CN113893353B - 一种提高肠道益生菌在口服递送过程中存活率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高肠道益生菌在口服递送过程中存活率的方法，包括：使用含有过渡金属的疏水纳米材料，并利用过渡金属与肠道益生菌表面的糖和蛋白形成配位作用，进而通过自组装包裹肠道益生菌，阻隔消化液中分子量大且亲水的消化酶与肠道益生菌的接触。本发明还提供一种可抵抗消化酶的肠道益生菌，由肠道益生菌表面通过配位作用吸附含有过渡金属的疏水纳米材料构成，疏水纳米材料包裹益生菌形成疏水保护层。本发明还提供制备可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法。本发明可抵抗消化酶的肠道益生菌克服了传统口服益生菌的缺点，显著提升了对结肠炎的治疗能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高肠道益生菌在口服递送过程中的存活率的方法。
背景技术
炎症性肠病(IBD)每年影响着上百万人的健康，严重影响着患者的生活质量。IBD是一类肠道慢性炎症，具有反复发作的特点，主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)两种表型。北美和欧洲等发达地区IBD患病率较高，约为总人口的5‰；中国IBD患病率约为2.2‰，且有被低估的可能。
与IBD相关的直接成本和间接成本都很高。每年约有250万人因IBD就诊，直接产生的医疗费用超过50亿美元。而IBD带来的间接成本则更高。由于病程漫长且经常反复发作，IBD极易引起生活质量和工作效率下降、甚至抑郁，这些成本都难以用金钱来衡量，更会影响病人家属。有研究表明，IBD患者的抑郁焦虑患病率比其他慢性病患者更高，约有不到三分之一的IBD患者同时患有抑郁症和焦虑症。
目前，IBD的发病机制还尚未明确，但越来越多的研究表明，IBD的发病与肠道菌群失调、免疫应答紊乱、肠道屏障损伤等因素具有相关性。肠道菌群是人体重要组成部分，肠道微生物和肠道粘膜免疫之间的相互作用影响着免疫反应的启动和调节。肠道菌群的紊乱可能导致免疫反应过度或失调，从而造成肠道粘膜的损伤。随着高通量测序技术的普及和生物信息学分析手段的发展，越来越多的研究表明，炎症性肠病患者普遍存在肠道微生态系统的失调以及有益肠道菌群数量的降低。
双歧杆菌是革兰氏阳性、厌氧性和分支杆状细菌。双歧杆菌作为人类肠道菌群中的优势菌，它与宿主之间存在共生关系，对于维持正常肠道菌群和人体健康具有重要作用。双歧杆菌将糖发酵成乳酸，这有助于降低肠道的pH值。部分菌株具有修复氧化损伤的酶的同系物，例如NADH氧化酶和NADH过氧化物酶。同时部分菌株还含有逆转氧化损伤的蛋白质和脂质，如：硫醇过氧化物酶、烷基过氧化氢还原酶、肽甲硫氨酸亚砜还原酶等。因此，一些特定的双歧杆菌菌株可以作为益生菌，可用于某些肠道疾病的干预治疗。如《中国微生态调节剂临床应用专家共识(2020版)》指出：益生菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、酪酸梭菌等作为轻-中度IBD辅助治疗有助于维持缓解病情，且具有良好的安全性和耐受性。但双歧杆菌对热、水分和消化酶敏感，在口服过程中容易受到胃部消化酶的攻击，从而死亡或失活。
