CN109678197B - 一种利用植物提取液制备纳米ZnO的方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用植物提取液制备纳米ZnO的方法及其产品和应用，具体方法包括如下步骤：1)将植物材料洗净、烘干后研磨成粉，再将得到的植物粉末溶于去离子水，升温至60～70℃加热4～5h，冷却、过滤后得到植物提取液，所述的植物材料为橄榄、洋甘菊或番茄中的任意一种；2)将步骤(1)得到的植物提取液与ZnO溶液混合升温至60～70℃加热搅拌4～5h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到改性纳米ZnO。本发明方法合成方法简单快速绿色、材料容易获取，得到的纳米ZnO产品具有显著的抑制水稻白叶枯病菌的效果，能够作为防治水稻白叶枯等重要植物病害的抑菌剂。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料的制备领域，涉及绿色生物合成材料技术领域，具体涉及一种利用橄榄、洋甘菊、番茄三种植物提取液制备纳米ZnO的方法及其农业上的应用。
背景技术
纳米ZnO指的是粒径在1～100nm的新型多功能金属氧化物，因其具有粒径小、比表面积大、安全环保、磁性强、吸收和散射紫外线能力强等优势，在化工、材料、生物、陶瓷、橡胶、医药等方面均有广泛的应用及日益广阔的市场前景。
传统纳米ZnO的合成方法主要采用液相法、气相法制备，其中液相沉淀法中洗涤和去除阴离子较为困难，而气相法制备纳米ZnO条件苛刻，工业化困难。此外，传统制备方法具有高污染、高耗能等不足，应加大研究开发成本低、能耗低且操作工艺简单的工业化纳米ZnO制备方法的力度。当前，利用植物材料的根、茎、叶、花、果实等合成纳米材料已成为研究热点，具有无毒、环保、低成本、低消耗、反应条件温和控制，不需添加任何还原剂等优点，是一种“绿色”的新型生产方法。
如专利申请文献CN104355331A公开了一种利用黄蓍胶溶液制备单分散纳米ZnO的方法，具体方法：先制备溶胶凝胶，加入硝酸锌溶液，生成ZnO前驱体，再经过高温煅烧得到纳米ZnO粉末，其主要原理为植物材料中的物质如生物碱、酚类化合物、萜类化合物和辅酶可作为还原剂和稳定剂制备纳米粒子。
当前用作金属杀菌剂的金属仅包括Cu、Ag、Zn，其中铜制剂是最早发现的金属杀菌剂，银离子是目前研究最多的抑菌剂。据已有报道，纳米ZnO作为一种广谱性杀菌材料，能够有效杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，对革兰氏阳性菌与阴性菌具有较强的抑菌作用，广泛应用于医学领域、涂料、包装等。纳米ZnO的抗菌机理主要是利用其粒径小、比表面积大、能够产生活性氧，具有很强的氧化还原作用等特点，通过与细胞膜充分接触和相互作用，使细胞膜损伤、内容物流失而导致细菌的死灭。
水稻白叶枯是世界范围内水稻作物的重要经济病害，由于化学农药的广泛及大量使用导致环境污染和耐药菌株的发展。因此，迫切需要在纳米技术领域上发明一种生物安全、生态友好的新型农用杀菌剂。目前尚未有关于纳米ZnO用作农用抑菌剂防治水稻白叶枯的相关报道，随着科技的进步，未来合成纳米材料技术的生产将朝着低成本、低消耗、低污染发展，未来农业生产中水稻病害的防治也必定朝着可持续、安全、无污染方向发展。
发明内容
本发明目的在于提供了一种利用植物提取液简单制备纳米ZnO的方法，该制备工艺绿色环保、可大规模生产，得到的纳米ZnO具有很好的抑菌效果，可作为水稻白叶枯抗菌剂使用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种利用植物提取液制备纳米ZnO的方法，包括如下步骤：
(1)将植物材料洗净、烘干后研磨成粉，再将得到的植物粉末溶于去离子水，升温至60～70℃加热4～5h，冷却、过滤后得到植物提取液；
(2)将步骤(1)得到的植物提取液与ZnO溶液混合升温至60～70℃加热搅拌4～5h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到改性纳米ZnO；
步骤(1)中，所述的植物材料为橄榄、洋甘菊或番茄中的任意一种。
