CN114235798A - 一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，包括以下：步骤a，制备第一样液；步骤b，制备第二样液；步骤c，固相萃取，制备第三样液；步骤d，进行第一次现象观察，及第二次现象观察；步骤e，结果判定。本发明的检测方法将宠物粮中的挥发性盐基氮通过固相萃取的方式富集提取，并与苯磺酰氯、氢氧化钠和盐酸依次进行两步反应，通过两次观察，根据两次反应是否有沉淀生成，进行定性判定，对宠物粮是否使用腐败肉进行快速检测，分析手段简便、专属性强、灵敏度高、现象明显，便于定性判定，不需要使用大型分析仪器及剧毒或致癌等危险试剂，对实验环境及实验人员的危害低，适用于对宠物粮进行大规模抽检或消费者自行检测。

Description

一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法

技术领域

本发明涉及宠物粮检测领域，特别是涉及一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法。

背景技术

挥发性盐基氮（TVB-N）指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质，其中胺类物质主要是伯胺、仲胺和叔胺。此类物质具有挥发性，其含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，特别是蛋氨酸和酪氨酸，因此营养价值大受影响，是反映原料鱼和肉的鲜度的主要指标。现今宠物食品中成分的检测依据是2018年农业部发布的《宠物饲料卫生规定》，但其中检测参数较少，还不能做到全覆盖。宠物食品往往在配料表中模糊的标示鱼肉、鸡肉等，不法商贩使用腐败肉作为原材料，蛋白质含量标示虚高且容易带来病毒感染，有害宠物健康，损害消费者利益。如果使用腐败肉类制作宠物粮，那么宠物粮中必含有挥发性盐基氮。

现有检测TVB-N的方法，主要为以下四种：（1）半微量定氮法，原理：蛋白质在酶和细菌的作用下分解后产生碱性含氮物质，有氨、伯胺、仲胺等，此类物质具有挥发性，可在碱性溶液中被蒸馏出来，用标准酸滴定，计算含量；（2）凯氏定氮仪法，原理：根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量的仪器；（3）微量扩散法，原理：挥发性含氮物质在碱性溶液中释出，在扩散皿中于37℃时挥发后吸收于吸收液中，用标准酸滴定，计算含量；（4）乙酰丙酮-甲醛分光光度法，原理：在醋酸盐缓冲液存在的条件下，pH值控制在5-6 时,乙酰丙酮-甲醛试剂与待测物反应，生成黄色化合物，颜色深浅与氮的含量在线性范围内成正比，与标准比较进行定量。

以上方法中，第（1）法与第（3）法通过酸碱滴定的方式检测，受环境、基质及其他因素干扰非常严重，往往会出现假阳性或假阴性的情况，检测结果准确度较低。第（2）法通过计算氮的含量来检测，对基质负责的样本及其他含氮物质来讲，影响很大，不适用于宠物食品。第（4）法中甲醛在ph小于6时，与乙酰丙酮在缓冲液中已经会产生黄色物质，该方法再通过反应只是加深颜色，对结果影响有限，同时在目标物含量较低的情况下，此方法不适用，在基质复杂的样品中也不适用于该方法，该方法只适用于直接检测肉类样品，不适用于检测加工后的含肉类制品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，包括以下：

步骤a，称取1g±0.1待测宠物粮样品，粉碎后置于离心管中，加入纯净水、氯化钠溶液，震荡，离心，取上层清液，得到第一样液；将待测宠物粮样品粉碎，加入纯净水，便于宠物粮样品中的挥发性盐基氮溶出，便于提取；加入氯化钠溶液，提高水相的极性，通过盐析，抑制乳化层的形成，同时提高样品中的油脂及挥发性盐基氮在水相中的溶解度，减少样品中的油脂在管壁的附着，同时可减少油脂对待测物即挥发性盐基氮的包裹，提高对挥发性盐基氮的萃取效率，将挥发性盐基氮萃取到第一样液中；

步骤b，向第一样液中加入柠檬酸溶液、聚酰胺粉，震荡，加入甲醇-乙酸溶液，并补充加入纯净水，使溶液体积至6ml，震荡，离心，取上层清液，得到第二样液；加入柠檬酸和聚酰胺粉用于去除第一样液中的色素及吸附部分蛋白质，加入甲醇-乙酸溶液，经过震荡和离心处理，溶液分层，将第一样液中的挥发性盐基氮萃取到上层有机相中，即第二样液中；