因此有必要研发一种提高肠道益生菌在口服递送过程中的存活率的方法，以发挥肠道益生菌经口服给药途径的肠道疾病的干预治疗功效。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高肠道益生菌在口服递送过程中的存活率的方法，可避免人体肠道益生菌被胃肠液中的消化酶攻击，降低益生菌在口服递送到肠道的过程中的死亡或失活率，从而增其强肠道定植能力，提升其保健和治疗疾病的作用。
本发明的另一个目的是提供一种可抵抗消化酶的肠道益生菌，在口服递送过程中可保持较高的存活率，可通过调节免疫响应和肠道菌群治疗IBD。
本发明的再一个目的是提供制备所述可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法，简单高效，并具有良好的普适性。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
首先，提供一种提高肠道益生菌在口服递送过程中存活率的方法，包括：使用疏水的纳米材料通过自组装包裹肠道益生菌，阻隔消化液中分子量大且亲水的消化酶与肠道益生菌的接触。
本发明优选的所述方法是使用含有过渡金属的疏水纳米材料，并利用所述的过渡金属与所述的肠道益生菌表面的糖和蛋白形成配位作用，进而通过自组装包裹肠道益生菌，阻隔消化液中分子量大且亲水的消化酶与肠道益生菌的接触。
本发明进一步优选的所述方法中，所述的含有过渡金属的疏水纳米材料是掺杂过渡金属元素和N元素或O元素的碳基纳米材料；最优选是含有过渡金属原子-N4或过渡金属原子-O、吡啶氮、吡咯氮和石墨烯结构的碳材料。
本发明更优选的所述方法中，所述的含有过渡金属的疏水纳米材料是金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质经高温煅烧得到的。所述的过渡金属元素可以选自铜、铁、锰、钴、锌、铈或金中的任意一种或两种以上的混合物；优选铜、铁、锌或金中的任意一种或两种以上的混合物；最优选铜、铁或金中的任意一种。所述的高温煅烧温度为800～1800℃。
本发明优选的所述方法中，所述的使用疏水的纳米材料通过自组装包裹肠道益生菌是通过将肠道益生菌与疏水的纳米材料在缓冲液中混合来实现，所述缓冲液中的肠道益生菌的浓度优选为0.5～50×106CFU/mL，所述缓冲液中的疏水的纳米材料的浓度为0.1～5mg/mL。
本发明所述的方法中，所述的肠道益生菌可以选自双歧杆菌、乳杆菌、丁酸梭菌或酵母菌；所述的双歧杆菌进一步可以选自长双歧杆菌、青春双歧杆菌或短双歧杆菌中的任意一种或两种以上的混合物。
在此基础上，本发明还提供一种可抵抗消化酶的肠道益生菌，它是由肠道益生菌表面通过配位作用吸附含有过渡金属的疏水纳米材料构成，所述的疏水纳米材料包裹益生菌，形成疏水保护层。
本发明优选的所述抗消化酶的肠道益生菌中，所述的肠道益生菌可以选自双歧杆菌、乳杆菌、丁酸梭菌或酵母菌；所述的双歧杆菌进一步可以选自长双歧杆菌、青春双歧杆菌或短双歧杆菌中的任意一种或两种以上的混合物。
本发明优选的所述抗消化酶的肠道益生菌中，所述的含有过渡金属的疏水纳米材料是掺杂过渡金属元素和N元素或O元素的碳基纳米材料；最优选是含有过渡金属原子-N4或过渡金属原子-O、吡啶氮、吡咯氮和石墨烯结构的碳材料。
本发明进一步优选的所述抗消化酶的肠道益生菌中，所述的含有过渡金属的疏水纳米材料是金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质经高温煅烧得到的。
本发明再进一步优选的所述抗消化酶的肠道益生菌中，所述的金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质，按重量百分比计，含有金属/有机框架化合物的主体材料94％～99％和过渡金属元素1％～6％。
