CN113925974A - 一种可靶向肠道肿瘤的抗癌复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可靶向肠道肿瘤的抗癌复合物，由益生菌表面通过连接分子固定纳米材料构成；纳米材料选自含有过渡金属的复合纳米材料、含有过渡金属的纳米金属氧化物、含有过渡金属的纳米金属过氧化物、含有过渡金属的纳米金属硫化物或含有过渡金属的纳米金属材料中的任意一种；连接分子一端与细菌表面分子结合，另一端与所述的纳米材料结合。本发明将益生菌与产生活性氧纳米材料复合，显著提高了纳米材料在肠道尤其是肠道肿瘤病灶的富集，增强了纳米材料在肠道内生成活性氧的能力，提升了对肠道肿瘤的治疗能力；所得复合物可用于制作口服治疗肠癌的药物，制备方法简便可控，生产效率高，治疗效果显著。

Description

一种可靶向肠道肿瘤的抗癌复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤功能的复合物，尤其涉及一种可靶向肠道肿瘤的抗癌复合物，及其制备方法和应用。
背景技术
肠道癌简称肠癌，是胃肠道中常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃和食管癌。肠癌具有起病隐匿的特点，早期常无明显的临床表现，被发现时往往已经达到中晚期。晚期肠癌从确诊到死亡仅需6个月的时间，死亡率高，治愈率低。肠癌的绝大多数病人在40岁以上，30岁以下者约占15％。随着人口老龄化的发展，肠癌发病率高并有连年上升趋势。Chin JCancer Res2018年公布的一项数据显示我国结直肠癌发病率居于男性第4位，女性第3位，死亡率居于男性第5位，女性第4位。
肠癌手术治疗后容易产生局部复发，往往需要配合放疗或化疗。但传统的放疗和化疗往往会带来严重的副作用。化疗还需要静脉给药，病人的依从度较低。使用中药口服治疗，病人依从度高，但疗效不佳且稳定性差。
肠道菌群是人体重要组成部分，肠道微生物和肠道粘膜免疫之间的相互作用影响着免疫反应的启动和调节。目前，有一些研究表明益生菌有可能通过调整肠道菌群，调节机体免疫、抗炎、代谢使致癌物失活、抗氧化、诱导肿瘤细胞凋亡等机制发挥防治肠癌的作用。但是目前单纯使用益生菌对肠癌的防治作用还不够显著。
活性氧(ROS)是一类细胞代谢过程中产生的氧化性分子(例如超氧阴离子、H2O2、羟自由基、羟离子等)。当细胞内的ROS与抗氧化物(例如抗坏血酸、谷胱甘肽等)之间的平衡被打破时，便会产生氧化应激反应，过氧化细胞内生物大分子，从而损伤细胞。目前有一些研究已经致力于开发能产生活性氧的抗肿瘤纳米材料，包括金属氧化物纳米颗粒(例如，氧化铁、ZnO、TiO2)、2D纳米材料(例如，石墨烯基金属碳化物和氮化物)、金属-有机框架(MOF)，过氧化物酶衍生物等。这些纳米材料往往需要通过静脉系统给药，肿瘤靶向性差且产生较大的毒副作用。口服给药往往是治疗肠道疾病的首选方案。但是这些纳米材料经过口服给药时，缺乏肿瘤靶向和富集能力。同时这些纳米材料产生活性氧的效率依赖于微环境中的pH值，弱酸性时产生活性氧效率高而弱碱性时效率低。因此肠道内的弱碱性环境不利于这些纳米材料发挥治疗效果。
许多细菌包括一些益生菌被发现具有靶向肿瘤区域的能力。尤其是益生菌可在肠道定植。因此我们设想益生菌将有能力携带纳米材料定植到肠道，尤其是靶向肠道肿瘤区域。同时益生菌有望重塑健康的肠道菌群，将糖发酵成短链脂肪酸，这有助于提高宿主的免疫能力，并且降低肠道尤其是肠道肿瘤内的pH值，从而增强产生活性氧纳米材料的抗肿瘤效果。
发明内容
鉴于上述背景，本发明的目的在于：提供一种新的抗肠癌药物复合物，基于益生菌和产生活性氧的纳米材料，可靶向肠道肿瘤，并具有良好的抗肿瘤效果。
本发明的另一个目的在于：提供制备所述抗肠癌药物复合物的方法。