步骤c，使用活化液对固相萃取柱进行活化处理，将第二样液加入活化后的固定萃取柱中进行上样处理，使用淋洗液对上样后的固相萃取柱进行淋洗，并收集洗脱液，得到第三样液，活化液中甲醇与水的体积比为5:95，淋洗液中乙酸乙酯与甲醇的体积比为95:5，并按照质量体积分数0.5%向其中添加三乙胺；固相萃取柱对第二样液中的挥发性盐基氮进行吸附，利用淋洗液对吸附的挥发性盐基氮物质进行洗脱，进一步将第二样液中的挥发性盐基氮进行富集到第三样液中；

步骤d，将第三样液使用氮气吹干，使用氢氧化钠的乙醇溶液进行复溶，置于离心管或透明西林瓶中，得到待测样液，向待测样液中逐滴加入苯磺酰氯的乙醇溶液，每加入1滴苯磺酰氯的乙醇溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴苯磺酰氯的乙醇溶液后静置，进行第一次现象观察，再加入2ml纯净水，混匀后，逐滴加入盐酸溶液，每加入1滴盐酸溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴盐酸溶液后静置，进行第二次现象观察；挥发性盐基氮中的胺类物质包括伯胺、仲胺和叔胺，因叔胺在该步骤中通过两次反应均无沉淀生成，因此本方法不对叔胺进行定性鉴定，同样步骤c的淋洗液中添加有三乙胺也不会对本方法的结果判定产生干扰。本方法是通过两次反应对伯胺和仲胺进行定性鉴定，进而判断待测宠物粮样品中是否含有挥发性盐基氮，根据样品中是否含有挥发性盐基氮，判断是否使用腐败肉制作宠物粮。该步骤中伯胺的反应如下反应式（1）~（2）所示：

（1）

（2）

该步骤中仲胺的反应如下反应式（3）所示：

（3）

该步骤中叔胺的反应如下反应式（4）所示：

（4）

该步骤中，伯胺与苯磺酰氯和氢氧化钠发生反应式（1）所示的反应，生成第一反应物，第一反应物可溶于水，反应后进行第一次现象观察时没有生成沉淀，加入盐酸后，第一反应物与盐酸发生发应，生成第二反应物，第二反应物为沉淀，进行第二次现象观察时，观察到有沉淀生成；仲胺与苯磺酰氯和氢氧化钠发生反应式（3）所示的反应，生成第三反应物，第三反应物为沉淀，反应后进行第一次现象观察时观察到有沉淀生成；叔胺与苯磺酰氯和氢氧化钠不发生反应，第一次现象观察时没有沉淀生成，加入盐酸后，叔胺与盐酸发生反应式（4）所示的反应，生成第四反应物，第四反应物可溶于水，第二次现象观察时观察到没有沉淀生成；

步骤e，结果判定：第一次现象观察时，有沉淀产生，第二次现象观察时，沉淀量增多，判定为阳性，即待测宠物粮样品中有使用腐败肉；第一次现象观察时无沉淀产生，第二次现象观察时无沉淀产生，或两次现象观察时仅有一次产生沉淀，判定为阴性，即待测宠物粮样品中没有使用腐败肉。肉类在腐败过程中，产生的挥发性盐基氮中包含伯胺、仲胺和叔胺三种胺类物质，不可能只含有伯胺或只含有仲胺。使用腐败肉制作的宠物粮中必然也含有伯胺、仲胺和叔胺三种胺类物质，其中叔胺在反应过程中不产生沉淀，因此只选择伯胺和仲胺进行定性鉴定。第一次现象观察有沉淀生成，可以推断出待测样液中含有仲胺，第二次现象观察时沉淀量增多，说明加入盐酸后，与盐酸反应有沉淀生成，可以推断出待测样液中含有伯胺，待测样液中既含有伯胺又含有仲胺，则判定为阳性，即待测宠物粮样品中含有挥发性盐基氮，待测宠物粮样品中有使用腐败肉；

第一次现象观察无沉淀生成，第二次现象观察时无沉淀生成，可以推断出待测样液中不含有伯胺和仲胺，因此判定为阴性，即待测宠物粮样品中不含有挥发性盐基氮，待测宠物粮样品中没有使用腐败肉；

