CN114128869B - 一种低盐酱油的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于调味品加工技术领域，涉及一种低盐酱油的生产方法。步骤为：大豆或豆粕充分浸泡后进行蒸煮，然后与面粉或麸皮或粉碎的炒小麦混合并接种曲精，接种后的混合物制曲，得到成熟大曲与盐水混合得酱醪，其中盐水由水、NaCl、KCl和羧甲基壳聚糖组成；所得酱醪继续发酵后淋油或搅拌，在淋油或搅拌的酱醪中添加壳聚糖和乳酸并充分混合，继续按照常规方法进行发酵，发酵结束后按照常规方法淋油或者压榨、调配、杀菌等即得低盐酱油。本发明抑制了大部分有害微生物的繁殖，对有益微生物繁殖不造成显著影响，提高了酱油中常规理化指标、风味和抗氧化活性；兼具绿色、安全、易操作、成本低廉的优点，具有重要的应用价值和经济意义。
Description
技术领域
本发明属于调味品加工技术领域，具体涉及一种低盐酱油的生产方法。
背景技术
酱油是我国家庭烹饪、餐饮和食品工业中必不可少的调味品，在食品工业的渗透率超过99％。酱油是以大豆、豆粕、面粉、麸皮、焙炒小麦和氯化钠为主要原料，以米曲霉为主要菌种发酵而成的调味品，其中氯化钠在发酵过程中扮演着防腐剂的作用，在终产品中是咸味的主要来源。常规酱油中氯化钠含量为15-18％(w/v)，属于高盐食品。每15ml常规酱油(我过居民每天平均摄入量)中钠的营养参考值(NRV％)约为58％，是我国居民钠的重要来源之一。
目前我国成年居民每天食盐摄入量在12-14克，远高于世界卫生组推荐的5-6克。摄入过量的钠是造成心血管疾病、高血压和糖尿病的重要原因之一，食盐和高血压之间存在着必然的关联。高血压和糖尿病患者需要终生服药，抗高血压药物本身也存在一定副作用。2017年全球范围内大约7000万伤残人士和300万患者死于高钠摄入，减少钠摄入量是降低高血压患者发病率最有效和直接的手段(洪洋，等.高食盐摄入对人体健康的影响[J].食品质量安全监测学报，2021，12(7)：2618-2623.)。酱油是我国居民摄入钠的重要途径之一，我国华南和华东地区有蘸食酱油的习惯，更容易通过酱油摄入过多的钠。因此开发低盐酱油具有重要的意义。
目前低盐酱油主要通过控制发酵环境(清洁)、温度(低温)和用部分乙醇或氯化钾代替氯化钠避免酱油在发酵和储存过程中被有害微生物污染。大曲中除了存在米曲霉之外还有大量的酵母菌、乳酸菌和少量可以适应低温和氯化钠溶液的有害物生物，米曲霉被氯化钠溶液(>10％)抑制后，少量有害微生物可能快速繁殖导致发酵失败。此外，维持酱油长达1-6个月时间的低温发酵成本高，一般企业和消费者无法接受过高的生产成本和价格。直接在酱油中添加乙醇可能会改变中国传统酱油的风味，而仅仅用氯化钾代替氯化钠也难以达到在发酵过程中抑制杂菌的目的。因此，在减盐的同时保证酱油在发酵过程中不被有害杂菌污染具有重要意义。
壳聚糖及其衍生物是具有广谱抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生理活性的天然多糖，其安全性已经得到了广泛认可，在食品工业中具有重要的应用前景，但壳聚糖和其衍生物仅能在特定的pH范围和溶液中溶解和发挥其生理功能。因此，选择合理的应用环境和配伍试剂是发挥壳聚糖抑菌功能的关键。
发明内容
本发明的目的是为了开发一种低盐酱油的生产方法，具体步骤如下：
一种低盐酱油的生产方法，按照下述步骤进行：
(1)大豆或豆粕充分浸泡后进行蒸煮，蒸好的大豆或豆粕与面粉或麸皮或粉碎的炒小麦充分混合，在两者混合之前面粉或麸皮或粉碎的炒小麦先接种曲精，接种后的混合物进行制曲，至混合物表面覆盖一层黄色至浅绿色孢子时即得成熟大曲；将NaCl、KCl、羧甲基壳聚糖加入水中混合均匀得到盐水，成熟大曲与盐水充分混合得酱醪；其中成熟大曲与盐水的质量体积比为1g:0.8-3.5ml(w/v)；所述水、NaCl、KCl和羧甲基壳聚糖的质量比为100:5-12:1-5:0.01-1.5(w/w/w/w)；
(2)将步骤(1)制备的酱醪进行发酵，发酵至3-30天时淋油或搅拌，在淋油或搅拌后的酱醪中添加壳聚糖和乳酸并充分混合，壳聚糖和乳酸的添加量分别与步骤(1)酱醪中使用盐水的用量比为0.01-1g：100ml和0.01-0.6g：100ml，壳聚糖分子量和脱乙酰度分别为5-50kDa和70-100％，继续进行发酵，发酵结束后进行淋油或者压榨、调配、杀菌、包装和储存。