本发明的再一个目的在于：提供所述药物复合物在制备口服抗癌药中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，提供一种可靶向肠道肿瘤的抗癌复合物，由益生菌表面通过连接分子固定纳米材料构成；所述的益生菌是具备肠道定植能力且能代谢产生酸性物质的益生菌；所述的纳米材料是能够产生活性氧(ROS)的纳米材料。
本发明所述的抗癌复合物中，所述的益生菌优选为厌氧的革兰氏阳性菌，进一步优选双歧杆菌、乳杆菌或丁酸梭菌中的任意一种。
本发明所述的抗癌复合物中，所述的能够产生活性氧的纳米材料优选那些能在弱酸性微环境和双氧水存在条件下产生细胞杀伤性活性氧的纳米材料，进一步优选含有过渡金属的复合纳米材料、含有过渡金属的纳米金属氧化物、含有过渡金属的纳米金属过氧化物、含有过渡金属的纳米金属硫化物或含有过渡金属的纳米金属材料中的任意一种。
本发明进一步优选的抗癌复合物中，所述的过渡金属元素是Au、Fe或Cu中的任意两种或两种以上。
所述的含有过渡金属的复合纳米材料的结构通常由非活性中心的载体和活性中心的过渡金属元素构成；其中，所述的载体为含有N元素和O元素的碳材料，起分散支撑作用；所述活性中心的过渡金属元素具有氧化酶活性和过氧化物酶活性，在酸性条件下可以催化O2或H2O2产生ROS。
在本发明的一种实施方式中，所述抗癌复合物中能够产生活性氧的纳米材料是含有过渡金属的复合纳米材料，优选是含有过渡金属的金属-有机框架材料(MOFs)，更优选以过渡金属为活性中心的以下任意一种MOFs材料：ZIF-7、ZIF-8、ZIF-67、ZIF-68、ZIF-90、MIL-100、MIL-101、UiO-66、UiO-67、UiO-68、PCN-128、PCN-224、PCN-333、HKUST-1 或IRMOF-74。
在本发明的另一种实施方式中，所述抗癌复合物中能够产生活性氧的纳米材料是含有过渡金属的纳米金属氧化物，优选铁氧化物纳米粒子(FeOx，x为1～1.5之间)或铜氧化物纳米粒子(CuyO，y为1～2之间)。
在本发明的另一种实施方式中，所述抗癌复合物中能够产生活性氧的纳米材料是含有过渡金属的纳米金属过氧化物，优选是CuO2。
在本发明的另一种实施方式中，所述抗癌复合物中能够产生活性氧的纳米材料是含有过渡金属的纳米金属硫化物，优选是CuS。
在本发明的另一种实施方式中，所述抗癌复合物中能够产生活性氧的纳米材料是含有过渡金属的纳米金属材料，优选金纳米簇或纳米金铁合金AuFe。
本发明所述的抗癌复合物中，所述的连接分子一端与细菌表面分子结合，另一端通过疏水作用、π-π堆积作用、酰胺化共价反应或金属-巯基共价作用与所述的纳米材料结合。所述的连接分子优选DSPE-PEG-COOH、多巴胺、NH2-PEG-NH2、C18-PEG-NH2、4-巯基苯硼酸或C18-PEG-B。
第二方面，本发明提供一种制备所述抗癌复合物的方法，包括：先用两亲性连接分子修饰能够产生ROS的纳米材料，再将益生菌与连接分子修饰的纳米材料一起混合孵育，即可得到由连接分子两端分别结合益生菌和能够产生ROS的纳米材料的复合物，所述复合物中，连接分子一端与细菌表面分子结合，另一端通过疏水作用、π-π堆积作用、酰胺化共价反应或金属-巯基共价作用与所述的纳米材料结合。
本发明优选的制备所述抗癌复合物的方法包括以下步骤：
1)制备能够产生ROS的纳米材料，包括含有过渡金属的复合纳米材料、含有过渡金属的纳米金属氧化物、含有过渡金属的纳米金属过氧化物、含有过渡金属的纳米金属硫化物或含有过渡金属的纳米金属材料中的任意一种；将制备好的纳米材料分散到生理盐水中，控制其浓度为0.2～10mg/mL，得到液体A；
2)将两亲性连接分子溶于生理盐水，控制连接分子浓度为0.2～10mg/mL，得到溶液B；
3)将益生菌分散到生理盐水中，控制其浓度为1～100×106CFU/mL，得到溶液C；
4)将1)得到的溶液A和2)得到的溶液B等体积混合，然后在低温条件下搅拌1～3小时，离心、洗涤、重新分散到等体积的生理盐水中，控制其浓度为0.1～5mg/mL，得到连接分子修饰的纳米材料溶液D；
