CN114107561A - 一种检测苜蓿花叶病毒的gica-rt-lamp试剂盒及检测卡 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测苜蓿花叶病毒的GICA‑RT‑LAMP试剂盒及检测卡，涉及苜蓿花叶病毒检测技术领域。本发明将胶体金免疫层析和核酸检测方法有机地结合起来，具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快、成本低的技术优势。可以在恒温水浴中完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接判断，既适用于AMV病毒病的田间或现场快速筛查，也适用于实时精确监控，将为AMV病毒的种子质量监测、田间防治、海关检验、检疫提供可靠的技术支撑。

Description

一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒及检测卡
技术领域
本发明涉及苜蓿花叶病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒及检测卡。
背景技术
当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)，是一种大宗名贵中药材，为伞形科多年生草本植物，又名岷当归、干归、马尾当归、西当归等。在我国，当归主要种植于甘肃、云南、贵州、四川、湖北、青海等省，特别是甘肃省岷县当归种植历史悠久，品质极佳，产量第一，素有“中国当归之乡”和“千里药乡”之称。
而随着人工种植规模和地域的不断扩大及连年种植，当归种源退化，种子质量下降，原产地病害频发，尤其连作障碍引发的细菌、真菌和病毒病害连年发生，日趋严重，药材产量大幅减少，品质下降。
目前，关于当归病害的研究，主要集中在真菌病害上，病毒病鲜见报道。实际上病毒病也是一种极为严重的植物病害，防治困难，素有“植物癌症”之称。植物感染病毒后，种性退化，抗性减弱，更易受到真菌、细菌等其他病原物的侵害，田间往往多种病害复合发生，造成更为严重的损失。发明人2019年对甘肃省当归主产区(岷县、宕昌、漳县、渭源和榆中)病毒病害做了初步的调查和检测，在68份田间呈现病毒样症状的样品中，53份检测出了病毒感染，病毒感染率高达79％。除此之外，在部分样品中利用小RNA测序技术(small RNAsequencing， sRNA-seq)还鉴定到了苜蓿花叶病毒(Alfafa mosaic virus,AMV)，这是当归作物中首次发现有AMV感染。当归感染AMV等病毒后，植株矮化，叶片出现花叶，斑驳，黄化和坏死斑等症状，产量减少，品质降低，严重影响了药材质量。
目前，针对AMV病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等，但这些方法都还停留在研究和实验室阶段，表现在程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成，因此使用范围受到很大的局限，无法满足当归种植现场及田间快速检测的需求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒及检测卡以解决上述技术问题。
现有的ELISA及其衍生技术受灵敏性的限制易出现假阴性结果，而逆转录聚合酶链式反应及其衍生技术检测有存在RNA提取难度大，准确性无法得到保障，急需开发出适用于种子病毒病害快速、灵敏检测的新技术和新方法。
发明人将胶体金免疫层析检测GICA与LAMP技术有机结合，先通过胶体金免疫层析GICA技术富集待测样本中的病毒粒子，快速筛查并判断样本中的病毒感染情况；接着利用富集到的病毒粒子作为模板，进行反转录RT和DNA环介导等温LAMP扩增，扩增产物用肉眼观察，精确判断样本中的病毒感染情况，以此成功建立了GICA-RT-LAMP技术特异性检测苜蓿花叶病毒AMV的方法。
本发明是这样实现的：
AMV是雀麦花叶病毒科(Bromovirus)苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)的重要成员。AMV的寄主十分广泛，可以侵染51科双子叶植物的430多种，如苜蓿、番茄、大豆、烟草和马铃薯等，AMV主要通过汁液摩擦和多种蚜虫以非持久方式进行传播。
AMV属于外壳蛋白依赖的三分体正义单链RNA病毒，病毒基因由3条单链RNA组成，其中RNA1和RNA2分别编码P1蛋白和P2蛋白，共同构成了 AMV的复制酶。RNA3编码P3蛋白和外壳蛋白。AMV纯化的病毒粒子呈近球状至柱状，粒子长度为15.2-58.2nm，宽12.0-24.1nm。
本发明提供了一种检测苜蓿花叶病毒的RT-LAMP检测引物组合物，其包括如SEQID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP和SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述引物组合物还包括SEQ ID NO.5所示的反向环引物LB。
各引物序列具体如下：
F3：5’-GGTTTGAGCTGGTCTTCACA-3’；
B3：5’-ATTAAACTGCGGAGGGGC-3’；
FIP：
5’-TCCAAACAAAGGGCTACGGCATCTCCTACCCATGCGGGAA-3'；
BIP：
5’-CTTCGACGCTCAGCCTGAGGCGGAAACGCCTTTCTCTCG-3’；
LB：5’-AAAAATCCCTCATACCGATTCAACG-3’。
发明人经过长期大量的引物筛选，获得上述引物组合。该引物组合能够实现目标样本中苜蓿花叶病毒的高特异性和高灵敏度的检出。
本发明还提供了一种苜蓿花叶病毒的检测卡，其包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，胶体金结合垫上含有胶体金-苜蓿花叶病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，检测T线包被有AMV的抗体IgG，质控C线包被有抗PlAMV抗体的二抗；检测T线上AMV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg 蛋白；抗AMV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；