本发明优选的所述抗消化酶的肠道益生菌中，所述的过渡金属元素可以选自铜、铁、锰、钴、锌、铈或金中的任意一种或两种以上的混合物；优选铜、铁、锌或金中的任意一种或两种以上的混合物；最优选铜、铁或金中的任意一种。
此外，本发明还提供一种制备可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法，包括以下步骤：
1)制备含有过渡金属元素的疏水纳米材料，并将所述疏水纳米材料分散至缓冲液制成溶液A；
2)培养肠道益生菌，离心收集并将其重新分散到缓冲液中制成溶液B；
3)将1)所得溶液A和2)所得溶液B混合震荡；离心收集肠道益生菌、洗涤，得到由疏水纳米材料保护的肠道益生菌，即所述的可抵抗消化酶的肠道益生菌。
本发明优选的制备可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法中，步骤1)所述的含有过渡金属元素的疏水纳米材料是掺杂过渡金属元素和N元素或O元素的碳基纳米材料；最优选是含有过渡金属原子-N4或过渡金属原子-O、吡啶氮、吡咯氮和石墨烯结构的碳材料。
本发明优选的制备可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法中，所述的过渡金属元素可以选自铜、铁、锰、钴、锌、铈或金中的任意一种或两种以上的混合物；优选铜、铁、锌或金中的任意一种或两种以上的混合物；最优选铜、铁或金中的任意一种。
本发明更优选制备可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法中，步骤1)所述的含有过渡金属的疏水纳米材料是金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质经高温煅烧得到的。所述的前体物质由金属/有机框架化合物中掺杂过渡金属纳米颗粒得到，过渡金属的掺杂量会影响到最终过渡金属纳米颗粒的组成结构、配位方式及形貌尺寸，为了更好地与肠道益生菌表面形成配位作用并完成自组装，本发明优选的前体物质中，按重量百分比计，金属/有机框架化合物占94％～99％，过渡金属元素占1％～6％。所述的高温煅烧温度为800～1800℃。
为了更有利于疏水纳米材料与肠道益生菌之间形成配位作用，本发明优选的制备可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法中，步骤3)将1)所得溶液A和2)所得溶液B混合时，控制混合后的溶液中肠道益生菌的浓度为0.5～50×106CFU/mL，疏水的纳米材料的浓度为0.1～5mg/mL。
本发明所述的制备可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法中，利用了细菌表面的糖和蛋白与疏水纳米材料上的过渡金属形成配位作用，通过自组装将疏水纳米材料包裹到细菌表面；得到一种受纳米材料保护的细菌，其大体结构及形成过程如图1所示。由于包裹在细菌表面的纳米材料结构致密且疏水，分子量大且亲水的消化酶无法接触到细菌，阻隔了消化酶对细菌的攻击，从而可在消化液中保护细菌，避免细菌的死亡和失活；到达肠道后，疏水性的小分子氨基酸和脂肪酸可透过疏水纳米材料，与细菌表面的糖和蛋白竞争，结合到过渡金属上，从而破坏疏水纳米材料与细菌的配位作用，导致疏水纳米材料从细菌表面脱落。基于上述原理，包括双歧杆菌在内的肠道益生菌经口服递送后在肠道中仍然保持了原有的定植能力和功能，可通过调节免疫响应和肠道菌群治疗IBD。