本发明方法选取橄榄叶、甘菊花和番茄果实均能以较简单的方法合成纳米ZnO，且实验表明，利用所述特定三种植物制得的纳米ZnO能有效抑制水稻白叶枯菌的活性，具有良好的杀菌效果，此外，制备过程中加热温度和时间也影响产物的杀菌效果，因此需要严格控制加热的温度和时间，通过上述三种植物提取液可以得到一种具有极强抑菌效果且结构稳定的纳米ZnO。
步骤(1)中，所述植物提取液与去离子水的体积比为1：100～200，植物提取液用量过高会导致植物材料不必要的浪费，而用量过低相当于降低植物提取液浓度，会导致最终纳米材料合成效率低。
步骤(2)中，所述植物提取液与ZnO溶液的体积比1：1，所述ZnO溶液的浓度为0.1～1mM，ZnO溶液的浓度过低不足以合成纳米ZnO，浓度过高则不仅影响产物结构的稳定性与合成率且还会造成ZnO不必要的浪费。
步骤(2)中，所述搅拌的速率为100～300rpm/min，搅拌速率过低会使得提取液与ZnO溶液接触不够多、反应不够充分，搅拌速率过高则可能破坏产物结构并造成不必要的资源浪费。
步骤(2)中，所述离心转速为8000～10000rcf/min，离心时间为10～20min，离心速率过低、时间过短，会导致上清不够澄清，最终获得的纳米粉末含杂质。
本发明还公开了根据上述方法制得的纳米ZnO及其作为农用杀菌剂在防治水稻白叶枯病中的应用。
具体应用方法为：将所述纳米ZnO溶于水制得浓度为4～8μg/ml的纳米ZnO溶液，再将纳米ZnO溶液均匀喷施与可能爆发白叶枯病害的水稻苗上。
本发明创造性的发现了制得的纳米ZnO对当前引起我国严重发生的水稻白叶枯病害病原物具有较强的抑菌效果，因此将其制成浓度为4～8μg/ml的纳米ZnO溶液作为农用杀菌剂使用，这是由于实验表明该浓度范围内的抗菌剂对水稻白叶枯病菌已有较好的抑制效果，已经可以对水稻白叶枯病害进行有效防治，因此没必要使抗菌剂浓度过高，且抗菌剂浓度过高会使水稻上残留过量的抗菌剂，不仅影响食品安全还会给环境带来负担。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明的制备工艺简单、绿色环保、无需催化剂、成本低、能源消耗相对较少，十分适用于大规模生产；
(2)本发明得到的纳米ZnO的平均粒径小、结构稳定，其抑菌效果显著，能够杀死绝大多数白叶枯病原物，将其应用于防治水稻白叶枯病中有很好的防治效果，且应用方式简单易行，在农业生产领域中有广阔的应用和推广前景。
附图说明
图1为实施例1～3中利用橄榄、洋甘菊、番茄制备ZnONPs的流程图；
图2为实施例1～3中利用橄榄、洋甘菊、番茄制得的ZnONPs的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图；
图3为实施例1～3中利用橄榄、洋甘菊、番茄制得的ZnONPs的XRD图；
图4为实施例1～3中利用橄榄、洋甘菊、番茄制得的ZnONPs的SEM显微照片图；
图5为实施例1～3中利用橄榄、洋甘菊、番茄制得的ZnONPs的SEM-EDS显微照片谱图；
图6为实施例1～3中利用橄榄、洋甘菊、番茄制得的ZnONPs在TEM下观察到的平均粒径图及其分析图；
图7为实施例1～3中利用橄榄、洋甘菊、番茄制得的不同浓度的ZnONPs对水稻白叶枯病菌的生长、生物膜形成影响分析图；
图8为实施例1～3中观察水稻白叶枯病菌细胞壁TEM照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
实施例1利用橄榄叶提取液合成纳米ZnO
(1)植物提取液制备：选取新鲜橄榄叶，经过洗净、烘干后研磨成粉末，可真空保存于-10℃冰箱中；再将得到的橄榄叶粉末与去离子水按1：100比例溶解混匀，在70℃下高温加热4h，室温冷却后用滤纸过滤两次，最终收集滤液，得到黄色的橄榄叶提取液；
(2)纳米ZnO的合成：将得到的橄榄叶提取液与1mM的ZnO溶液按体积比为1：1进行混合，在速率为100rpm/min的磁力搅拌器条件下，加热至70℃连续搅拌4h；再离心20min，离心转速为10000rcf/min，取沉淀，用去离子水洗涤两次后，采用真空冷冻干燥法制备成粉状颗粒，即为纳米ZnO(ZnONPs)。
(一)ZnONPs特征分析
利用紫外可见吸收光谱(UV-VIS)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、能谱图(EDS)、透射电子显微镜(TEM)对合成的ZnONPs形态结构进行分析评价。