第一次现象观察有沉淀生成，可以推断出待测样液中含有仲胺，第二次现象观察时沉淀量没有增加，说明加入盐酸后，没有与盐酸反应生成沉淀，可以推断出待测样液中不含有伯胺，待测样液中含有仲胺不含有伯胺，则判定为阴性，即待测宠物粮样品中不含有挥发性盐基氮，待测宠物粮样品中没有使用腐败肉；

第一次现象观察无沉淀生成，第二次现象观察时有沉淀生成，可以推断出待测样液中不含有仲胺含有伯胺，则判定为阴性，即待测宠物粮样品中不含有挥发性盐基氮，待测宠物粮样品中没有使用腐败肉；在该步骤中，待测样液中只有同时含有伯胺和仲胺，才能判定为阳性，避免假阳性结果的出现，排除其他因素干扰，提高检测的准确度。

本发明的有益效果：本发明的检测方法以挥发性盐基氮作为腐败肉的指示物，将宠物粮中的挥发性盐基氮（主要是伯胺和仲胺）通过固相萃取的方式富集提取，并与苯磺酰氯、氢氧化钠和盐酸依次进行两步反应，通过两次观察，根据两次反应是否有沉淀生成，进行定性判定，对宠物粮是否使用腐败肉进行快速检测，分析手段简便、专属性强、灵敏度高、现象明显，便于定性判定，不需要使用大型分析仪器，不需要使用剧毒或致癌等危险试剂，对实验环境及实验人员的危害低，适用于抽检或消费者自行检测，对宠物粮的市场推广有一定促进作用，具有较好的社会效益与经济效益。

在一些实施方式中，待测宠物粮样品为干性宠物粮、半湿性宠物粮或湿性宠物粮中的一种。本方法可以对各种种类及性状的宠物粮进行检测，不受宠物粮种类及性状的影响。

在一些实施方式中，步骤a中氯化钠溶液为20℃条件下配制的饱和氯化钠溶液。宠物粮中含有较多油脂，加入饱和氯化钠溶液，可以提高水相的极性，通过盐析，抑制乳化层的形成，同时提高宠物粮样品中的油脂及挥发性盐基氮在水相中的溶解度，减少样品中的油脂在管壁的附着，减少油脂对待测物即挥发性盐基氮的包裹，提高对挥发性盐基氮的萃取效率。

在一些实施方式中，步骤b中的柠檬酸溶液是质量体积分数为20%的柠檬酸溶液。加入柠檬酸溶液，可以去除溶液中的部分色素，并吸附部分蛋白质，用于对溶液脱色。

在一些实施方式中，步骤b中甲醇-乙酸溶液中甲醇与乙酸的体积为3:2。甲醇-乙酸溶液作为萃取剂对溶液中的挥发性盐基氮进行萃取提取。

在一些实施方式中，固相萃取柱的上层填料为100mg石墨化碳黑，固相萃取柱的下层填料为100mg中性氧化铝，固相萃取柱的柱管尺寸为3ml，固相萃取柱的填料粒径为120-150μm，固相萃取柱的填料的平均孔径为120Å。采用填料为石墨化碳黑和中性氧化铝的固相萃取柱对第二样液进行萃取处理，固相萃取柱吸附挥发性盐基氮中的胺类物质，通过淋洗液将胺类物质洗脱，并收集。

在一些实施方式中，步骤c中上样处理的上样流速为1ml/min，淋洗液以1ml/min的淋洗流速对固相萃取柱进行淋洗。淋洗液对固相萃取柱进行淋洗，将固相萃取柱吸附的挥发性盐基氮洗脱下来。

在一些实施方式中，步骤d中氢氧化钠的乙醇溶液为1mol/L的氢氧化钠的乙醇溶液，苯磺酰氯的乙醇溶液为0.2mol/L的苯磺酰氯的乙醇溶液。氢氧化钠和苯磺酰氯均与伯胺或仲胺进行反应，用于对伯胺或仲胺进行定性鉴定。