与现有技术相比，本发明工艺过程简单，制备速度快，可控性好；所采用的纳米材料结构简单、制备高效，可方便调节其尺寸和阻隔消化酶的性能，具有优越的生物相容性；该方法不依赖于细菌表面的特殊结构，具有良好的普适性；可方便地调控纳米材料在细菌表面的包裹量，并适用于多种益生菌；用于保护益生菌的纳米材料对人体无毒副作用，不影响双歧杆菌在肠道中的定植和功能。本发明使用纳米材料保护肠道益生菌的技术克服了传统口服双歧杆菌的缺点，显著提升了对结肠炎的治疗能力。本发明方法所获得的纳米材料保护的双歧杆菌在小鼠和比格犬的体内实验中表现出优异的生物相容性和治疗IBD的能力，具有很强的临床转化潜力。
附图说明
图1是本发明制备的可抵抗消化酶的肠道益生菌的结构及形成过程示意图。
图2是实施例1中的保护性纳米材料的透射电镜照片。
图3是实施例1中的双歧杆菌被纳米材料保护前后的扫描电镜照片，其中(a)是原始的双歧杆菌，(b)是纳米材料保护的双歧杆菌。
图4是实施例1所得的纳米材料保护的双歧杆菌在模拟胃液中处理1小时后的生存率。
图5是实施例1所得的纳米材料保护的双歧杆菌治疗小鼠体内DSS引起的UC的效果。
图6是实施例1所得的纳米材料保护的双歧杆菌治疗比格犬体内乙酸引起的UC的效果。
图7是实施例1所得的纳米材料保护的双歧杆菌治疗小鼠体内CD的效果。
具体实施方式
本发明提供一种提高肠道益生菌在口服递送过程中存活率的方法，包括：使用疏水的纳米材料通过自组装包裹肠道益生菌，阻隔消化液中分子量大且亲水的消化酶与肠道益生菌的接触。优选的提高肠道益生菌在口服递送过程中存活率的方法是使用含有过渡金属的疏水纳米材料，并利用所述的过渡金属与所述的肠道益生菌表面的糖和蛋白形成配位作用，进而通过自组装包裹肠道益生菌，阻隔消化液中分子量大且亲水的消化酶与肠道益生菌的接触。
本发明还提供一种可抵抗消化酶的肠道益生菌，它是由肠道益生菌表面通过配位作用吸附含有过渡金属的疏水纳米材料构成，所述的疏水纳米材料包裹益生菌，形成疏水保护层。
本发明中所述的肠道益生菌可以选自双歧杆菌、乳杆菌、丁酸梭菌、或酵母菌；所述的双歧杆菌进一步可以选自长双歧杆菌、青春双歧杆菌或短双歧杆菌中的任意一种或两种以上的混合物。
本发明中所述的含有过渡金属的疏水纳米材料是掺杂过渡金属元素和N元素或O元素的碳基纳米材料；最优选是含有过渡金属原子-N4或过渡金属原子-O、吡啶氮、吡咯氮和石墨烯结构的碳材料。
本发明中所述的过渡金属元素可以选自铜、铁、锰、钴、锌、铈或金中的任意一种或两种以上的混合物；优选铜、铁、锌或金中的任意一种或两种以上的混合物；最优选铜、铁或金中的任意一种。
本发明还提供制备所述可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法，包括：制备含有过渡金属元素的疏水纳米材料，并将所述疏水纳米材料分散至缓冲液制成溶液A；培养肠道益生菌，离心收集并将其重新分散到缓冲液中制成溶液B；将所得溶液A和所得溶液B混合，震荡5～15min；离心收集肠道益生菌、洗涤，得到由疏水纳米材料保护的肠道益生菌，即所述的可抵抗消化酶的肠道益生菌。
以双歧杆菌为例，上述制备方法具体包括以下步骤：
1)制备含有过渡金属元素的金属/有机框架前体物质(MOF/Metal)，按重量百分比计，其中金属/有机框架化合物含量为94～99％，过渡金属元素含量为1～6％；