优选的，步骤(1)中所述豆或豆粕充分浸泡后进行蒸煮，充分浸泡的时间2-24h，蒸煮的温度为100-140℃，时间为3min-3h。
优选的，步骤(1)中所述曲精的接种量为面粉或麸皮或粉碎的炒小麦质量的0.01-0.5％；所述曲精为米曲霉曲精。
优选的，步骤(1)中所述接种后的混合物进行制曲的温度为25-32℃，相对湿度85-95％。
优选的，步骤(1)中所述成熟大曲与盐水的质量体积比为1:1-2.5(w/v，g/ml)；所述水、NaCl、KCl和羧甲基壳聚糖的质量比为100:8-10:2-3:0.1-0.5(w/w/w/w)。
优选的，步骤(2)中发酵至4-15天时淋油或搅拌，在淋油或搅拌后的酱醪中加入壳聚糖和乳酸，所述壳聚糖和乳酸的添加量分别与使用盐水用量的比为0.05-0.2g：100ml和0.1-0.3g：100ml；所述壳聚糖分子量和脱乙酰度分别为10-30kDa和85-95％。
优选的，步骤(2)中所述制备的酱醪进行发酵的温度为20-30℃；
优选的，步骤(2)中所述继续进行发酵是在常温条件下继续发酵30-80d。
优选的，步骤(2)中所述杀菌的温度为60-140℃，时间为30s-30min。
有益效果：
(1)本发明通过大量实验，在酱油发酵不同阶段(pH和环境不同)分别应用壳聚糖和其衍生物抑制酱醪中的杂菌，通过添加壳聚糖(药食两用的原料，充当天然防腐剂)达到防腐、减盐和提高酱油抗氧化活性的效果，壳聚糖分子量和脱乙酰度分别为5-50kDa和70-99％，保证酱油的微生物安全性，制得低盐酱油。
(2)采用本发明方法生产的低盐酱油在发酵过程中微生物总数显著低于对照酱油(p<0.05)，并且可以显著抑制酱醪中微生物的大量繁殖，效果显著优于仅仅添加食盐或添加本发明所用量的羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸中的一种或者两种，进一步证明本发明所用的羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸在抑制酱醪中的微生物繁殖中存在协同作用，同时本发明方法不会显著抑制酱醪中产香微生物的繁殖。
(3)按照本发明方法生产的低盐酱油其NaCl含量比对照1的酱油降低49.2％，样品酱油总氮、氨基酸态氮、还原糖和非盐固形物含量分别比对照1提高14.8％、22.4％、9.2％和8.4％，样品比对照1的DPPH自由基清除活性和还原力分别提高31.5％和15.3％，不但显著降低了酱油NaCl含量，而且显著提高了酱油滋味物质及其抗氧化活性。
(4)本发明方法巧妙利用羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸显著抑制了大部分有害微生物的繁殖，对有益微生物繁殖不造成显著影响，提高了酱油中常规理化指标、风味和抗氧化活性，在显著减盐的同时，保证了酱油发酵顺利进行。按照本发明方法生产的酱油钠含量显著减少，除咸味外，其他风味几乎无变化，且酱油抗氧化能力显著提高；所采用方法绿色、安全、易操作、成本低廉，具有重要的应用价值和经济意义。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的具体实施方式作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
本发明所涉及的酱油感官评价方法及常规理化指标和抗氧化指标参照如下文献测定(Gao et al.Effects of sonication during moromi fermentation onantioxidant activities of compounds in raw soy sauce.LWT-Food Science andTechnology,2019,116,108605.；Gao et al.Accelerating aroma formation of raw soysauce using low intensity sonication.Food Chemistry,2020,329,127118.；Gao etal.Enhancing the taste of raw soy sauce using low intensity ultrasoundtreatment during moromi fermentation.Food Chemistry,2019,298,124928.)。
实施例1：