在一些实施方式中，步骤d中盐酸溶液是质量分数为36%~38%的盐酸溶液。盐酸与伯胺的第一次反应的产物进行反应，用于对伯胺进行定性鉴定。

在一些实施方式中，步骤a中离心转速为10000rpm/min，步骤b中离心转速为4000rpm/min。离心处理便于样液分层，便于挥发性盐基氮的萃取。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例中乙酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸乙酯，柠檬酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的99.5%无水柠檬酸，聚酰胺粉选择国药集团化学试剂有限公司供应的80-100目聚酰胺粉，甲醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯甲醇，乙酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸，氯化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氯化钠，氢氧化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氢氧化钠，三乙胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的99.5%三乙胺，乙醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙醇，苯磺酰氯选择国药集团化学试剂有限公司供应的99.0%苯磺酰氯，盐酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的质量分数为36%~38%的盐酸溶液；固相萃取柱选择赛默飞世尔科技公司供应的石墨化碳黑-中性氧化铝固相萃取柱；

1mol/L的氢氧化钠的乙醇溶液：称取40g氢氧化钠于烧杯中，用乙醇溶解后，用玻璃棒引流注入1000ml容量瓶，然后定容至刻度线；

甲醇-乙酸溶液：取240ml甲醇与160ml乙酸溶液混合均匀后待用；

柠檬酸溶液：取10g无水柠檬酸于烧杯中，用蒸馏水溶解后，用玻璃棒引流注入50ml容量瓶，然后定容至刻度线；

0.2mol/L的苯磺酰氯的乙醇溶液：称取35.32g苯磺酰氯于烧杯中，用乙醇溶解后，用玻璃棒引流注入1000ml容量瓶，然后定容至刻度线；

饱和氯化钠溶液：在20℃条件下，称取36.0g氯化钠于烧杯中，用蒸馏水溶解后，用玻璃棒引流注入100ml容量瓶，然后定容至刻度线；

淋洗液：称取0.5g三乙胺于烧杯中，量取95ml乙酸乙酯、5ml甲醇分别加入烧杯中，搅拌混合均匀；

以下实施例2-5均采用本实施例1中的试剂。

实施例2

本发明的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，包括以下：

步骤a，称取1g±0.1待测干性宠物粮样品，粉碎后置于15ml离心管中，加入2ml纯净水、1ml饱和氯化钠溶液（20℃条件下配制），震荡3min，10000rpm/min离心2min，取1ml上层清液于另一只15ml离心管中，得到第一样液；

步骤b，向第一样液中加入100μl柠檬酸溶液、0.2g聚酰胺粉，震荡30s，加入0.8ml甲醇-乙酸溶液，并补充加入纯净水，使溶液体积至6ml，震荡10s，4000rpm/min离心2min，取全部上层清液，得到第二样液；

步骤c，使用活化液对石墨化碳黑-中性氧化铝固相萃取柱进行活化处理，将第二样液以1ml/min的上样流速加入活化后的石墨化碳黑-中性氧化铝固定萃取柱中进行上样处理，弃去滤液，使用200μl淋洗液以1ml/min的淋洗流速对上样后的固相萃取柱进行淋洗，并收集洗脱液，得到第三样液，活化液中甲醇与水的体积比为5:95，淋洗液中乙酸乙酯与甲醇的体积比为95:5，并按照质量体积分数0.5%向其中添加三乙胺；

步骤d，将第三样液使用氮气在60℃下吹干，加入2ml 1mol/L的氢氧化钠的乙醇溶液进行复溶，并将复溶液置于10ml离心管中，得到待测样液，向待测样液中逐滴加入0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液，每加入1滴0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液后静置1min，进行第一次现象观察，再加入2ml纯净水，轻摇混匀后，逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，每加入1滴1mol/L的盐酸溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴1mol/L的盐酸溶液后静置1min，进行第二次现象观察；

步骤e，结果判定：第一次现象观察时，有沉淀产生，第二次现象观察时，沉淀量增多，判定为阳性，即干性待测宠物粮样品中含有挥发性盐基氮，干性待测宠物粮样品有使用腐败肉。

实施例3

本发明的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，包括以下：

步骤a，称取1g±0.1待测半湿性宠物粮样品，碾碎后置于15ml离心管中，加入4ml纯净水、2ml饱和氯化钠溶液（20℃条件下配制），震荡4min，10000rpm/min离心3min，取2ml上层清液于另一只15ml离心管中，得到第一样液；

步骤b，向第一样液中加入100μl柠檬酸溶液、0.2g聚酰胺粉，震荡30s，加入0.8ml甲醇-乙酸溶液，并补充加入纯净水，使溶液体积至6ml，震荡10s，4000rpm/min离心2min，取全部上层清液，得到第二样液；