5)将4)得到的溶液D与3)得到的溶液C等体积混合，然后在常温下混合孵育5-30分钟，离心、洗涤，即得到益生菌与产生活性氧纳米材料的复合物，也就是本发明所述的抗癌复合物。
第三方面，本发明还提供所述抗癌复合物在制备口服抗癌药物中的应用。
本发明的抗癌复合物的结构及原理说明：本发明的复合物利用自组装作用，使益生菌、连接分子和产生活性氧的纳米材料在温和条件下形成复合物，其结构大体如图1所示，由益生菌表面通过连接分子固定纳米材料构成。本发明复合物的抗癌应用中，益生菌定植到肠道后，可分泌短链脂肪酸等酸性物质，降低局部微环境中的pH值，增强纳米材料产生活性氧的能力；同时可调节免疫微环境，增强宿主的自身抗癌能力。产生活性氧的纳米材料可在足够的双氧水存在和适宜的pH条件下，基于Fenton或类Fenton样反应，生成细胞杀伤性活性氧。连接分子的一端可与细菌表面分子结合、另一端可通过疏水作用和π-π堆积作用与纳米材料结合，从而可在温和条件下方便地形成复合物，不影响益生菌和纳米材料的活性。
与现有技术相比，本发明抗癌复合物及其制备方法的有益效果主要体现在以下几方面：
1.本发明的抗癌复合物采用能通过口服定植到肠道的益生菌作为产生活性氧纳米材料的载体，提高了纳米材料在肠道、尤其是肠道肿瘤病灶中的富集能力，增强了纳米材料在肠道内生成活性氧的能力，大大提升了对肠道肿瘤的治疗能力。
2.本发明的抗癌复合物可用于制作口服治疗肠癌的药物，制备方法简便可控，制备速度快，可控性好，生产效率高，治疗效果显著，具有广阔的应用前景。
3.本发明的抗癌复合物及其制备方法不依赖于细菌表面的特殊结构，适用于多种益生菌，具有良好的普适性；可方便地调控纳米材料在细菌表面的包裹量，不影响益生菌的生理功能。
4.本发明的抗癌复合物在动物体内实验中表现出优异的生物相容性和治疗肠道肿瘤的能力，适合口服给药，具有很强的临床转化潜力。
附图说明
图1是本发明所述抗癌复合物的结构及作用原理示意图。
图2是实施例1中制备的产生活性氧纳米材料ZIF-8/AuFe的扫描电镜照片。
图3是实施例1中的ZIF-8/AuFe包裹双歧杆菌前后的的扫描电镜照片，其中(a)显示的是原始的双歧杆菌，(b)显示的是双歧杆菌被ZIF-8/AuFe包裹后的复合物。
图4体现了实施例1所得的复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(A)在不同pH条件下产生活性氧的能力。
图5是实施例2中的复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(B)的透射电镜图片。
图6是实施例3中的复合物ZIF-8/AuFe@4-巯基苯硼酸@Probiotics的透射电镜图片。
图7是实施例4中的复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(C)的扫描电镜图片。
图8是实施例5中的复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(D)的透射电镜图片。
图9是实施例6中的复合物ZIF-8/AuCu@C18-PEG-B@Probiotics的透射电镜图片。
图10是实施例8中制备的复合物PB@Probiotics的透射电镜图片。
图11是实施例9中制备的掺杂铁的聚多巴胺(Fe-PDA)纳米颗粒的透射电镜图片。
图12是实施例9中制备的复合物Fe/MPDA@Probiotics的透射电镜图片。
图13体现了实施例1所得的复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics在肠道尤其是肠癌区域富集的效果，其中(a)为血平板数据，(b)为革兰氏染色数据，(c)为SEM电镜图片。
图14体现的是分别采用单纯的益生菌和实施例1所得的复合物 ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics在小鼠体内治疗结肠癌的效果。