胶体金结合垫上的苜蓿花叶病毒抗体的包被量为每毫升胶体金中含13～ 14μg的苜蓿花叶病毒抗体。
采用上述包被量的检测卡能够实现苜蓿花叶病毒的快速检出(最快3min)，既适用于病毒病害的田间或现场快速筛查，也适用于病害的实时精确监控，将为 AMV病毒的田间防治、海关检验、检疫、种子质量监控提供可靠的技术支撑。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，衬板与下壳体的一个端面固定连接，上壳体与下壳体固定连接，且上壳体与下壳体留有放置衬板的安装腔。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，加样窗空间上位于样品垫的上方，反应观察窗空间上位于硝酸纤维素膜的上方。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述上壳体与下壳体通过卡扣结构卡接。在其他实施方式中，上壳体与下壳体的连接方式也可以根据需要进行自适应调整，例如通过粘接的方式。
本发明提供了一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其包括上述的苜蓿花叶病毒的检测卡和检测苜蓿花叶病毒的RT-LAMP检测引物组合物。
GICA-RT-LAMP结合了胶体金免疫层析和核酸LAMP方法的优点，免核酸 RNA提取，操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快(最快3分钟)、成本低、不需要酶标仪、基因扩增仪等特殊的仪器设备，在恒温水浴中完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接判断，既适用于病毒病害的田间或现场快速筛查，也适用于病害的实时精确监控，将为AMV病毒的田间防治、海关检验、检疫、种子质量监控提供可靠的技术支撑。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、 ThermoPol反应缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶和水。
RNase抑制剂可以为DEPC、异硫氰酸胍或氧钒核糖核苷复合物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。
可选的，荧光染料检测液为SYBR Green I。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述阴性对照品为水(RNA-free)，阳性对照品为苜蓿花叶病毒外壳蛋白CP基因片段标准品。
当归AMV CP基因片段标准品的序列如下：
ATGAGTTCTTCACAAAAGAAAACTGGTGGGAAAGCTGGTAAACCTAC TAAACGTTCTCAGAACTATGCTGCTTTACGCAAAGCTCAACTGCCGAAGCC TCCGGCGTTGAAAGTCCCGGTTGCAAAACCGACGAATACTATACTGCCAC AGACGGGCTGCGTGTGGCAAAGCCTCGGGACCCCTCTGAGTCTGAGCTCT TTCAATGGGCTCGGCGTGAGATTCCTCTACAGTTTTTTGAAGGATTTCACG GCCCCCCGGATCCTCGAGGAGGATCTGATTTTCAGGATGGTGTTTTCTGTG ACTCCATCCCATGCCGGCACCTTTTGTCTCACTGATGACGTGACGACAGAG GAGGGTAGGGCCGTTGCGCATGGTAATCCCATGCAAGAGTTTCCTCATGGC GTTTTCCATGCCAATGAGAAGTTCGGGTTTGAGCTGGTCTTCACAGCTCCT ACCCATGCGGGAATGCAAAATCAAAATTTTAAGCATTCCTATGCCGTAGCC CTTTGTTTGGACTTCGACGCTCAGCCTGAGGGATCTAAAAATCCCTCATAC CGATTCAACGAAGTTTGGGTCGAGAGAAAGGCGTTTCCGCGAGCAGGGC CCCTCCGCAGTTTAATAACTGTGGGGTTGCTCGACGAAGCTGACGATCTTG ATCGTCAT。
优选地，反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶，DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶。此外，在其他实施方式中，DNA聚合酶的类型可以根据需要进行选择。
本发明还提供了一种采用检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒检测苜蓿花叶病毒的检测方法，其包括如下步骤：
(1)取待测溶液置于苜蓿花叶病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒AMV；
(2)若根据步骤(1)无法鉴别待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒AMV，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤(1)免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用RT-LAMP检测引物组进行RT-LAMP 扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒。
在本发明应用较佳的实施方式中，根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有AMV的具体方法为肉眼观察法；肉眼观察法为：
