其吸收率不完全，而且不易排出体内。
近年来，纳米硒受到了越来越多的关注。与无机或有机硒相比，纳米硒具有更高的生物活性和生物利用率，并且毒性低，机体可耐受性高，在医药等领域具有十分广阔的应用前景（营养健康. 2021,8,109，Toxicol. Sci. 2008,101,22）。此外，硒是动物体内内源性抗氧化防御系统的重要组成部分，能够有效缓解动物机体内氧化应激带来的损伤。而纳米硒具有更强的抗氧化效果，其对自由基的清除率为无机硒的5倍，是有机硒的2.5倍（畜牧与饲料科学. 2020,41,9）。纳米硒还具有较好的抗菌作用，其抗菌活性受颗粒尺寸的影响（纺织导报. 2020,6,44）。因此，鉴于纳米硒广泛的生物活性，可替代抗生素作为动物健康养殖用抗菌材料。然而，由于纳米硒表面能量高，通常不稳定，在水溶液中容易聚集，导致生物活性和生物利用度下降。
近年来，负载型纳米硒复合材料因其能够获得分散均一且稳定的纳米硒颗粒而得到广泛关注（农业技术与装备. 2021,(01),66）。凹凸棒石是一种层链状含水赋镁铝硅酸盐黏土矿物，具有棒状形貌和孔道结构，赋予其优异的载体性能。以凹凸棒石为载体，能够调控纳米颗粒的生长，得到分散均匀且粒径较小的纳米颗粒，有效提升纳米颗粒的生物活性。此外，将纳米颗粒固载于凹凸棒石棒晶表面能改善其稳定性，提升生物利用率，降低生物毒性。此外，以植物提取物为还原剂和稳定剂制备纳米硒具有绿色无污染、操作简单、成本低的优势，近年来受到了人们的关注。
植物提取物中的酚类物质、蛋白质、多糖和维生素等能够和硒盐反应生成纳米硒（中国农学通报. 2021,37,1）。油橄榄叶中含有大量酚类物质，例如橄榄苦苷、羟基酪醇、芹菜苷、槲皮素、芦丁等，这些化合物均为强效抗氧化剂，具有较好的还原性。此外，油橄榄叶中还含有蛋白质、氨基酸、微生素C等物质（林产化学与工业. 2014,34,97），也能起到还原和稳定纳米颗粒的作用。其中，橄榄苦苷具有较强的广谱抗菌活性，附着于纳米颗粒表面能够扩展材料的抗菌谱（中国油脂. 2020,45,95，食品安全质量检测学报. 2021,12,8178）。因此，通过橄榄叶提取物有望制备得到生物活性更高更广泛的纳米硒复合材料。但是，目前关于油橄榄叶提取物合成凹凸棒石负载的纳米硒复合材料还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法，以油橄榄叶叶中的活性成分为还原剂和稳定剂，一步法合成凹凸棒石负载的纳米硒复合抗菌材料，制备方法简单绿色，产物安全性和稳定性高，具有较好的抗菌和抗氧化活性。
一、纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的制备及结构
本发明利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法，包括如下步骤：
1）将油橄榄叶粉末加入水中，65~75℃水浴提取1~1.5h后过滤，得到油橄榄叶提取物溶液。其中，油橄榄叶提取物和水的固液比（g/mL）为1:5~1:40。
2）在搅拌下将凹凸棒石分散到油橄榄叶提取物溶液中，超声分散均匀后加入亚硒酸钠溶液，得到前驱体混合液。其中，凹凸棒石与亚硒酸钠的质量比为1:0.2~1:1.2；亚硒酸钠在前驱体溶液中的浓度为0.005~0.1mol/L；芦荟提取物溶液与亚硒酸钠溶液体积比为1:1~3:1。
3）将上述前驱体混合液于室温下反应12~72h，所得产物离心洗涤，真空干燥后得到纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料。其中，反应于摇床中进行，摇床转速为100~220rpm；真空干燥是在35~45℃下真空干燥10~15h。
本发明的合成机理为：油橄榄叶提取物中含有橄榄苦苷、羟基酪醇、芹菜苷、槲皮素、芦丁等酚类物质，以及蛋白质、氨基酸、微生素C等化合物，它们能够与硒盐作用还原得到单质硒，同时参与稳定硒纳米颗粒。
图1为本发明合成的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的红外光谱图，1099cm-1处出现的吸收峰和474cm-1处吸收峰强度的变化表明硒纳米颗粒的生成；3402cm-1处峰偏移表明含羟基化合物参与了纳米硒的还原，而1431cm-1处的吸收峰则表示蛋白质和氨基酸等参与了硒纳米颗粒的稳定。图2和图3分别为纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的XRD和紫外吸收光谱图，进一步证明了纳米硒的生成。从图4的热重分析图中可以看出此复合材料主要有三个阶段的失重，其中除了吸附水和结构水的脱除，在300-600°C之间的失重也包括附着于纳米硒表面有机质的分解和部分纳米硒的挥发。
二、纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的性能
本发明制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的抗菌性能，采用琼脂稀释法测试最小抑菌浓度（MIC）来评价，测试方法为：1）将待测样品加入40-50℃的琼脂培养基中，混合均匀后倒入平板，冷却后得到样品平板，平板的样品浓度设为10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1mg/mL；2）吸取1-2µL新鲜菌悬液
（104CFU/mL）菌悬液，接种于样品平板中，的三个不同位置，同时制备阴性对照和阳性对照平板。将接种好的平板于37℃培养箱中培养18-24h。平板中细菌生长被完全抑制的最小样品浓度为MIC。实施例1-5中的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的抗菌性能评价结果见表1，说明本发明制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性。
表1实施例1-5中的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC（mg/mL）
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本发明制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的抗氧化性能，通过测试其对羟基和DPPH自由基的清除率的评价，测试方法如下：
（1）羟基自由基清除率：将1mL浓度为6mmol/L的七水硫酸铁，1mL浓度为9mmol/L水杨酸乙醇溶液和1mL不同浓度的样品（0.1-5 mg·mL-1）添加到10mL试管中，然后添加0.1mL过氧化氢（0.3%），和1mL超纯水启动反应。然后将试管置于37°C水浴中30 min，在510nm处测定吸光度。用超纯水代替样品作为空白组，用0.1 mL超纯水代替H2O2作为对照组。图5表明本发明制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料具有较高的羟基自由基清除能力。