图15体现的是实施例1所得的复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics的健康小鼠体内安全性评价结果，其中(a)体现的是给药期间小鼠的体重变化，(b)是给药30天后的小鼠组织外观照片，(c)是给药30天后小鼠的组织切片图片。
具体实施方式
本发明提供一种抗癌复合物，由益生菌表面通过连接分子固定纳米材料构成。
所述的益生菌是具备肠道定植能力且能代谢产生酸性物质的益生菌；优选为厌氧的革兰氏阳性菌，进一步优选双歧杆菌、乳杆菌或丁酸梭菌中的任意一种。
所述的纳米材料是能够产生活性氧(ROS)的纳米材料，优选那些能在弱酸性微环境和双氧水存在条件下产生细胞杀伤性活性氧的纳米材料，进一步优选含有过渡金属的复合纳米材料、含有过渡金属的纳米金属氧化物、含有过渡金属的纳米金属过氧化物、含有过渡金属的纳米金属硫化物或含有过渡金属的纳米金属材料中的任意一种。
含有过渡金属的复合纳米材料优选是含有过渡金属的金属-有机框架材料(MOFs)，更优选以过渡金属为活性中心的以下任意一种MOFs材料：ZIF-7、ZIF-8、ZIF-67、ZIF-68、 ZIF-90、MIL-100、MIL-101、UiO-66、UiO-67、UiO-68、PCN-128、PCN-224、PCN-333、HKUST-1或IRMOF-74。含有过渡金属的纳米金属氧化物优选铁氧化物纳米粒子(FeOx，x 为1～1.5之间)或铜氧化物纳米粒子(CuyO，y为1～2之间)。含有过渡金属的纳米金属过氧化物优选CuO2。含有过渡金属的纳米金属硫化物优选CuS。含有过渡金属的纳米金属材料优选金纳米簇或纳米金铁合金AuFe。
所述的连接分子优选DSPE-PEG-COOH、多巴胺、NH2-PEG-NH2、C18-PEG-NH2、4-巯基苯硼酸或C18-PEG-B。所述的连接分子一端与细菌表面分子结合，另一端通过疏水作用、π-π堆积作用、酰胺化共价反应或金属-巯基共价作用与所述的纳米材料结合，其中， DSPE-PEG-COOH、C18-PEG-NH2或C18-PEG-B可以通过疏水非共价作用连接疏水的产生活性氧的纳米材料；多巴胺或NH2-PEG-NH2可以连接可以与氨基共价连接的产生活性氧的纳米材料，如纳米材料表面含有羧基等官能团；4-巯基苯硼酸可以连接可以与巯基共价连接的产生活性氧的纳米材料，如纳米材料含有Au、Ag、Fe、Cu等金属元素。
本发明采用的益生菌，为厌氧的革兰氏阳性菌，是人和动物肠道菌群的重要成员之一。益生菌具有携带纳米材料定植到肠道、代谢产生短链脂肪酸改造微环境、调节免疫功能等多种重要功能。产生活性氧的纳米材料能将生理或病理条件下的双氧水等前体物质分解为活性氧，杀死肿瘤细胞。具有细菌和纳米材料结合能力的连接分子可方便地将两者结合，形成功能性复合物，对肠癌具有明显的治疗作用。
制备本发明抗癌复合物的方法包括以下步骤：
1)制备能够产生ROS的纳米材料，例如可以制备含有过渡金属的复合纳米材料、含有过渡金属的纳米金属氧化物、含有过渡金属的纳米金属过氧化物、含有过渡金属的纳米金属硫化物或含有过渡金属的纳米金属材料中的任意一种。
2)将连接分子溶于生理盐水中，浓度为0.2～10mg/mL，优选0.5～3mg/mL，更优选1～3 mg/mL，最优选1mg/mL。连接分子包括DSPE-PEG-COOH、多巴胺、NH2-PEG-NH2、 C18-PEG-NH2、4-巯基苯硼酸、C18-PEG-B。
3)培养益生菌，包括双歧杆菌、乳杆菌、丁酸梭菌中的一种。离心收集并将其重新分散到生理盐水中，浓度为1～100×106CFU/mL；优选5～100×106CFU/mL，更优选10～100×106 CFU/mL，进一步优选10～50×106CFU/mL，最优选10～20×106CFU/mL。