大豆充分浸泡24h后进行在140℃条件下蒸煮3min，蒸好的大豆与面粉充分混合，在两者混合之前面粉先接种米曲霉(Aspergillus oryzae)曲精，用量为面粉质量的0.5％，接种后的混合物制曲(制曲条件：25℃/相对湿度85％)，至混合物表面覆盖一层黄色至浅绿色孢子时即得成熟大曲，成熟大曲与盐水充分混合得酱醪；其中成熟大曲与盐水比例为1:3.5(w/v，g/ml)，盐水组成为水：NaCl：KCl：羧甲基壳聚糖＝100:5:5:1.5(w/w/w/w)；
上述酱醪按照常规工艺进行发酵，常温发酵至30d时淋油，在淋油所得的发酵液中添加壳聚糖和乳酸并充分混合，壳聚糖和乳酸添加量分别与盐水量的比例为1g：100ml和0.6g：100ml，壳聚糖分子量和脱乙酰度分别为50kDa和100％，淋油回加至发酵罐继续按照常规方法进行发酵，常温发酵180d后按照常规方法淋油、调配、杀菌(140℃/30s)、包装和储存，得到低盐酱油(对应表1-3中样品)。
对照酱油1与实施例1的区别是不添加氯化钾、乳酸和壳聚糖及其衍生物，采用的其他原料和工艺与实施例1相同。
对照酱油2与实施例1的区别是不添加羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例1相同。
对照酱油3与实施例1的区别是添加羧甲基壳聚糖，不添加壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例1相同。
对照酱油4与实施例1的区别是添加壳聚糖和乳酸，不添加羧甲基壳聚糖，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例1相同。
对照酱油5与实施例1的区别是添加壳聚糖(5-50kDa和70-100％)，不添加羧甲基壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例1相同。
对照酱油6与实施例1的区别是添加乳酸，不添加壳聚糖和羧甲基壳聚糖，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例1相同。
对照酱油7与实施例1的区别是添加的壳聚糖分子量<5kDa、脱乙酰度<70％，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例1相同。
对照酱油8与实施例1的区别是添加的壳聚糖分子量>50kDa、脱乙酰度<70％，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例1相同。
由表1A可知，除了在发酵第1d天，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中微生物总数显著低于对照酱油1-8(p<0.05)，说明采用本发明方法可以显著抑制酱醪中微生物的大量繁殖，效果显著优于仅仅添加食盐或添加本发明所用量的羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸中的一种或者两种，证明本发明所用的羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸在抑制酱醪中的微生物繁殖中存在协同作用。
表1A本发明方法对酱油发酵过程中微生物总数的影响
注：微生物总数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标含有相同字母表示两个数值之间存在显著性差异(p<0.05)。
由表1B可知，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中乳酸菌数低于对照酱油1-8，但并不显著(p>0.05)。酱醪中的乳酸菌(如嗜盐四联球菌、片球菌等)是酱醪中重要的产香微生物，说明本发明方法不会显著抑制酱醪中产香微生物的繁殖。
表1B本发明方法对酱油发酵过程中乳酸菌数的影响
注：乳酸菌数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标无字母表示两个数值之间不存在显著性差异(p>0.05)。
由表1C可知，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中酵母菌数低于对照酱油1-8，但并不显著(p>0.05)。酱醪中的酵母菌(如鲁氏酵母、球拟酵母等)是酱醪中重要的产香微生物，说明本发明方法不会显著抑制酱醪中产香微生物的繁殖。