若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有苜蓿花叶病毒AMV，无需进行反转录RT-LAMP扩增；
若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染苜蓿花叶病毒AMV，或感染苜蓿花叶病毒AMV的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增。
在本发明应用较佳的实施方式中，根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品是否含有苜蓿花叶病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法；荧光染料肉眼观察法为：
取荧光染料反应液在反应前加入RT-LAMP扩增反应管的管盖上，待LAMP 扩增反应结束后，使荧光染料检测液与LAMP反应液混合，采用肉眼直接观察混合反应液的颜色。
由于SYBR Green I会抑制LAMP反应，因此不适合反应前加SYBR Green I，而反应结束后加入方可显色。
荧光染料反应液为SYBR Green I，若扩增产物出现绿色荧光，表示待测样品中含有苜蓿花叶病毒；
若扩增产物颜色为橙色则表示待测样品中不含苜蓿花叶病毒。
本发明GICA-RT-LAMP试剂盒的检测对象是AMV病毒粒子，通过胶体金免疫层析GICA技术快速富集病毒粒子，可以初步判定待测样品的病毒感染情况；再利用病毒基因组序列的特异性引物进行RT-LAMP扩增，通过对扩增产物的分析达到精确检测病原物的目的。GICA-RT-LAMP检测方法将血清学方法和核酸检测方法有机地结合起来，具有特异性强，灵敏度高的优势。灵敏度达到了 1.1pg/mL，比普通GICA-RT-PCR灵敏10倍，检测过程中免核酸RNA提取，也无须专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。
本发明还提供了一种苜蓿花叶病毒的检测卡、检测苜蓿花叶病毒的 RT-LAMP检测引物组合物或检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒在检测苜蓿花叶病毒中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的苜蓿花叶病毒的检测卡具有检测速度快，适用性好的技术优势。而检测引物组合可实现目标样本中苜蓿花叶病毒的高特异性和高灵敏度的检出。二者偶联后的GICA-RT-LAMP试剂盒具有操作方便、准确性高、适用性好等优势。
具体地，GICA-RT-LAMP试剂盒克服了现有技术中苜蓿花叶病毒的检测方法繁琐，费时费力，必须依赖酶标仪或基因扩增仪等昂贵的分子生物学仪器设备，无法快速检测目标病毒等缺陷。本发明将血清学和LAMP扩增技术有机地结合，充分发挥两种检测方法的优势，直接以胶体金免疫层析GICA富集到的AMV病毒粒子作为检测对象进行RT-LAMP扩增，避免了RNA抽提环节，降低了检测门槛和难度，反应操作在同一反应体系中连续进行，中途不需添加任何试剂，降低了污染风险。
本发明首先利用苜蓿花叶病毒AMV胶体金免疫层析GICA检测卡免疫富集待测样品中的AMV粒子，用其作为模板进行RT-LAMP扩增，提高了检测的特异性，减少了假阳性的发生。RT-LAMP反应通过F3、B3、FIP、BIP和LB 共5条特异性引物识别AMV CP靶基因的7个序列，特异性强，准确性高。
本发明摆脱了现有检测技术对酶标仪或基因扩增仪的强烈依赖，免疫层析反应步骤无需任何仪器设备，用肉眼观察结果，而后进行的RT-LAMP反应在恒温水浴中就能完成，降低了检测难度，扩展了技术的应用范围，反应结束后通过颜色变化用肉眼判断结果，不依赖于仪器或设备，增加了应用价值，非常适合在基层推广应用，前景十分广阔。
本发明为当归及植物病害检测提供了新的技术平台，既能应用于苜蓿花叶病毒AMV的快速筛查，也能应用于AMV病毒的精准监测，一举两得，为监控 AMV病毒的发生、扩散、流行以及病毒病的防治提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测AMV病毒的胶体金免疫层析检测卡平面结构示意图；
图2为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测AMV病毒的胶体金免疫层析检测卡内部结构示意图；
图3为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测AMV病毒反应温度的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-9分别对应：56℃；58℃；60℃；62℃； 64℃；66℃；68℃，70℃；
图4为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测AMV病毒反应时间的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-10分别对应：20min；30min；40min； 50min；60min；70min；80min；90min；100min；
图5为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测AMV病毒特异性的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-12分别对应：健康当归组织；LSV百合感病组织；CMV-Li百合感病组织；LMoV百合感病组织；ArMV百合感病组织；JHMV 当归感病组织；PlAMV百合感病组织；LNYV生菜感病组织；LMV生菜感病组织；CMV生菜感病组织；AMV当归感病组织；