（2）DPPH自由基清除率：取1mL不同浓度的样品乙醇溶液（0.1-5 mg·mL-1）和4mL浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液混合，置于30°C水浴中避光反应30min，然后与517 nm处测定吸光度。用1mL乙醇代替样品作为空白组，4mL乙醇代替DPPH作为对照组。图6表明本发明制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料具有一定DPPH自由基清除能力。
综上所述，本发明采用油橄榄叶提取物介导合成纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料具有以下优点：
1、通过天然凹凸棒石调控硒纳米颗粒的分散性，获得颗粒尺寸较小、分散均匀的纳米硒，提升生物活性和使用安全性。
2、以油橄榄叶水提物还原剂和稳定剂，制备过程绿色、简单，所得纳米复合材料生物相容性和活性高，稳定性好，具有优异的广谱抗菌活性和抗氧化活性。
附图说明
图1为本发明实施例2制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的FTIR谱图；
图2为本发明实施例2制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的XRD谱图；
图3为本发明实施例3制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的UV-vis谱图；
图4为本发明实施例3制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的TG-DTG谱图；
图5为本发明实施例3制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的羟基自由基清除率图；
图6为本发明实施例3制备的纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的DPPH自由基清除率图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法做详细的说明。
实施例1
1）将油橄榄叶叶粉末2.5g加入100mL水中，65℃水浴提取1h后过滤得到油橄榄叶提取物溶液；2）在搅拌下将0.4g凹凸棒石分散到50mL油橄榄叶提取物溶液中，超声处理后滴加50mL亚硒酸钠溶液，得到亚硒酸钠浓度为0.005mol/L前驱体混合液；3）上述前驱体混合液置于摇床中100rpm室温反应48h；所得产物离心洗涤三次，真空35℃干燥10h后得到纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料。
实施例2
1）将油橄榄叶叶粉末5g加入100mL水中，70℃水浴提取1h后过滤得到油橄榄叶提取物溶液；2）在搅拌下将0.45g凹凸棒石分散到80mL油橄榄叶提取物溶液中，超声处理后滴加50mL亚硒酸钠溶液，得到亚硒酸钠浓度为0.01mol/L前驱体混合液；3）上述前驱体混合液置于摇床中130rpm室温反应24h；所得产物离心洗涤三次，真空40℃干燥12h后得到纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料。
实施例3
1）将油橄榄叶叶粉末10g加入100mL水中，70℃水浴提取1h后过滤得到油橄榄叶提取物溶液；2）在搅拌下将0.65g凹凸棒石分散到100mL油橄榄叶提取物溶液中，超声处理后滴加50mL亚硒酸钠溶液，得到亚硒酸钠浓度为0.02mol/L前驱体混合液；3）上述前驱体混合液置于摇床中150rpm室温反应12h；所得产物离心洗涤三次，真空40℃干燥13h后得到纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料。
实施例4
1）将油橄榄叶叶粉末15g加入100mL水中，75℃水浴提取1.2h后过滤得到油橄榄叶提取物溶液；在搅拌下将1.5g凹凸棒石分散到120mL油橄榄叶提取物溶液中，超声处理后滴加50mL亚硒酸钠溶液，得到亚硒酸钠浓度为0.05mol/L前驱体混合液；3）上述前驱体混合液置于摇床中180rpm室温反应72h；所得产物离心洗涤三次，真空45℃干燥14h后得到纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料。
实施例5
1）将油橄榄叶叶粉末20g加入100mL水中，75℃水浴提取1.5h后过滤得到油橄榄叶提取物溶液；2）在搅拌下将2.9g凹凸棒石分散到150mL油橄榄叶提取物溶液中，超声处理后滴加50mL亚硒酸钠溶液，得到亚硒酸钠浓度为0.1mol/L前驱体混合液；3）上述前驱体混合液置于摇床中220rpm室温反应36h；所得产物离心洗涤三次，真空35℃干燥15h后得到纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料。

Claims (3)

1.一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法，包括如下步骤：
1）将油橄榄叶粉末加入水中，65~75℃水浴提取1~1.5h后过滤，得到油橄榄叶提取物溶液；油橄榄叶粉末和水的固液比为1:5~1:40；
2）在搅拌下将凹凸棒石分散到油橄榄叶提取物溶液中，超声分散均匀后加入亚硒酸钠溶液，得到前驱体混合液；凹凸棒石与亚硒酸钠的质量比为1:0.2~1:1.2；亚硒酸钠在前驱体混合液中的浓度为0.005~0.1mol/L；油橄榄叶提取物溶液与亚硒酸钠溶液体积比为1:1~3:1；
3）将上述前驱体混合液于室温下反应12~72h，所得产物离心洗涤，真空干燥后得到纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料。
2.根据权利要求1所述一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法，其特征在于，步骤3）中，反应于摇床中进行，摇床转速为100~220rpm。
3.根据权利要求1所述一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法，其特征在于，步骤3）中，真空干燥是在35~45℃下真空干燥10~15h。
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