表1C本发明方法对酱油发酵过程中酵母菌数的影响
注：酵母菌数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标无字母表示两个数值之间不存在显著性差异(p>0.05)。
由表2可知，按照本发明方法生产的酱油其NaCl含量比对照酱油1至少低49.2％，NaCl含量显著减少(p<0.05)，与其他对照酱油NaCl含量无差异。样品酱油总氮、氨基酸态氮、还原糖和非盐固形物含量分别比对照1提高14.8％、22.4％、9.2％和8.4％，样品比对照1DPPH自由基清除活性和还原力分别提高31.5％和15.3％，上述指标的差异性均达到显著水平(p<0.05)。样品酱油总氮、氨基酸态氮、还原糖、非盐固形物含量、DPPH自由基清除活性和还原力比其他对照酱油也有不同程度的提高。上述结果证明采用本发明方法不但显著降低了酱油NaCl含量，而且显著提高了酱油滋味物质及其抗氧化活性。
表2采用本发明方法生产的低盐酱油基本成分及抗氧化活性
注：(1)结果为平均值±标准差(n＝3)；同列不同小写字母表示同一列数据的显著性差异(p<0.05)；(2)此处NaCl采用硝酸银滴定法测定(以Cl-计)，样品中部分Cl-来源于氯化钾，因此样品中NaCl实际含量低于此处测定值；(3)测试的样品和对照酱油为相应的终产品酱油。
由表3可知，样品的咸味显著低于对照1(p<0.05)，略低于其他对照酱油2-8(p>0.05)。样品酱油的鲜味强于对照酱油，但未达到显著水平。样品酱油的甜味均强于对照酱油，其中比对照酱油2-6的甜味显著提高(p<0.05)。上述感官评价结果与表2分析结果基本一致。样品酱油和对照酱油1的异臭味值最低，显著低于对照低于其他对照酱油2-8，与传统高盐稀态酱油异臭味评分基本相当，说明本发明方法可以保障高盐稀态酱油顺利进行发酵。对照酱油2-8异臭味评分高说明对照酱油2-8在发酵过程中被杂菌污染，产生了异臭味，这与酱醪中微生物总数分析结果一致(表1A)。
表3样品酱油和对照酱油感官评价结果
注：(1)评价组由10名嗅觉正常的人员组成(年龄23-43,5名男性，5名女性)，感觉不到表3中的各种滋味为0分，最强为9分。香气评价：无法接受0分，最喜欢9分；(2)感官评价样品和对照酱油为发酵至180d时尚未调配、杀菌和包装的酱油。
酱醪中部分微生物(如部分乳酸菌、酵母菌)为产香微生物，对酱油香气成熟有利，但大部分为有害微生物，不但消耗酱醪中的游离氨基酸和单糖，还会产生异味，导致酱油风味恶化。因此，促进酱醪中有益微生物(如部分乳酸菌、酵母菌)繁殖，抑制有害微生物繁殖对保障酱油发酵顺利进行具有重要意义。上述结果说明本发明方法巧妙利用羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸显著抑制了大部分有害微生物的繁殖，对有益微生物繁殖不造成显著影响，提高了酱油中常规理化指标、风味和抗氧化活性，在显著减盐的同时，保证了酱油发酵顺利进行。
实施例2：
豆粕充分浸泡2h后在100℃进行蒸煮3h，蒸好的豆粕与粉碎的炒小麦充分混合，在两者混合之前粉碎的炒小麦先接种米曲霉(Aspergillus oryzae)曲精，用量为炒小麦质量的0.01％，接种后的混合物制曲(制曲条件：32℃/相对湿度95％)，至混合物表面覆盖一层黄色至浅绿色孢子时即得成熟大曲，成熟大曲与盐水充分混合得酱醪，成熟大曲与盐水比例为1:0.8(w/v，g/ml)，盐水组成为水：NaCl：KCl：羧甲基壳聚糖＝100:8:1:0.01(w/w/w/w)；
上述酱醪按照常规工艺进行发酵，室温发酵至3天时搅拌，同时添加壳聚糖和乳酸并充分混合，壳聚糖和乳酸添加量分别为上述盐水总量的0.01g：100ml)和0.01g：100ml，壳聚糖分子量和脱乙酰度分别为5kDa和70％，继续按照常规方法进行发酵，室温发酵30d结束发酵，得到发酵物；鉴于前期成熟大曲与盐水混合时，盐水用量过少，发酵后所得酱油较少；所以此时可继续添加盐水；在发酵物中添加大曲重量2倍的盐水，盐水组成为水：NaCl：KCl：羧甲基壳聚糖＝100:8:1:0.01(w/w/w/w)；混合均匀后按照常规方法压榨、调配、杀菌(60℃/30min)、包装和储存，得到低盐酱油(对应表4-6中样品)。
对照酱油1与实施例2的区别是不添加氯化钾、乳酸和壳聚糖及其衍生物，采用的其他原料和工艺与实施例2相同。