4)将步骤1)所得的产生活性氧纳米材料分散到生理盐水中，浓度为0.2～10mg/mL，优选0.5～5mg/mL，更优选1～5mg/mL，最优选1mg/mL；并与步骤2)得到的溶液混合，体积比为1:1。将混合溶液在低温条件下搅拌2小时，离心，洗涤，并重新分散到等体积的生理盐水中，得到连接分子修饰的纳米材料。
5)将步骤4)所得的连接分子修饰的纳米材料，浓度为0.1～5mg/mL，优选0.5～5mg/mL，更优选1～5mg/mL，最优选1mg/mL；并与步骤3)得到的细菌溶液混合，体积比为1:1。将混合溶液在常温条件下孵育5-30分钟，离心，洗涤，即可得到益生菌与产生活性氧纳米材料的复合物。
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1
1)制备能够产生ROS的纳米材料：
1314mg 2-甲基咪唑，1190mg六水合硝酸锌，140mg乙酰丙酮铁以及20mg氯金酸溶于45mL甲醇，超声10min，常温搅拌2小时得到含有金铁的有机金属框架材料(ZIF-8/AuFe)，其微观形态如图2所示；
2)用连接分子修饰能够产生ROS的纳米材料：
50mL 1mg/mL ZIF-8/AuFe与50mL 1mg/mL的C18-PEG-B，在低温条件下搅拌2小时，离心，洗涤，并重新分散到50mL生理盐水中，得到连接分子修饰的纳米材料 ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B。
3)制备益生菌液：
培养双歧杆菌(微观形态如图3(a)所示)，离心收集并将其重新分散到生理盐水中，控制其浓度为1×107CFU/mL。
4)制备抗癌复合物：
将2mL步骤2)所得的ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B与1mL步骤3)所得的浓度的双歧杆菌，在常温条件下混合孵育5分钟，离心，洗涤，再分散到10mL N2保护的培养基中，即可得到益生菌与产生活性氧纳米材料的复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(A)。所得复合物的微观形态如图3(b)所示。
可将本实施例制得的复合物重新分散在缓冲液中制备成不同浓度的液体口服药物用于人体或动物体的肠癌治疗。
检测本实施例制备的ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(A)在不同pH条件下产生活性氧的能力，结果如图4所示，pH为2-6的酸性条件下，ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(A) 的ROS产生率可达60％，特别是在pH为3-5的酸性条件下， ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(A)的ROS产生率高于90％。
实施例2
参照实施例1的方法制备抗癌复合物，但步骤1)的氯金酸用量有所调整，具体是：1314mg 2-甲基咪唑，1190mg六水合硝酸锌，140mg乙酰丙酮铁以及10mg氯金酸溶于45mL甲醇，超声10min，常温搅拌2小时得到含有金铁的有机金属框架材料(ZIF-8/AuFe)。其他条件不变，最终制得的抗癌复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(B)在透射电镜下呈现如图5 所示的微观形态。
实施例3
参照实施例1的方法制备抗癌复合物，但步骤2)中用的连接分子有所不同，具体是：50mL 1mg/mL ZIF-8/AuFe与50mL 1mg/mL的4-巯基苯硼酸，在低温条件下搅拌2小时，离心，洗涤，并重新分散到50mL生理盐水中，得到连接分子修饰的纳米材料ZIF-8/AuFe@4-巯基苯硼酸，其他条件不变。最终制得的抗癌复合物ZIF-8/AuFe@4-巯基苯硼酸@Probiotics在透射电镜下呈现如图6所示的微观形态。
实施例4