图2显示ZnONPs的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图，由图2曲线A可知，利用橄榄叶合成纳米ZnONPs在384nm处有最大吸收峰，在ZnO粉末特征吸收峰范围内；图3A显示的是ZnONPs的XRD图，其特征峰和ZnO粉体衍射图的特征峰相符合，说明该生物合成法可以获得稳定的ZnO粉体，通过Debye-Scherrer公式计算得其平均粒径为48.2nm；图4为得到的ZnONPs的SEM显微照片，由图4A、B可知，所得到的ZnONPs形貌保持良好；图5为制得的ZnONPs能谱图，由图5B可知，样品中仅有Zn与O元素的存在，表明纳米ZnO的存在。由TEM分析图6D，其粒径大小范围10～60nm。
(二)ZnONPs杀菌效果评价
将不同质量的ZnONPs溶于去离子水配制成4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的ZnONPs溶液与水稻白叶枯病菌互作，通过测定细菌的生长(图7A、B)、生物膜形成(图7C)，判断ZnONPs抑菌活性。
由图7可知，16μg/ml浓度下细菌生长抑制率达67.5％，抑菌圈直径减少48.5％，生物膜生长抑制率高达83.3％，由此可知，随着ZnONPs浓度升高，其杀菌效果越好。
(三)观察细菌细胞壁结构
为了直观判断ZnONPs对细菌生物膜的破坏程度，利用TEM观察水稻白叶枯菌细胞壁，发现空白对照组细胞壁完好(图8A)而8μg/ml ZnONPs抑菌材料处理下细菌的细胞壁损伤、细胞明显有内容物流出(图8B)。
实施例2利用洋甘菊提取液合成纳米ZnO
(1)植物提取液制备：选取新鲜洋甘菊，经过洗净、烘干后研磨成粉末，可真空保存于-10℃冰箱中；再将得到的洋甘菊粉末与去离子水按1：200比例溶解混匀，在65℃下高温加热5h，室温冷却后用滤纸过滤两次，最终收集滤液，得到黄色的洋甘菊提取液；
(2)纳米ZnO的合成：将洋甘菊提取液与0.1mM的ZnO溶液按体积比为1：1进行混合，在速率为200rpm/min的磁力搅拌器条件下，加热至65℃连续搅拌5h；再离心20min，离心转速为9000rcf/min，取沉淀，用去离子水洗涤两次后，采用真空冷冻干燥法制备成粉状颗粒，即为纳米ZnO(ZnONPs)。
(一)ZnONPs特征分析
利用紫外可见吸收光谱(UV-VIS)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、能谱图(EDS)、透射电子显微镜(TEM)对合成的ZnONPs形态结构进行分析评价。
图2显示ZnONPs的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图，由图2曲线B可知，利用洋甘菊合成纳米ZnONPs在380nm处有最大吸收峰，在ZnO粉末特征吸收峰范围内；图3B显示的是ZnONPs的XRD图，其特征峰和ZnO粉体衍射图的特征峰相符合，说明该生物合成法可以获得稳定的ZnO粉体，通过Debye-Scherrer公式计算得其平均粒径为65.4nm；图4为得到的ZnONPs的SEM显微照片，由图4C、D可知，所得到的ZnONPs形貌保持良好；图5为制得的ZnONPs能谱图，由图5D可知，样品中仅有Zn与O元素的存在，表明纳米ZnO的存在。由TEM分析图6E，其粒径大小范围20～70nm。
(二)ZnONPs杀菌效果评价
将不同质量的ZnONPs溶于去离子水配制成4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的ZnONPs溶液与水稻白叶枯病菌互作，通过测定细菌的生长(图7A、B)、生物膜形成(图7C)，判断ZnONPs抑菌活性。
由图7可得，16μg/ml浓度下细菌生长抑制率达51.9％，抑菌圈直径减少62.4％，生物膜生长抑制率高达79.4％，由此可知，随着ZnONPs浓度升高，其杀菌效果越好。
(三)观察细菌细胞壁结构
为了直观判断ZnONPs对细菌生物膜的破坏程度，利用TEM观察水稻白叶枯菌细胞壁，发现空白对照组细胞壁完好(图8A)而8g/ml ZnONPs抑菌材料处理下细菌的细胞壁损伤、细胞明显有内容物流出(图8C)。
实施例3利用番茄提取液合成纳米ZnO
(1)植物提取液制备：选取新鲜番茄，经过洗净、烘干后研磨成粉末，可真空保存于-10℃冰箱中；再将得到的番茄粉末与去离子水按1：100比例溶解混匀，在60℃下高温加热4h，室温冷却后用滤纸过滤两次，最终收集滤液，得到褐色的番茄提取液；