对照酱油2与实施例2的区别是不添加羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例2相同。
对照酱油3与实施例2的区别是添加羧甲基壳聚糖，不添加壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例2相同。
对照酱油4与实施例2的区别是添加壳聚糖和乳酸，不添加羧甲基壳聚糖，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例2相同。
对照酱油5与实施例2的区别是添加壳聚糖(5-50kDa和70-100％)，不添加羧甲基壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例2相同。
对照酱油6与实施例2的区别是添加乳酸，不添加壳聚糖和羧甲基壳聚糖，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例2相同。
对照酱油7与实施例2的区别是添加的壳聚糖分子量<5kDa、脱乙酰度<70％，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例2相同。
对照酱油8与实施例2的区别是添加的壳聚糖分子量>50kDa、脱乙酰度<70％，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例2相同。
由表4A可知，除了在发酵第1d天，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中微生物总数显著低于对照酱油1-8(p<0.05)，说明采用本发明方法可以显著抑制酱醪中微生物的大量繁殖，效果显著优于仅仅添加食盐或添加本发明所用量的羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸中的一种或者两种，证明本发明所用的羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸在抑制酱醪中的微生物繁殖中存在协同作用。
表4A本发明方法对酱油发酵过程中微生物总数的影响
注：微生物总数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标含有相同字母表示两个数值之间存在显著性差异(p<0.05)。
由表4B可知，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中乳酸菌数低于对照酱油1-8，但并不显著(p>0.05)。酱醪中的乳酸菌(如嗜盐四联球菌、片球菌等)是酱醪中重要的产香微生物，说明本发明方法不会显著抑制酱醪中产香微生物的繁殖。
表4B本发明方法对酱油发酵过程中乳酸菌数的影响
注：乳酸菌数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标无字母表示两个数值之间不存在显著性差异(p>0.05)。
由表4C可知，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中酵母菌数低于对照酱油1-8，但并不显著(p>0.05)。酱醪中的酵母菌(如鲁氏酵母、球拟酵母等)是酱醪中重要的产香微生物，说明本发明方法不会显著抑制酱醪中产香微生物的繁殖。
表4C本发明方法对酱油发酵过程中酵母菌数的影响
注：酵母菌数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标无字母表示两个数值之间不存在显著性差异(p>0.05)。
由表5可知，按照本发明方法生产的酱油其NaCl含量比对照酱油1至少低34.2％，NaCl含量显著减少(p<0.05)，与其他对照酱油NaCl含量无差异。样品酱油总氮、氨基酸态氮、还原糖和非盐固形物含量分别比对照1提高7.4％、9.9％、7.7％和7.3％，样品比对照1DPPH自由基清除活性和还原力分别提高19.4％和18.9％，上述指标的差异性均达到显著水平(p<0.05)。样品酱油总氮、氨基酸态氮、还原糖、非盐固形物含量、DPPH自由基清除活性和还原力比其他对照酱油也有不同程度的提高。上述结果证明采用本发明方法不但显著降低了酱油NaCl含量，而且显著提高了酱油滋味物质及其抗氧化活性。
表5采用本发明方法生产的低盐酱油基本成分及抗氧化活性