图6为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测AMV病毒灵敏性的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-11分别对应AMV CP基因标准品浓度：10-1 (1.1×104ng/mL)；10-2(1.1×103ng/mL)；10-3(1.1×102ng/mL)；10-4(1.1×101ng/mL)； 10-5(1.1×100ng/mL)；10-6(1.1×10-1ng/mL)；10-7(1.1×10-2ng/mL)；10-8(1.1×10-3ng/mL)； 10-9(1.1×10-4ng/mL)；10-10(1.1×10-5ng/mL)；
图7为本发明实施例GICA-RT-PCR检测AMV病毒灵敏性的电泳分析图；图中： M：2000bp Marker；1：阴性对照；2-11分别对应AMV CP基因标准品浓度：10-1(1.1×104 ng/mL)；10-2(1.1×103ng/mL)；10-3(1.1×102ng/mL)；10-4(1.1×101ng/mL)；10-5(1.1×10 0ng/mL)；10-6(1.1×10-1ng/mL)；10-7(1.1×10-2ng/mL)；10-8(1.1×10-3ng/mL)；10-9 (1.1×10- 4ng/mL)；10-10(1.1×10-5ng/mL)。
附图标记：1-卡槽；2-加样窗；3-反应观察窗；4-样品垫；5-胶体金结合垫；6-硝酸纤维素膜；7-吸收垫；8-衬板；9-检测T线；10-质控C线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
参照图1和图2所示，本实施例提供了一种苜蓿花叶病毒的检测卡，其包括卡槽1。卡槽1由下壳体和上壳体(图中未示出标号)组成，本实施例中设置下壳体和上壳体卡扣相连。上壳体与下壳体留有放置衬板8的安装腔。衬板8与下壳体的一个端面固定连接。
在衬板8上依次设置的样品垫4、胶体金结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，胶体金结合垫5上含有胶体金-苜蓿花叶病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜6上沿层析方向依次设置有检测T线9和质控C线10，检测T线9包被有 AMV的抗体IgG，质控C线10包被有抗AMV抗体的二抗；检测T线9上AMV 的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；抗AMV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白，本实施例中的抗AMV抗体的二抗为羊抗兔IgG；胶体金结合垫5上的苜蓿花叶病毒抗体的包被量为每5mL 胶体金中含65μg的苜蓿花叶病毒抗体。本实施例中，胶体金结合垫5上的苜蓿花叶病毒抗体为兔抗AMV多克隆抗体。
上壳体上间隔设置有加样窗2和反应观察窗3，加样窗2空间上位于样品垫 4的上方，反应观察窗3空间上位于硝酸纤维素膜6的上方。
上述检测卡的制备方法如下：
1.先制备苜蓿花叶病毒AMV多克隆抗体IgG：
①AMV病毒粒子的纯化：取100g冰冻的AMV感病当归叶片，加200mL 0.1M，pH7.5的含0.2％β-巯基乙醇和0.01M EDTA的Tris-硼酸缓冲液，在冰冻研钵中研磨至匀浆，4层纱布过滤，取滤液；向滤液中加入终浓度为6％的正丁醇，冰上不断搅拌45min；15000g离心10min，保留上清，弃沉淀；向上清液中加入终浓度为8％的PEG8000和终浓度为2％的NaCl，沉淀上清液，混合物在4℃静置30min；15000g离心10min，保留沉淀，重悬于0.1M，pH7.5的含0.2％β-巯基乙醇和0.01M EDTA的Tris-硼酸缓冲液，4℃过夜；7500g离心5min，离心3次，保留上清；将病毒溶液覆盖在4mL含有30％蔗糖的0.1M，pH 7.5的 Tris-硼酸缓冲液上，4℃86500g离心3h，沉淀用Tris-硼酸缓冲液重新溶解，4℃过夜，7500g离心10min，离心3次，取上清经SDS-PAGE电泳以及RT-PCR验证，确定为AMV病毒粒子后用于免疫实验。
②多克隆抗体的制备：用1mg/mL上述纯化的AMV病毒粒子蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔；初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；初次免疫21d后，将1.0mg/ml的纯化蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，经皮下多点注射作为第一次增强免疫；以后每间隔21d进行一次增强免疫，免疫方式为皮下多点注射。一共进行3次增强免疫，在第4次加强免疫后的5～7d颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02％的叠氮钠，-20℃保存；所得抗血清通过饱和硫酸铵沉淀法，透析至pH 7.8的磷酸缓冲液，然后通过protein A亲和层析的方法对抗血清进行纯化获得兔抗AMV多克隆抗体IgG。
2、胶体金标记兔抗AMV多克隆抗体的方法如下：
分别取粒径为30nm的胶体金5mL及兔抗AMV多克隆抗体65μg，在pH 7.9的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加10％牛血清白蛋白(BSA)和5％PEG 20000作为稳定剂，使得终浓度分别为0.5％和0.2％，采用低温高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体结合物。
3、胶体金结合垫的制备：
用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮胶体金—抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37℃烘干，制成胶体金结合垫。
4、免疫层析膜的包被：
检测T线包被的是纯化的兔抗AMV多克隆抗体IgG，对照C线包被的是羊抗兔IgG抗体，每条线宽2mm，兔抗AMV多克隆抗体合适包被量为1.4μg 蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为1.6μg蛋白。