参照实施例1的方法制备抗癌复合物，但步骤3)中双歧杆菌溶液的浓度有所调整，具体是：培养双歧杆菌，离心收集并将其重新分散到生理盐水中，控制其浓度为100×106CFU/mL，其他条件不变。最终制得的抗癌复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(C)在扫描电镜下呈现如图7所示的微观形态。
实施例5
参照实施例1的方法制备抗癌复合物，但步骤2)中加入的产生活性氧纳米材料(ZIF-8/AuFe)的浓度有所调整，具体为：50mL 5mg/mL ZIF-8/AuFe与50mL 1mg/mL的 C18-PEG-B，在低温条件下搅拌2小时，离心，洗涤，并重新分散到50mL生理盐水中，得到连接分子修饰的纳米材料ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B，其他条件不变。最终制得的抗癌复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics(D)在透射电镜下呈现如图8所示的微观形态。
实施例6
参照实施例1的方法制备抗癌复合物，但步骤1)中原料有所调整，具体是：1314mg2- 甲基咪唑，1190mg六水合硝酸锌，140mg乙酰丙酮铜以及20mg氯金酸溶于45mL甲醇，超声10min，常温搅拌2小时得到含有金铜的有机金属框架材料ZIF-8/AuCu，其他条件不变。最终制得的抗癌复合物ZIF-8/AuCu@C18-PEG-B@Probiotics在透射电镜下呈现如图9所示的微观形态。
实施例7
参照实施例1的方法制备抗癌复合物，但步骤3)中所用的益生菌种类不同，具体是：培养乳酸菌，离心收集并将其重新分散到生理盐水中，控制其浓度为1×107CFU/mL。其他条件不变。最终制得抗癌复合物ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@LAB。
实施例8
1)制备能够产生ROS的普鲁士蓝(PB)纳米粒子：
将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，3g)和铁氰化钾(K3[Fe(CN)6]·3H2O，131.7mg)加入HCl溶液 (0.01M，40mL)中，磁力搅拌30分钟使其充分溶解，得透明溶液。将其放入80℃电子鼓风烤箱中加热20小时，得蓝色溶液。10000rpm 10min离心，并以去离子水洗涤三次，即得能够产生ROS的PB纳米粒子，其中含有过渡金属Fe。
2)用连接分子修饰能够产生ROS的PB纳米粒子：
50mL 1mg/mL PB与50mL 1mg/mL的C18-PEG-B，在低温条件下搅拌2小时，离心，洗涤，并重新分散到50mL生理盐水中，得到连接分子修饰的纳米材料PB@C18-PEG-B。
3)制备益生菌液：
培养双歧杆菌，离心收集并将其重新分散到生理盐水中，控制其浓度为1×107CFU/mL。
4)制备抗癌复合物：
将2mL步骤2)所得的PB@C18-PEG-B与1mL步骤3)所得的浓度的双歧杆菌，在常温条件下混合孵育5分钟，离心，洗涤，再分散到10mL N2保护的培养基中，即可得到益生菌与产生活性氧纳米材料的复合物PB@C18-PEG-B@Probiotics，在透射电镜下呈现如图10 所示的微观形态。
实施例9
1)制备能够产生ROS的掺杂铁的聚多巴胺(Fe-PDA)纳米颗粒：
将盐酸多巴胺(180mg)与六水合氯化铁(24mg)溶于水(100mL)中，再加入三(羟甲基)氨基甲烷固体(400mg)，室温磁力搅拌下反应12h后，10000rpm离心收集产物并以去离子水洗涤。得到掺杂铁的聚多巴胺(Fe-PDA)纳米颗粒，在透射电镜下呈现如图11所示的微观形态。
2)用连接分子修饰能够产生ROS的Fe-PDA纳米颗粒：