(2)纳米ZnO的合成：将番茄提取液与1mM的ZnO溶液按体积比为1：1进行混合，在速率为300rpm/min的磁力搅拌器条件下，加热至60℃连续搅拌4h；再离心15min，离心转速为8000rcf/min，取沉淀，用去离子水洗涤两次后，采用真空冷冻干燥法制备成粉状颗粒，即为纳米ZnO(ZnONPs)。
(一)ZnONPs特征分析
利用紫外可见吸收光谱(UV-VIS)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、能谱图(EDS)、透射电子显微镜(TEM)对合成的ZnONPs形态结构进行分析评价。
图2显示ZnONPs的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图，由图2曲线C可知，利用番茄合成纳米ZnONPs在386nm处有最大吸收峰，在ZnO粉末特征吸收峰范围内；图3C显示的是ZnONPs的XRD图，其特征峰和ZnO粉体衍射图的特征峰相符合，说明该生物合成法可以获得稳定的ZnO粉体，通过Debye-Scherrer公式计算得其平均粒径为61.6nm；图4为得到的ZnONPs的SEM显微照片，由图4E、F可知，所得到的ZnONPs形貌保持良好；图5为制得的ZnONPs能谱图，由图5F可知，样品中仅有Zn与O元素的存在，表明纳米ZnO的存在。由TEM分析图6F，其粒径大小范围10～80nm。
(二)ZnONPs杀菌效果评价
将不同质量的ZnONPs溶于去离子水配制成4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的ZnONPs溶液与水稻白叶枯病菌互作，通过测定细菌的生长(图7A、B)、生物膜形成(图7C)，判断ZnONPs抑菌活性。
由图7可得，16μg/ml浓度下细菌生长抑制率达55.6％，抑菌圈直径减少54.5％，生物膜生长抑制率高达75.2％，由此可知，随着ZnONPs浓度升高，其杀菌效果越好。
(三)观察细菌细胞壁结构
为了直观判断ZnONPs对细菌生物膜的破坏程度，利用TEM观察水稻白叶枯菌细胞壁，发现空白对照组细胞壁完好(图8A)而8g/ml ZnONPs抑菌材料处理下细菌的细胞壁损伤、细胞明显有内容物流出(图8D)。
应用例1
在温室中或田间称取实施例1得到的ZnONPs粉末0.2g溶于50L水中配制成4μg/mlZnONPs溶液，均匀喷施在可能产生白叶枯病害的水稻苗上，观察发现喷施过ZnONPs溶液的水稻苗较未喷施的水稻苗生长较好，由此可以说明ZnONPs溶液能够有效地对水稻苗进行病害防治。
应用例2
在温室中或田间称取实施例1得到的ZnONPs粉末0.4g溶于50L水中配制成8μg/mlZnONPs溶液，均匀喷施在可能产生白叶枯病害的水稻苗上，观察发现喷施过ZnONPs溶液的水稻苗较未喷施的水稻苗生长较好，由此可以说明ZnONPs溶液能够有效地对水稻苗进行病害防治。
Claims (4)
1.一种利用植物提取液制备具有抑制水稻白叶枯病菌活性的纳米ZnO的方法，包括如下步骤：
(1)将植物材料洗净、烘干后研磨成粉，再将得到的植物粉末溶于去离子水，升温至60～70℃加热4～5h，冷却、过滤后得到植物提取液；
(2)将步骤(1)得到的植物提取液与ZnO溶液混合升温至60～70℃加热搅拌4～5h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到改性纳米ZnO；
步骤(1)中，所述的植物材料为洋甘菊；
步骤(2)中，所述植物提取液与ZnO溶液的体积比1：1，所述ZnO溶液的浓度为0.1～1mM；
所述的改性纳米ZnO的平均粒径为65.4nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述植物粉末与去离子水的体积比为1：100～200。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述搅拌的速率为100～300rpm/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心转速为8000～10000rcf/min，离心时间为10～20min。
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