5、胶体金免疫层析GICA检测卡的组装
作为支撑载体聚氯乙烯衬板体被固定于检测卡槽下壳体中，样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，再通过卡扣将GICA检测卡槽上壳体与下壳体连接。
本实施例还提供了上述检测卡的检测方法：
参照图1所示，吸取少量样品的待检测溶液，滴在GICA检测卡槽上壳体加样窗2处，由于毛细效应液体往前移动，若待测液中含有AMV，检测样品经过胶体金结合垫时，AMV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测T线方向层析泳动，当接触到检测T线时，与检测T线上的AMV多克隆抗体发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的复合物继续向质控C线方向渗移，当接触到质控C线时与固定在质控C线上的羊抗兔IgG抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了苜蓿花叶病毒 AMV；
若待测液中不含AMV或AMV含量较低时，检测样品经过胶体金结合垫时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合或者结合的复合物量非常少，当接触到所述检测T线时不发生反应，金标多克隆抗体继续向质控C线方向渗移，当接触到质控C线时与固定在质控C线上的羊抗兔IgG抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染苜蓿花叶病毒AMV或感染苜蓿花叶病毒AMV 的含量低，需要后续进一步的试验分析。
由此可见，本实施例提供的检测卡可初步对苜蓿花叶病毒AMV进行快速筛查，田间地头及现场就地检测，检测人员无需培训，3～5分钟可初步判断被检样品的病毒感染情况，达到快速、简便、高效检测AMV的目的。
实施例2
本实施例提供了一种检测苜蓿花叶病毒AMV的GICA-RT-LAMP试剂盒。
GICA-RT-LAMP试剂盒由三部分组成，分别为苜蓿花叶病毒AMV胶体金免疫层析GICA检测卡；RT-LAMP特异性引物组合物和RT-LAMP扩增反应试剂；
除此之外，GICA-RT-LAMP试剂盒还包括磷酸缓冲液(PBS)、磷酸洗涤缓冲液(PBST)、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。
其中RT-LAMP特异性引物组合物包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物 F3、SEQID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、 SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP和SEQ ID NO.5所示的反向环引物LB。
各引物序列具体如下：
F3：5’-GGTTTGAGCTGGTCTTCACA-3’；
B3：5’-ATTAAACTGCGGAGGGGC-3’；
FIP：
5’-TCCAAACAAAGGGCTACGGCATCTCCTACCCATGCGGGAA-3'；
BIP：
5’-CTTCGACGCTCAGCCTGAGGCGGAAACGCCTTTCTCTCG-3’；
LB：5’-AAAAATCCCTCATACCGATTCAACG-3’。
RT-LAMP扩增反应试剂由10U/μL AMV反转录酶、40U/μL RNAse抑制剂、10mM dNTP混合物、10×ThermoPol反应缓冲液、100mM MgSO4、8U/μL Bst DNA polymerase和RNA-freeH2O组成；
磷酸缓冲液(PBS)和磷酸洗涤缓冲液(PBST)的浓度为0.02M，pH值为 7.4；
荧光染料检测液为1000×SYBR Green I；
阴性对照品为RNA-free H2O；
阳性对照品为当归AMV CP基因标准品。
本实施例还提供了AMV CP基因标准品的制备方法。具体制备方法如下：
1、总RNA的提取：
将50-100mg感染AMV的当归叶片在液氮中研磨，用植物总RNA提取试剂盒提取感病组织的总RNA；
2、引物设计与合成：
根据小RNA测序得到的AMV基因序列，设计并合成了1对CP基因的特异性正向(AMV-F)和反向引物(AMV-R)；其中上述引物序列如下：
AMV-F：
5’-CCGGAATTCATGAGTTCTTCACAAAAGAAAACTGG-3’
AMV-R：5’-GTCGACATGACGATCAAGATCGTCAGCTTCGT-3’；
3、阳性对照品的制备：
1)RT反应
利用上述AMV反向引物AMV-R和M-MLV反转录酶进行RT反应，合成 cDNA第一链；10μL RT反应体系如下:总RNA 2μL，10μM AMV特异性反向引物AMV-R 1μL，RNA-free H2O 3μL，70℃变性10min，迅速置冰上急冷2min；再加入5×M-MLV buffer 2μL，10mM dNTPs 1μL，30U/μL RNase抑制剂0.34μL， 200U/μL M-MLV反转录酶0.35μL和RNA-free 0.31μL；混合后42℃水浴1h， 70℃保温15min，置冰上待用。
2)PCR反应
利用上述cDNA第一链为模板，在Ex Taq DNA聚合酶作用下进行AMV CP 基因的PCR扩增；
PCR反应体系为12.5μL，包括：50ng cDNA 0.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.1μL，10×PCR buffer 1.25μL，2.5mM dNTPs 1μL，10μM正向引物AMV-F 0.25μL，10μM反向引物AMV-R 0.25μL，ddH2O补足至12.5μL；
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸45s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min；