50mL 1mg/mL的Fe-PDA纳米颗粒与50mL 1mg/mL的C18-PEG-B，在低温条件下搅拌2小时，离心，洗涤，并重新分散到50mL生理盐水中，得到连接分子修饰的纳米材料 Fe-PDA@C18-PEG-B。
3)制备益生菌液：
培养双歧杆菌，离心收集并将其重新分散到生理盐水中，控制其浓度为1×107CFU/mL。
4)制备抗癌复合物：
将2mL步骤2)所得的Fe-PDA@C18-PEG-B与1mL步骤3)所得的浓度的双歧杆菌，在常温条件下混合孵育5分钟，离心，洗涤，再分散到10mL N2保护的培养基中，即可得到益生菌与产生活性氧纳米材料的复合物Fe-PDA@C18-PEG-B@Probiotics，在透射电镜下呈现如图12所示的微观形态。
应用例1.小鼠模型实验
以BALB/c小鼠为实验动物建立肠癌模型，以按实施例1方法制备的 ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics作为治疗药物(即将实施例1所得 ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics重新分散在缓冲液中，使其中金属-有机框架纳米材料浓度为200μg/mL；双歧杆菌浓度为1×106CFU/mL)，观察治疗效果。具体实验方案如下：
BALB/c小鼠原位接种2.5×104荧光素酶转染的CT-26细胞，7天后形成原位肠癌。
实验一：
得到的一部分肠癌动物模型随机分为2组(给药组和对照组)，每组5只小鼠。连续给药 5天，给药组每只老鼠灌胃100μLZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics；对照组每只老鼠灌胃 100μL生理盐水。小鼠给药5天后，取每组所有鼠的主要器官，如心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，剪碎组织，称重，配成100mg组织/mL PBS的溶液，匀浆，稀释1000倍，涂平板计数，根据组织内的细菌数量结果可知，对照组的5只鼠上述所有器官组织中都未见细菌，而给药组5只小鼠都是只有涂肿瘤组织的平板有细菌生长，表明本发明实施例1的复合物可以靶向肿瘤组织。此外对给药组各小鼠平板上肿瘤组织的细菌进行革兰氏染色，结果显示靶向肿瘤组织的细菌是革兰氏阳性菌，通过对该细菌进行SEM拍摄证明了是双歧杆菌。说明本发明的ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics对原位肠癌具有明显的靶向效果。图13(a)显示了每组中任选的一只小鼠的各器官组织涂平板计数结果，图中方框内的肿瘤组织平板有细菌生长；图13(b)显示的是图13(a)方框中肿瘤组织平板上的细菌革兰氏染色结果；图13(c)显示的是13(a)方框中肿瘤组织平板上的细菌SEM照片。
实验二：
得到的另一部分肠癌动物模型随机分为3组(实验组、对照组和空白组)，每组3只小鼠。随后连续给药5天，对照组每只老鼠灌胃100μL双歧杆菌(1×106CFU/mL)；实验组每只老鼠灌胃100μLZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics；空白组每只老鼠灌胃100μL生理盐水。治疗过程中，每5天使用IVIS系统记录各组原位肿瘤的生长情况；每两天记录一次各组小鼠体重。15天后处死小鼠并解剖小鼠结肠，用IVIS系统记录各组原位肿瘤，并采用细菌涂平板对各组肿瘤内双歧杆菌定量计数，同时取各组肿瘤组织做革兰氏染色、HE染色和TUNEL染色。
如图14所示，根据IVIS系统记录可见，各组小鼠在初始阶段均有明显的原位肿瘤，证明了肠癌模型的有效建立。在此基础上，空白对照组由于未用任何药物治疗，其原位肿瘤随时间延长不断生长；给药双歧杆菌的对照组的原位肿瘤虽然有所缓解，但给药15天后仍然存在未治愈的原位肿瘤；相比之下，给药ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics的实验组各小鼠在给药5天后已观察不到原位肿瘤，并且疗效一直保持到第15天。说明本发明的 ZIF-8/AuFe@C18-PEG-B@Probiotics对原位肠癌具有显著的治疗作用。