制备MOF/Metal前体的方法总体可以按照在金属/有机框架化合物中掺杂过渡金属纳米颗粒的方式进行。所述的金属/有机框架化合物可以选自ZIF-7、ZIF-8、ZIF-67、ZIF-68、ZIF-90、MIL-100、MIL-101、UiO-66、UiO-67、UiO-68、PCN-128、PCN-224、PCN-333、HKUST-1或IRMOF-74中的任意一种，所述的过渡金属种类可以选自铜、铁、锰、钴、锌、铈或金中的任意一种或两种以上的混合物。
具体步骤优选为：50mL醋酸锌的DMF溶液(10mM)和50mL咪唑-2-甲醛的DMF溶液(20mM)，在30℃，以30mL/h的速度，同时逐滴加入到50mL咪唑-2-甲醛(20mM)和过渡金属盐(2mM-10mM)的DMF溶液中，反应5min。12000rpm离心10min，甲醇洗涤三次，即可得到MOF/Metal前体；
2)取500mg步骤1)所得的MOF/Metal前体物质高温煅烧3小时，温度在800～1800℃之间，得到保护性纳米材料；所得的保护性纳米材料分散到PBS缓冲溶液中，控制其浓度为0.2～10mg/mL，得到纳米材料溶液；
3)培养双歧杆菌，离心收集并将其重新分散到PBS缓冲液中，控制其浓度为1～100×106CFU/mL，得到双歧杆菌溶液；
4)将步骤2)的纳米材料溶液和步骤3)的双歧杆菌溶液按1:1的体积比混合，震荡10min；离心收集反应后的双歧杆菌，洗涤，得到纳米材料保护的双歧杆菌。
以下结合具体的实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1.制备纳米材料保护的双歧杆菌
1)50mL醋酸锌的DMF溶液(10mM)和50mL咪唑-2-甲醛的DMF溶液(20mM)，在30℃，以30mL/h的速度，同时逐滴加入到50mL咪唑-2-甲醛(20mM)和乙酰丙酮铜(4mM)的DMF溶液中，反应5min。12000rpm离心10min,甲醇洗涤三次，即可得到MOF/Cu前体。
2)所得的MOF/Cu前体物质在N2保护下，于800℃，高温煅烧3小时得到保护性纳米材料，透射电镜观察到所述保护性纳米材料微观形貌如图2所示。所得的保护性纳米材料分散到PBS缓冲溶液中，控制其浓度为0.2mg/mL，得到纳米材料溶液；
3)培养双歧杆菌，离心收集并将其重新分散到PBS缓冲液中，控制其浓度为1×106CFU/mL，得到双歧杆菌溶液；
4)将所得的0.2mg/mL保护性纳米材料与1×106CFU/mL双歧杆菌溶液等体积混合，震荡10min完成配位及自组装；离心收集反应后的双歧杆菌，洗涤，得到纳米材料保护的双歧杆菌，即可抵抗消化酶的双歧杆菌。用扫描电镜观察反应前后的双歧杆菌微观形貌，观察结果如图3所示，其中(a)是原始的双歧杆菌，(b)是纳米材料保护的双歧杆菌。由(b)可见，制得的产物是由肠道益生菌表面包裹了疏水纳米材料构成，所述的疏水纳米材料在益生菌表面形成疏水保护层。
本实施例制得的纳米材料保护的双歧杆菌可以重新分散在缓冲液中制备成不同浓度的液体口服药物用于人体或动物体的IBD治疗。
通过体外实验检测本实施例制备的可抵抗消化酶的双歧杆菌在模拟胃液中的生存率，结果如图4所示，同样是在模拟胃液中处理1小时后，原始双歧杆菌生存率仅为约18％(图中左柱)，而纳米材料保护的双歧杆菌可达约88％(图中右柱)，可见双歧杆菌在疏水纳米材料的保护下可有效抵抗胃液中消化酶的攻击，长时间保持高存活率和高活性，完全可以用于口服途径给药。
实施例2.制备纳米材料保护的双歧杆菌
整体方案与实施例1相似，区别在于，步骤1)具体是：50mL醋酸锌的DMF溶液(10mM)和50mL咪唑-2-甲醛的DMF溶液(20mM)，在30℃，以30mL/h的速度，同时逐滴加入到50mL咪唑-2-甲醛(20mM)和乙酰丙酮铜(4mM)的DMF溶液中，反应5min。12000rpm离心10min,甲醇洗涤三次，即可得到MOF/Cu前体。