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，利用克隆载体试剂盒将目的片段连接在pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑平板筛选；随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨苄LB培养基上，37℃摇菌12～ 16h；使用质粒微量抽提试剂盒提取质粒；分别取1μL质粒，在与上述PCR反应体系相同的条件下进行PCR扩增；将PCR检测得到的阳性重组质粒测序；测序证实序列完全正确的阳性质粒，即为阳性对照品，当归AMV CP基因对应的片段长度分别为663bp；用NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定标准品的质粒浓度；
4、阳性对照品的序列
经测序，上述阳性对照品与预期完全相符，回收的对照品片段序列如下：
当归AMV CP基因片段标准品序列：
ATGAGTTCTTCACAAAAGAAAACTGGTGGGAAAGCTGGTAAACCTAC TAAACGTTCTCAGAACTATGCTGCTTTACGCAAAGCTCAACTGCCGAAGCC TCCGGCGTTGAAAGTCCCGGTTGCAAAACCGACGAATACTATACTGCCAC AGACGGGCTGCGTGTGGCAAAGCCTCGGGACCCCTCTGAGTCTGAGCTCT TTCAATGGGCTCGGCGTGAGATTCCTCTACAGTTTTTTGAAGGATTTCACG GCCCCCCGGATCCTCGAGGAGGATCTGATTTTCAGGATGGTGTTTTCTGTG ACTCCATCCCATGCCGGCACCTTTTGTCTCACTGATGACGTGACGACAGAG GAGGGTAGGGCCGTTGCGCATGGTAATCCCATGCAAGAGTTTCCTCATGGC GTTTTCCATGCCAATGAGAAGTTCGGGTTTGAGCTGGTCTTCACAGCTCCT ACCCATGCGGGAATGCAAAATCAAAATTTTAAGCATTCCTATGCCGTAGCC CTTTGTTTGGACTTCGACGCTCAGCCTGAGGGATCTAAAAATCCCTCATAC CGATTCAACGAAGTTTGGGTCGAGAGAAAGGCGTTTCCGCGAGCAGGGC CCCTCCGCAGTTTAATAACTGTGGGGTTGCTCGACGAAGCTGACGATCTTG ATCGTCAT。
实施例3
本实施例提供了GICA-RT-LAMP试剂盒检测AMV的方法。
1、胶体金免疫层析GICA富集病毒粒子
1)取100mg感染AMV的当归样品或其他待检样品放入3mL装有磷酸缓冲液PBS的自封袋中，用研棒轻轻研磨，研磨后的组织液即为待检样品的检测液；
2)吸取少量上述待测样品的检测液，滴在AMV胶体金免疫层析GICA检测卡加样窗2处，3-5分钟内在反应观察窗3内观察显色结果。
2、初次判断反应结果
当上述AMV胶体金免疫层析GICA检测卡反应观察窗3内的检测T线9和质控C线10上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了苜蓿花叶病毒 AMV，无需进行后续检测；
当上述AMV胶体金免疫层析GICA检测卡反应观察窗3内的检测T线9没有颜色变化，而质控C线10上出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染苜蓿花叶病毒AMV，或者感染AMV的程度轻，则需进行后续的反转录RT-LAMP检测。
3、RT-LAMP反应
1)将上述反应结束的AMV胶体金免疫层析GICA检测卡的检测T线切下，用PBST冲洗三次，用消毒刀片小心地刮下T线区域，放入PCR管中；
2)在上述含有T线的PCR管中加入40U/μL RNAse抑制剂0.15μL、10U/μL AMV反转录酶0.3μL、10×ThermoPol缓冲液1.25μL、100mM MgSO4 0.75μL、 10mM dNTP混合物1.75μL、分别含2.5μM B3和F3，20.0μM FIP和BIP，以及10.0μM LB的LAMP引物组1.0μL、8U/μL BstDNA polymerase 1.0μL、RNAse free H2O补足至12.5μL；以RNA-free H2O作为阴性对照，当归AMV CP基因标准品作为阳性对照；反应体系配置完成后，在PCR管盖内壁加1μL 100×SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管盖，进行RT-LAMP反应；RT-LAMP的反应条件为:60-64℃扩增60-100min，随后80℃变性10min，终止反应。
4、二次判断反应结果
上述RT-LAMP反应结束后，在不开盖的情况下，离心或轻甩PCR管，使PCR 管盖内壁上的SYBR Green I荧光染料与LAMP扩增产物混合，上下颠倒混匀，采用肉眼观察PCR管内混合液的颜色变化：
若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA结合，则为阳性反应，表示被检样品中含有苜蓿花叶病毒AMV；
若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含苜蓿花叶病毒AMV。
实验例1
本实验例提供了实施例2中的GICA-RT-LAMP试剂盒检测AMV病毒在不同反应温度和反应时间下的荧光染料肉眼观察实验，检测方法参照实施例3所示。
分别测试56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃和70℃的RT-LAMP 扩增温度下扩增80min的扩增结果。图3所示，图中：1：阴性对照；2-9分别对应：56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃和70℃。由图可知，本发明实施例提供的扩增引物组合能在60-64℃条件下实现靶基因的高效扩增。