注：(1)结果为平均值±标准差(n＝3)；同列不同小写字母表示同一列数据的显著性差异(p<0.05)；(2)此处NaCl采用硝酸银滴定法测定(以Cl-计)，样品中部分Cl-来源于氯化钾，因此样品中NaCl实际含量低于此处测定值；(3)测试的样品和对照酱油为相应的终产品酱油。
由表6可知，样品的咸味显著低于对照1(p<0.05)，略低于其他对照酱油2-8(p>0.05)。样品酱油的鲜味强于对照酱油，但未达到显著水平。样品酱油的甜味均强于对照酱油，其中比对照酱油2-6的甜味显著提高(p<0.05)。上述感官评价结果与表2分析结果基本一致。样品酱油和对照酱油1的异臭味值最低，显著低于对照低于其他对照酱油2-8，与传统低盐固态酱油异臭味评分基本相当，说明本发明方法可以保障高盐稀态酱油顺利进行发酵。对照酱油2-8异臭味评分高说明对照酱油2-8在发酵过程中被杂菌污染，产生了异臭味，这与酱醪中微生物总数分析结果一致(表4A)。
表6样品酱油和对照酱油感官评价结果
注：(1)评价组由10名嗅觉正常的人员组成(年龄23-43,5名男性，5名女性)，感觉不到表6中的各种滋味为0分，最强为9分。香气评价：无法接受0分，最喜欢9分；(2)感官评价样品和对照酱油为发酵至30d时尚未调配、杀菌和包装的酱油。
酱醪中部分微生物(如部分乳酸菌、酵母菌)为产香微生物，对酱油香气成熟有利，但大部分为有害微生物，不但消耗酱醪中的游离氨基酸和单糖，还会产生异味，导致酱油风味恶化。因此，促进酱醪中有益微生物(如部分乳酸菌、酵母菌)繁殖，抑制有害微生物繁殖对保障酱油发酵顺利进行具有重要意义。上述结果说明本发明方法巧妙利用羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸显著抑制了大部分有害微生物的繁殖，对有益微生物繁殖不造成显著影响，提高了酱油中常规理化指标、风味和抗氧化活性，在显著减盐的同时，保证了酱油发酵顺利进行。
实施例3：
大豆充分浸泡12h后在120℃进行蒸煮30min，蒸好的大豆与麸皮充分混合，在两者混合之前麸皮先接种米曲霉曲精，用量为麸皮专利的0.1％，接种后的混合物制曲(制曲条件：29℃/相对湿度90％)，至混合物表面覆盖一层黄色至浅绿色孢子时即得成熟大曲，成熟大曲与盐水充分混合得酱醪，成熟大曲与盐水比例为1:2.2(w/v，g/ml))，盐水组成为水：NaCl：KCl：羧甲基壳聚糖＝100:12:2:0.7(w/w/w/w)；
上述酱醪按照常规工艺进行发酵，常温发酵至15天时淋油，在淋油所得的发酵液中添加壳聚糖和乳酸并充分混合，壳聚糖和乳酸添加量分别为所用盐水量的0.5g：100ml和0.3g：100ml，壳聚糖分子量和脱乙酰度分别为25kDa和85％，淋油回加至发酵罐继续按照常规方法进行发酵，常温发酵120d结束后按照常规方法淋油、调配、杀菌(85℃/15min)、包装和储存，得到低盐酱油(对应表7-9中样品)。
对照酱油1与实施例3的区别是不添加氯化钾、乳酸和壳聚糖及其衍生物，采用的其他原料和工艺与实施例3相同。
对照酱油2与实施例3的区别是不添加羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例3相同。
对照酱油3与实施例3的区别是添加羧甲基壳聚糖，不添加壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例3相同。
对照酱油4与实施例3的区别是添加壳聚糖和乳酸，不添加羧甲基壳聚糖，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例3相同。
对照酱油5与实施例3的区别是添加壳聚糖(5-50kDa和70-100％)，不添加羧甲基壳聚糖和乳酸，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例3相同。
对照酱油6与实施例3的区别是添加乳酸，不添加壳聚糖和羧甲基壳聚糖，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例3相同。
对照酱油7与实施例3的区别是添加的壳聚糖分子量<5kDa、脱乙酰度<70％，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例3相同。
对照酱油8与实施例3的区别是添加的壳聚糖分子量>50kDa、脱乙酰度<70％，采用的其他原料、原料比例和生产工艺与实施例3相同。