另外，为了证明本发明所述抗癌复合物的安全性，将健康小鼠随机分为2组(对照组和给药组)，其中给药组给药实施例1的复合物，对照组不给药，共计给药30天，并周期性记录各组小鼠体重。30天后处死小鼠，取各主要脏器如心、肝、脾、肺、肾、肠、胃，用4％多聚甲醛固定液固定24小时，然后进行HE染色，观察组织有无病变。结果如图15所示，整个实验过程中，对照组和给药组小鼠体重均呈上升趋势，给药30天后给药组各主要脏器外观形貌和尺寸与对照组均无异常，脏器微观结构也无损伤和异常，且组间无显著差异。说明本发明的药物对小鼠无毒副作用。

Claims (9)

1.一种可靶向肠道肿瘤的抗癌复合物，其特征在于：由益生菌表面通过连接分子固定纳米材料构成；所述的益生菌是具备肠道定植能力且能代谢产生酸性物质的益生菌；所述的纳米材料是含有过渡金属的复合纳米材料、含有过渡金属的纳米金属氧化物、含有过渡金属的纳米金属过氧化物、含有过渡金属的纳米金属硫化物或含有过渡金属的纳米金属材料中的任意一种；所述的过渡金属元素是Au、Fe或Cu中的任意两种或两种以上；所述的连接分子一端与细菌表面分子结合，另一端与所述的纳米材料结合；所述的连接分子选自DSPE-PEG-COOH、多巴胺、NH2-PEG-NH2、C18-PEG-NH2、4-巯基苯硼酸或C18-PEG-B。
2.权利要求1所述的抗癌复合物，其特征在于：所述的益生菌是厌氧的革兰氏阳性菌，进一步优选双歧杆菌、乳杆菌或丁酸梭菌中的任意一种。
3.权利要求1所述的抗癌复合物，其特征在于：所述的含有过渡金属的复合纳米材料是含有过渡金属的金属-有机框架材料(MOFs)，优选以过渡金属为活性中心的以下任意一种MOFs材料：ZIF-7、ZIF-8、ZIF-67、ZIF-68、ZIF-90、MIL-100、MIL-101、UiO-66、UiO-67、UiO-68、PCN-128、PCN-224、PCN-333、HKUST-1或IRMOF-74。
4.权利要求1所述的抗癌复合物，其特征在于：所述的含有过渡金属的纳米金属氧化物是铁氧化物纳米粒子(FeOx，x为1～1.5之间)或铜氧化物纳米粒子(CuyO，y为1～2之间)。
5.权利要求1所述的抗癌复合物，其特征在于：所述的含有过渡金属的纳米金属过氧化物是CuO2。
6.权利要求1所述的抗癌复合物，其特征在于：所述的含有过渡金属的纳米金属硫化物是CuS。
7.权利要求1所述的抗癌复合物，其特征在于：所述的含有过渡金属的纳米金属材料是金纳米簇或纳米金铁合金AuFe。
8.制备权利要求1所述抗癌复合物的方法，包括以下步骤：
1)制备能够产生ROS的纳米材料，包括含有过渡金属的复合纳米材料、含有过渡金属的纳米金属氧化物、含有过渡金属的纳米金属过氧化物、含有过渡金属的纳米金属硫化物或含有过渡金属的纳米金属材料中的任意一种；将制备好的纳米材料分散到生理盐水中，控制其浓度为0.2～10mg/mL，得到液体A；
2)将两亲性连接分子溶于生理盐水，控制连接分子浓度为0.2～10mg/mL，得到溶液B；
3)将益生菌分散到生理盐水中，控制其浓度为1～100×106CFU/mL，得到溶液C；
4)将1)得到的溶液A和2)得到的溶液B等体积混合，然后在低温条件下搅拌2小时，离心、洗涤、重新分散到等体积的生理盐水中，控制其浓度为0.1～5mg/mL，得到连接分子修饰的纳米材料溶液D；
5)将4)得到的溶液D与3)得到的溶液C等体积混合，然后在常温下混合孵育5-30分钟，离心、洗涤，即得到益生菌与产生活性氧纳米材料的复合物，也就是所述的抗癌复合物。
9.权利要求1所述抗癌复合物在制备口服抗癌药物中的应用。
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