实施例3.制备纳米材料保护的双歧杆菌
整体方案与实施例1相似，区别在于：步骤2)中，高温煅烧条件为1500℃煅烧3小时。
实施例4.制备纳米材料保护的双歧杆菌
整体方案与实施例1相似，区别在于：步骤3)中，控制双歧杆菌溶液的浓度为100×106CFU/mL。
实施例5.制备纳米材料保护的双歧杆菌
整体方案与实施例1相似，区别在于：步骤2)中，控制保护性纳米材料的浓度为10mg/mL。
实施例6.制备纳米材料保护的双歧杆菌
整体方案与实施例1相似，区别在于：步骤1)中，将乙酰丙酮铜替换为同等摩尔量的氯化锰，得到MOF/Mn前体。
实施例7.制备纳米材料保护的双歧杆菌
整体方案与同实施例1相似，区别在于，步骤1)具体是：50mL醋酸锌的DMF溶液(10mM)和50mL咪唑-2-甲醛的DMF溶液(20mM)，在30℃，以30mL/h的速度，同时逐滴加入到50mL咪唑-2-甲醛(20mM)和乙酰丙酮铂(4mM)的DMF溶液中，反应5min。12000rpm离心10min，甲醇洗涤三次，即可得到MOF/Pt前体。
应用例1.小鼠UC模型实验
以C57/L小鼠为实验动物建立UC模型，以按实施例1方法制备的可抵抗消化酶的双歧杆菌作为治疗药物(即将实施例1所得纳米材料保护的双歧杆菌重新分散在缓冲液中，使保护性纳米材料浓度为200μg/mL；双歧杆菌浓度为1×106CFU/mL)，观察口服给药途径的治疗效果。具体实验方案如下：
C57/L小鼠饮用3％DSS，3-5天可造出UC模型，出现血便，体重明显下降。得到的UC动物模型随机分为3组(实验组、对照组和空白组)，每组5只小鼠。随后连续给药5天，对照组每只老鼠灌胃100μL双歧杆菌(1×106CFU/mL)，实验组每只老鼠灌胃100μL上述治疗药物，空白组每只老鼠灌胃100μL PBS。
连续给药5天后处死，取出小鼠的结肠组织，并测量各组小鼠结肠平均长度。
结果显示如图5所示，与健康组小鼠相比，UC模型中，未给药的空白组平均结肠长度仅为健康小鼠的约80％，证明了模型的有效建立；与空白组相比，给药双歧杆菌的对照组平均结肠长度的增加非常有限，大约不足4％，说明仅给药未经保护的双歧杆菌无法保证其以足够的活性定植在肠道内发挥作用；与空白组和对照组相比，给药经纳米材料保护的双歧杆菌的实验组的平均结肠长度得到了显著提高，相对空白组和对照组分别提高了大约20％和15％，达到了健康小鼠平均结肠长度的95％以上，说明实施例1的纳米材料保护的双歧杆菌能够在纳米材料的保护下避免消化酶的攻击，避免了进入肠道前的失活，可以定植于肠道充分发挥对DSS引起的UC的治疗效果。
应用例2.比格犬UC模型实验
以比格犬为实验动物建立UC模型，以按实施例1方法制备的可抵抗消化酶的双歧杆菌作为治疗药物(即将实施例1所得纳米材料保护的双歧杆菌重新分散在缓冲液中，使保护性纳米材料浓度为500μg/mL；双歧杆菌浓度为2.5×106CFU/mL)，观察口服给药途径的治疗效果。具体实验方案如下：
比格犬用7％乙酸，10mL/kg灌肠1min，第二天结肠镜观察，出现出血溃疡，表示成功造出UC模型。将UC模型随机分为UC给药组和UC不给药组，同时以相同条件饲养的健康犬为空白对照组，每组3只犬。随后连续给药6天，UC给药组每只比格犬灌胃15mL上述治疗药物；UC不给药组每只比格犬灌胃15mL PBS；空白对照组(健康组)每只比格犬灌胃15mL PBS。连续给药6天，且在造模后第1天和给药2、7天后，对每只比格犬进行灌肠，排空粪便，并进行麻醉，做肠镜分析，观察各组比格犬的结肠组织，是否光滑、出血、溃疡和结痂。