步骤c，使用活化液对石墨化碳黑-中性氧化铝固相萃取柱进行活化处理，将第二样液以1ml/min的上样流速加入活化后的石墨化碳黑-中性氧化铝固定萃取柱中进行上样处理，弃去滤液，使用200μl淋洗液以1ml/min的淋洗流速对上样后的固相萃取柱进行淋洗，并收集洗脱液，得到第三样液，活化液中甲醇与水的体积比为5:95，淋洗液中乙酸乙酯与甲醇的体积比为95:5，并按照质量体积分数0.5%向其中添加三乙胺；

步骤d，将第三样液使用氮气在60℃下吹干，加入2ml 1mol/L的氢氧化钠的乙醇进行复溶，并将复溶液置于10ml透明西林瓶中，得到待测样液，向待测样液中逐滴加入0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液，每加入1滴0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液后静置1min，进行第一次现象观察，再加入2ml纯净水，轻摇混匀后，逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，每加入1滴1mol/L的盐酸溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴1mol/L的盐酸溶液后静置1min，进行第二次现象观察；

步骤e，结果判定：第一次现象观察时无沉淀产生，第二次现象观察时无沉淀产生，即可判定为阴性，即待测半湿性宠物粮样品中不含有挥发性盐基氮，待测半湿性宠物粮样品中没有使用腐败肉。

实施例4

本发明的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，包括以下：

步骤a，称取1g±0.1待测湿性宠物粮样品，压碎后置于15ml离心管中，加入2ml纯净水、1ml饱和氯化钠溶液（20℃条件下配制），震荡3min，10000rpm/min离心2min，取1ml上层清液于另一只15ml离心管中，得到第一样液；

步骤b，向第一样液中加入100μl柠檬酸溶液、0.2g聚酰胺粉，震荡30s，加入0.8ml甲醇-乙酸溶液，并补充加入纯净水，使溶液体积至6ml，震荡10s，4000rpm/min离心2min，取上层清液，得到第二样液；

步骤c，使用活化液对石墨化碳黑-中性氧化铝固相萃取柱进行活化处理，将第二样液以1ml/min的上样流速加入活化后的石墨化碳黑-中性氧化铝固定萃取柱中进行上样处理，弃去滤液，使用200μl淋洗液以1ml/min的淋洗流速对上样后的固相萃取柱进行淋洗，并收集洗脱液，得到第三样液，活化液中甲醇与水的体积比为5:95，淋洗液中乙酸乙酯与甲醇的体积比为95:5，并按照质量体积分数0.5%向其中添加三乙胺；

步骤d，将第三样液使用氮气在60℃下吹干，加入2ml 1mol/L的氢氧化钠的乙醇进行复溶，并将复溶液置于10ml透明西林瓶中，得到待测样液，向待测样液中逐滴加入0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液，每加入1滴0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液后静置1min，进行第一次现象观察，再加入2ml纯净水，轻摇混匀后，逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，每加入1滴1mol/L的盐酸溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴1mol/L的盐酸溶液后静置1min，进行第二次现象观察；

步骤e，结果判定：第一次现象观察时有沉淀产生，第二次现象观察时沉淀量不增加，即可判定为阴性，即待测湿性宠物粮样品中不含有挥发性盐基氮，待测湿性宠物粮样品中没有使用腐败肉。

实施例5

步骤a，称取1g±0.1待测湿性宠物粮样品，压碎后置于15ml离心管中，加入4ml纯净水、2ml饱和氯化钠溶液（20℃条件下配制），震荡3min，10000rpm/min离心2min，取2ml上层清液于另一只15ml离心管中，得到第一样液；

步骤b，向第一样液中加入100μl柠檬酸溶液、0.2g聚酰胺粉，震荡30s，加入0.8ml甲醇-乙酸溶液，并补充加入纯净水，使溶液体积至6ml，震荡10s，4000rpm/min离心2min，取上层清液，得到第二样液；