分别测试20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min的RT-LAMP扩增时间下扩增温度为64℃的扩增结果。图4所示，图中： 1：阴性对照；2-10分别对应：20min、30min、40min、50min、60min、70min、 80min、90min、100min。由图可知，本发明实施例提供的扩增引物组合能在 60-100min条件下实现靶基因的高效扩增。
实验例2
胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测AMV的特异性。
为了分析胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测当归AMV的特异性，以感染百合、生菜当归、的10个常见病毒:百合隐症病毒LSV、百合黄瓜花叶病毒 CMV-Li、百合斑驳病毒LMoV、百合南芥菜花叶病毒ArMV、百合车前草花叶病毒PlAMV、当归日本金鱼藻花叶病毒JHMV-DG、生菜坏死黄化病毒LNYV、生菜花叶病毒LMV、生菜黄瓜花叶病毒CMV-L、当归苜蓿花叶病毒AMV的感病叶片(田间收集)为样品，分别在装有PBS缓冲液的自封袋中用研棒轻轻研磨，研磨后制成检测液滴加至AMV胶体金免疫层析GICA检测卡的加样窗3， 3-5分钟后观察显色结果；随后，再用上述实施例中的GICA-RT-LAMP检测体系和检测方法进行RT-LAMP扩增，反应程序为64℃扩增80min，扩增结束后显色。以健康当归叶片为阴性对照，实验重复3次；
AMV胶体金免疫层析GICA检测卡的显色结果显示，只有感染AMV的当归叶片样品的检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带，而其他样品的检测T 线没有颜色变化，质控C线上出现棕红色的条带。
SYBR Green I荧光染料肉眼观察法结果显示，只有感染AMV的当归叶片的扩增产物出现绿色，其余感病叶片的扩增产物与健康当归叶片的扩增产物均为橙色(图5)；这表明本发明建立的GICA-RT-LAMP方法对AMV病毒有很高的特异性，与其他常见病毒无交叉反应。
实验例3
胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测AMV的灵敏性。
为了分析胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测AMV的灵敏性，以上述实施例中当归AMV CP基因标准品为样品，经NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定浓度(1.1×105ng/mL)后，再用RNA-free H2O对上述标准品进行10倍比稀释，-20℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各稀释液1.0μL作为模板，加入上述实施例中的RT-LAMP反应试剂进行RT-LAMP扩增，反应程序为64℃扩增80min；
作为对比检测，将上述10倍比稀释后的各稀释液进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸45s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min；
RT-LAMP反应结束后，SYBR Green I荧光染料肉眼观察法观察显色情况，结果显示GICA-RT-LAMP对当归AMV CP基因标准品的反应灵敏度为1.1×10-3 ng/mL，即1.1pg/mL(图6)；PCR反应结束后，取5μL扩增产物上样，琼脂糖凝胶电泳结果显示，GICA-RT-PCR对当归AMV CP基因标准品的反应灵敏度为1.1 ×10-2ng/mL，即11pg/mL(图7)，可见胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测 AMV的灵敏性是GICA-RT-PCR的10倍。
实验例4
胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测田间样品。
取田间当归叶片样品，用AMV胶体金免疫层析GICA检测卡富集病毒粒子，再用上述实施例3中的GICA-RT-LAMP检测体系进行RT-LAMP扩增。
若GICA检测卡的检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带，则判定被检样品感染了苜蓿花叶病毒AMV；
若GICA检测卡检测T线没有颜色变化，而质控C线上出现棕红色的条带，同时荧光染料肉眼观察法显示绿色，说明样品中含有苜蓿花叶病毒AMV；
若GICA检测卡检测T线没有颜色变化，而质控C线上出现棕红色的条带，同时荧光染料肉眼观察法显示橙色，说明样品中不含苜蓿花叶病毒AMV。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院西北生态环境资源研究院
<120> 一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒及检测卡
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtttgagct ggtcttcaca 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attaaactgc ggaggggc 18
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccaaacaaa gggctacggc atctcctacc catgcgggaa 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttcgacgct cagcctgagg cggaaacgcc tttctctcg 39
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaaatccct cataccgatt caacg 25