由表7A可知，除了在发酵第1d天，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中微生物总数显著低于对照酱油1-8(p<0.05)，说明采用本发明方法可以显著抑制酱醪中微生物的大量繁殖，效果显著优于仅仅添加食盐或添加本发明所用量的羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸中的一种或者两种，证明本发明所用的羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸在抑制酱醪中的微生物繁殖中存在协同作用。
表7A本发明方法对酱油发酵过程中微生物总数的影响
注：微生物总数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标含有相同字母表示两个数值之间存在显著性差异(p<0.05)。
由表7B可知，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中乳酸菌数低于对照酱油1-8，但并不显著(p>0.05)。酱醪中的乳酸菌(如嗜盐四联球菌、片球菌等)是酱醪中重要的产香微生物，说明本发明方法不会显著抑制酱醪中产香微生物的繁殖。
表7B本发明方法对酱油发酵过程中乳酸菌数的影响
注：乳酸菌数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标无字母表示两个数值之间不存在显著性差异(p>0.05)。
由表7C可知，与对照酱油1-8相比，采用本发明方法生产的酱油在发酵过程中酵母菌数低于对照酱油1-8，但并不显著(p>0.05)。酱醪中的酵母菌(如鲁氏酵母、球拟酵母等)是酱醪中重要的产香微生物，说明本发明方法不会显著抑制酱醪中产香微生物的繁殖。
表7C本发明方法对酱油发酵过程中酵母菌数的影响
/>
注：酵母菌数为log CFU/ml，数值为3次测量的平均值±标准偏差，同一列数值右上标无字母表示两个数值之间不存在显著性差异(p>0.05)。
由表8可知，按照本发明方法生产的酱油其NaCl含量比对照酱油1至少低35.9％，NaCl含量显著减少(p<0.05)，与其他对照酱油NaCl含量无差异。样品酱油总氮、氨基酸态氮、还原糖和非盐固形物含量分别比对照1提高8.5％、10.5％、13.7％和9.5％，样品比对照1DPPH自由基清除活性和还原力分别提高30.4％和12.5％，上述指标的差异性均达到显著水平(p<0.05)。样品酱油总氮、氨基酸态氮、还原糖、非盐固形物含量、DPPH自由基清除活性和还原力比其他对照酱油也有不同程度的提高。上述结果证明采用本发明方法不但显著降低了酱油NaCl含量，而且显著提高了酱油滋味物质及其抗氧化活性。
表8采用本发明方法生产的低盐酱油基本成分及抗氧化活性
注：(1)结果为平均值±标准差(n＝3)；同列不同小写字母表示同一列数据的显著性差异(p<0.05)；(2)此处NaCl采用硝酸银滴定法测定(以Cl-计)，样品中部分Cl-来源于氯化钾，因此样品中NaCl实际含量低于此处测定值；(3)测试的样品和对照酱油为相应的终产品酱油。
由表9可知，样品的咸味显著低于对照1(p<0.05)，与其他对照酱油2-8咸味之间不存在显著差异(p>0.05)。样品酱油的鲜味强于对照酱油，但未达到显著水平(p<0.05)。样品酱油的甜味均强于对照酱油，其中比对照酱油2，3和对照酱油5，6，8的甜味显著提高(p<0.05)。上述感官评价结果与表8分析结果基本一致。样品酱油和对照酱油1的异臭味值最低，显著低于对照低于其他对照酱油2-8，与传统高盐稀态酱油异臭味评分基本相当，说明本发明方法可以保障高盐稀态酱油顺利进行发酵。对照酱油2-8异臭味评分高说明对照酱油2-8在发酵过程中被杂菌污染，产生了异臭味，这与酱醪中微生物总数分析结果一致(表1A)。
表9样品酱油和对照酱油感官评价结果
注：(1)评价组由10名嗅觉正常的人员组成(年龄23-43,5名男性，5名女性)，感觉不到表9中的各种滋味为0分，最强为9分。香气评价：无法接受0分，最喜欢9分；(2)感官评价样品和对照酱油为发酵至180d时尚未调配、杀菌和包装的酱油。