步骤c，使用活化液对石墨化碳黑-中性氧化铝固相萃取柱进行活化处理，将第二样液以1ml/min的上样流速加入活化后的石墨化碳黑-中性氧化铝固定萃取柱中进行上样处理，弃去滤液，使用200μl淋洗液以1ml/min的淋洗流速对上样后的固相萃取柱进行淋洗，并收集洗脱液，得到第三样液，活化液中甲醇与水的体积比为5:95，淋洗液中乙酸乙酯与甲醇的体积比为95:5，并按照质量体积分数0.5%向其中添加三乙胺；

步骤d，将第三样液使用氮气在60℃下吹干，加入2ml 1mol/L的氢氧化钠的乙醇进行复溶，并将复溶液置于10ml离心管中，得到待测样液，向待测样液中逐滴加入0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液，每加入1滴0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴0.2mol/L苯磺酰氯的乙醇溶液后静置1min，进行第一次现象观察，再加入2ml纯净水，轻摇混匀后，逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，每加入1滴1mol/L的盐酸溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴1mol/L的盐酸溶液后静置1min，进行第二次现象观察；

步骤e，结果判定：第一次现象观察时无沉淀产生，第二次现象观察时沉淀产生，即可判定为阴性，即待测湿性宠物粮样品中不含有挥发性盐基氮，待测湿性宠物粮样品中没有使用腐败肉。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，包括以下：

步骤a，称取1g±0.1待测宠物粮样品，粉碎后置于离心管中，加入纯净水、氯化钠溶液，震荡，离心，取上层清液，得到第一样液；

步骤b，向所述第一样液中加入柠檬酸溶液、聚酰胺粉，震荡，加入甲醇-乙酸溶液，并补充加入纯净水，使溶液体积至6ml，震荡，离心，取上层清液，得到第二样液；

步骤c，使用活化液对固相萃取柱进行活化处理，将所述第二样液加入活化后的固定萃取柱中进行上样处理，使用淋洗液对上样后的固相萃取柱进行淋洗，并收集洗脱液，得到第三样液，所述活化液中甲醇与水的体积比为5:95，所述淋洗液中乙酸乙酯与甲醇的体积比为95:5，并按照质量体积分数0.5%向其中添加三乙胺；

步骤d，将所述第三样液使用氮气吹干，使用氢氧化钠的乙醇溶液进行复溶，置于离心管或透明西林瓶中，得到待测样液，向所述待测样液中逐滴加入苯磺酰氯的乙醇溶液，每加入1滴苯磺酰氯的乙醇溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴苯磺酰氯的乙醇溶液后静置，进行第一次现象观察，再加入2ml纯净水，混匀后，逐滴加入盐酸溶液，每加入1滴盐酸溶液后轻摇1-2次，累计加入10滴盐酸溶液后静置，进行第二次现象观察；

步骤e，结果判定：第一次现象观察时，有沉淀产生，第二次现象观察时，沉淀量增多，判定为阳性，即所述待测宠物粮样品中有使用腐败肉；第一次现象观察时无沉淀产生，第二次现象观察时无沉淀产生，或两次现象观察时仅有一次产生沉淀，判定为阴性，即所述待测宠物粮样品中没有使用腐败肉。

2.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述待测宠物粮样品为干性宠物粮、半湿性宠物粮或湿性宠物粮中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述步骤a中氯化钠溶液为20℃条件下配制的饱和氯化钠溶液。

4.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述步骤b中的柠檬酸溶液是质量体积分数为20%的柠檬酸溶液。

5.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述步骤b中甲醇-乙酸溶液中甲醇与乙酸的体积为3:2。

6.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述固相萃取柱的上层填料为100mg石墨化碳黑，所述固相萃取柱的下层填料为100mg中性氧化铝，所述固相萃取柱的柱管尺寸为3ml，所述固相萃取柱的填料粒径为120-150μm，所述固相萃取柱的填料的平均孔径为120Å。

7.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述步骤c中上样处理的上样流速为1ml/min，所述淋洗液以1ml/min的淋洗流速对所述固相萃取柱进行淋洗。

8.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述步骤d中氢氧化钠的乙醇溶液为1mol/L的氢氧化钠的乙醇溶液，所述苯磺酰氯的乙醇溶液为0.2mol/L的苯磺酰氯的乙醇溶液。

9.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述步骤d中盐酸溶液是质量分数为36%~38%的盐酸溶液。

10.根据权利要求1所述的一种宠物粮中使用腐败肉的检测方法，其特征在于，所述步骤a中离心转速为10000rpm/min，所述步骤b中离心转速为4000rpm/min。