结果如图6所示，与空白对照组(健康组)的健康犬相比，造模后第1天，UC模型各组的比格犬的结肠出血，发红，证明了模型的有效建立。灌胃2天后，与UC不给药组出现明显的溃疡相比，UC给药组经实施例1制备的纳米材料保护的双歧杆菌治疗出现明显的伤口愈合，灌胃7天后，UC不给药组仍然存在症状，而UC给药组已经基本恢复到和健康组一致的水平。说明实施例1药物中的双歧杆菌能够在纳米材料的保护下避免消化酶的攻击，避免了进入肠道前的失活，可以定植于肠道充分发挥对乙酸引起的UC的治疗效果。
应用例3.小鼠CD模型实验
以BALB/C小鼠为实验动物建立CD模型，以按实施例1方法制备的可抵抗消化酶的双歧杆菌作为治疗药物(即将实施例1所得纳米材料保护的双歧杆菌重新分散在缓冲液中，使保护性纳米材料浓度为200μg/mL；双歧杆菌浓度为1×106CFU/mL)，观察口服给药途径的治疗效果。具体实验方案如下：
先用1％TNBS在BALB/C小鼠背部致敏7天，然后给小鼠结肠部位灌肠2％TNBS，倒置30s，立刻出现血便，体重明显下降，CD模型成功。得到的CD动物模型随机分为3组(实验组、对照组和空白组)，每组5只小鼠。随后连续给药4天，对照组每只老鼠灌胃100μL双歧杆菌(1×106CFU/mL)，实验组每只老鼠灌胃100μL上述治疗药物，空白组每只老鼠灌胃100μL PBS。
连续给药4天后处死，取出小鼠的结肠组织，并测量各组小鼠结肠平均长度。
结果如图7所示，与健康小鼠相比，CD模型中，未给药的空白组平均结肠长度仅为健康小鼠的约90％，证明了模型的有效建立；与空白组相比，给药双歧杆菌的对照组平均结肠长度的增加大约不足5％，说明仅给药未经保护的双歧杆菌无法保证其以足够的活性定植在肠道内发挥作用；与空白组和对照组相比，给药经纳米材料保护的双歧杆菌的实验组的平均结肠长度得到了显著提高，相对空白组和对照组分别提高了大约9％和4％，达到了健康小鼠平均结肠长度的98％以上，说明实施例1的纳米材料保护的双歧杆菌能够在纳米材料的保护下避免消化酶的攻击，避免了进入肠道前的失活，可以定植于肠道充分发挥对TNBS引起的CD的治疗效果。
Claims (10)
1.一种提高肠道益生菌在口服递送过程中存活率的方法，包括：使用含有过渡金属的疏水纳米材料，并利用所述的过渡金属与所述的肠道益生菌表面的糖和蛋白形成配位作用，进而通过自组装包裹肠道益生菌，阻隔消化液中分子量大且亲水的消化酶与肠道益生菌的接触；所述的含有过渡金属的疏水纳米材料是金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质经高温煅烧得到的，所述的过渡金属选自铜、铁、锰、钴、锌、铈或金中的任意一种或两种以上的混合物；
所述的含有过渡金属的疏水纳米材料通过以下方法制备：
50 mL浓度为10 mM的醋酸锌的DMF溶液和50 mL浓度为20 mM的咪唑-2-甲醛的DMF溶液，在30℃，以30 mL/h的速度，同时逐滴加入到50 mL浓度为20 mM的咪唑-2-甲醛和2 mM-10 mM的过渡金属盐的DMF溶液中，反应5 min；12000 rpm离心10 min，甲醇洗涤三次，即可得到MOF/Metal前体；取500 mg所得的MOF/Metal前体物质高温煅烧3小时，温度在800~1800oC之间，得到保护性纳米材料；所得的保护性纳米材料分散到PBS缓冲溶液中，控制其浓度为0.2~10 mg/mL，得到纳米材料溶液；
所述的自组装包裹肠道益生菌通过以下方法实现：