Claims (10)

1.一种检测苜蓿花叶病毒的RT-LAMP检测引物组合物，其特征在于，其包括如SEQ IDNO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP和SEQ ID NO.5所示的反向环引物LB。
2.一种苜蓿花叶病毒的检测卡，其特征在于，其包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述胶体金结合垫上含有胶体金-苜蓿花叶病毒抗体的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有AMV的抗体IgG，所述质控C线包被有抗AMV抗体的二抗；所述检测T线上AMV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；所述抗AMV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；
所述胶体金结合垫上的苜蓿花叶病毒抗体的包被量为每毫升胶体金中含13-14μg的苜蓿花叶病毒抗体。
3.根据权利要求2所述的苜蓿花叶病毒的检测卡，其特征在于，所述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，所述衬板与所述下壳体的一个端面固定连接，所述上壳体与所述下壳体固定连接，且所述上壳体与所述下壳体留有放置所述衬板的安装腔。
4.根据权利要求3所述的苜蓿花叶病毒的检测卡，其特征在于，所述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，所述加样窗空间上位于所述样品垫的上方，所述反应观察窗空间上位于所述硝酸纤维素膜的上方；
优选地，所述上壳体与所述下壳体通过卡扣结构卡接。
5.一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2-4任一项所述的苜蓿花叶病毒的检测卡和权利要求1所述的检测苜蓿花叶病毒的RT-LAMP检测引物组合物。
6.根据权利要求5所述的检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，所述RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、ThermoPol反应缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶和水；
优选地，所述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；
优选地，所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为苜蓿花叶病毒外壳蛋白CP基因片段标准品；
优选地，所述反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶；
优选地，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶。
7.一种采用如权利要求5-6任一项所述的检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒检测苜蓿花叶病毒的检测方法，其特征在于，其包括：
(1)取待测溶液置于苜蓿花叶病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒AMV；
(2)若根据步骤(1)无法鉴别待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒AMV，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤(1)免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用RT-LAMP检测引物组进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒。
8.根据权利要求7所述的检测苜蓿花叶病毒的检测方法，其特征在于，根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有AMV的具体方法为肉眼观察法；所述肉眼观察法为：
若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有苜蓿花叶病毒AMV，无需进行反转录RT-LAMP扩增；
若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染苜蓿花叶病毒AMV，或感染苜蓿花叶病毒AMV的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增。
9.根据权利要求7所述的检测苜蓿花叶病毒的检测方法，其特征在于，根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品是否含有苜蓿花叶病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法；所述荧光染料肉眼观察法为：
取荧光染料反应液在反应前加入RT-LAMP扩增反应管的管盖上，待LAMP扩增反应结束后，使荧光染料检测液与LAMP反应液混合，采用肉眼直接观察混合反应液的颜色：
优选地，荧光染料反应液为SYBR Green I，若扩增产物出现绿色荧光，表示待测样品中含有苜蓿花叶病毒；
若扩增产物颜色为橙色则表示待测样品中不含苜蓿花叶病毒。
10.一种如权利要求2-4任一项所述的苜蓿花叶病毒的检测卡、权利要求1所述的检测苜蓿花叶病毒的RT-LAMP检测引物组合物或权利要求5-6任一项所述的检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒在检测苜蓿花叶病毒中的应用。
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