酱醪中部分微生物(如部分乳酸菌、酵母菌)为产香微生物，对酱油香气成熟有利，但大部分为有害微生物，不但消耗酱醪中的游离氨基酸和单糖，还会产生异味，导致酱油风味恶化。因此，促进酱醪中有益微生物(如部分乳酸菌、酵母菌)繁殖，抑制有害微生物繁殖对保障酱油发酵顺利进行具有重要意义。上述结果说明本发明方法巧妙利用羧甲基壳聚糖、壳聚糖和乳酸显著抑制了大部分有害微生物的繁殖，对有益微生物繁殖不造成显著影响，提高了酱油中常规理化指标、风味和抗氧化活性，在显著减盐的同时，保证了酱油发酵顺利进行。
本发明开发了一种低盐酱油的生产方法，按照本发明方法生产的酱油NaCl含量显著减少(p<0.05)，除咸味外，其他风味几乎无变化，且酱油抗氧化能力显著提高(p<0.05)。所采用方法绿色、安全、易操作、成本低廉。因此本发明具有重要的应用价值和经济意义。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做出各种改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定范围为准。
Claims (10)
1.一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
(1)大豆或豆粕充分浸泡后进行蒸煮，蒸好的大豆或豆粕与面粉或麸皮或粉碎的炒小麦充分混合，在两者混合之前面粉或麸皮或粉碎的炒小麦先接种曲精，接种后的混合物进行制曲，至混合物表面覆盖一层黄色至浅绿色孢子时即得成熟大曲；将NaCl、KCl、羧甲基壳聚糖加入水中混合均匀得到盐水，成熟大曲与盐水充分混合得酱醪；其中成熟大曲与盐水的质量体积比为1g:0.8-3.5ml；所述水、NaCl、KCl和羧甲基壳聚糖的质量比为100:5-12:1-5:0.01-1.5；
(2)将步骤(1)制备的酱醪进行发酵，发酵至3-30天时淋油或搅拌，在淋油或搅拌后的酱醪中添加壳聚糖和乳酸并充分混合，壳聚糖和乳酸的添加量分别与步骤(1)酱醪中使用盐水的用量比为0.01-1g：100ml和0.01-0.6g：100ml，壳聚糖分子量和脱乙酰度分别为5-50kDa和70-100％，继续进行发酵，发酵结束后进行淋油或者压榨、调配、杀菌、包装和储存。
2.根据权利要求1所述的一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，步骤(1)中所述豆或豆粕充分浸泡后进行蒸煮，充分浸泡的时间2-24h，蒸煮的温度为100-140℃，时间为3min-3h。
3.根据权利要求1所述的一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，步骤(1)中所述曲精的接种量为面粉或麸皮或粉碎的炒小麦质量的0.01-0.5％；所述曲精为米曲霉曲精。
4.根据权利要求1所述的一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，步骤(1)中所述接种后的混合物进行制曲的温度为25-32℃，相对湿度85-95％。
5.根据权利要求1所述的一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，步骤(1)中所述成熟大曲与盐水的质量体积比为1g:1-2.5ml；所述水、NaCl、KCl和羧甲基壳聚糖的质量比为100:8-10:2-3:0.1-0.5。
6.根据权利要求1所述的一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述制备的酱醪进行发酵的温度为20-30℃。
7.根据权利要求1所述的一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述继续进行发酵是在常温条件下继续发酵30-80d。
8.根据权利要求1所述的一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述杀菌的温度为60-140℃，时间为30s-30min。
9.根据权利要求1所述的一种低盐酱油的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵至4-15天时淋油或搅拌，在淋油或搅拌后的酱醪中加入壳聚糖和乳酸，所述壳聚糖和乳酸的添加量分别与使用盐水用量的比为0.05-0.2g：100ml和0.1-0.3g：100ml；所述壳聚糖分子量和脱乙酰度分别为10-30kDa和85-95％。
10.根据权利要求1-9任一项所述方法制备的低盐酱油。
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