培养肠道益生菌，离心收集并将其重新分散到缓冲液中制成溶液B；将所述的纳米材料溶液和所述的溶液B混合震荡5~15min，控制混合后的溶液中肠道益生菌的浓度为0.5~50×106 CFU/mL，疏水的纳米材料的浓度为0.1~5 mg/mL；离心收集肠道益生菌、洗涤，得到由疏水纳米材料保护的肠道益生菌。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的过渡金属是铜、铁、锌或金中的任意一种或两种以上的混合物。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的过渡金属元素是铜、铁或金中的任意一种。
4.一种可抵抗消化酶的肠道益生菌，它是由肠道益生菌表面通过配位作用吸附含有过渡金属的疏水纳米材料构成，所述的疏水纳米材料包裹益生菌，形成疏水保护层；所述的肠道益生菌选自双歧杆菌、乳杆菌、丁酸梭菌或酵母菌中的任意一种或两种以上的混合物；所述的含有过渡金属的疏水纳米材料是金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质经高温煅烧得到的，所述的过渡金属选自铜、铁、锰、钴、锌、铈或金中的任意一种或两种以上的混合物；
所述的金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质通过以下方法制备：50 mL浓度为10 mM的醋酸锌的DMF溶液和50 mL浓度为20 mM的咪唑-2-甲醛的DMF溶液，在30℃，以30mL/h的速度，同时逐滴加入到50 mL浓度为20 mM的咪唑-2-甲醛和2 mM-10 mM的过渡金属盐的DMF溶液中，反应5 min；12000 rpm离心10 min，甲醇洗涤三次，即可得到MOF/Metal前体；取500 mg所得的MOF/Metal前体物质高温煅烧3小时，温度在800~1800oC之间，得到保护性纳米材料；所得的保护性纳米材料分散到PBS缓冲溶液中，控制其浓度为0.2~10 mg/mL，得到纳米材料溶液；
所述的疏水纳米材料包裹益生菌通过以下方法实现：培养肠道益生菌，离心收集并将其重新分散到缓冲液中制成溶液B；将所述的纳米材料溶液和所述的溶液B混合震荡5~15min，控制混合后的溶液中肠道益生菌的浓度为0.5~50×106 CFU/mL，疏水的纳米材料的浓度为0.1~5 mg/mL；离心收集肠道益生菌、洗涤，得到由疏水纳米材料保护的肠道益生菌，即所述的可抵抗消化酶的肠道益生菌。
5.权利要求4所述的肠道益生菌，其特征在于：所述的双歧杆菌是长双歧杆菌、青春双歧杆菌或短双歧杆菌中的任意一种或两种以上的混合物。
6.权利要求4所述的肠道益生菌，其特征在于：所述的过渡金属是铜、铁、锌或金中的任意一种或两种以上的混合物。
7.权利要求4所述的肠道益生菌，其特征在于：所述的过渡金属是铜、铁或金中的任意一种。
8.一种制备可抵抗消化酶的肠道益生菌的方法，包括以下步骤：
1）制备含有过渡金属元素的疏水纳米材料，并将所述疏水纳米材料分散至缓冲液制成溶液A；所述的含有过渡金属元素的疏水纳米材料是金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质经高温煅烧得到的，所述的过渡金属选自铜、铁、锰、钴、锌、铈或金中的任意一种或两种以上的混合物；所述的金属/有机框架化合物包裹过渡金属的前体物质通过以下方法制备：50 mL浓度为10 mM的醋酸锌的DMF溶液和50 mL浓度为20 mM的咪唑-2-甲醛的DMF溶液，在30℃，以30 mL/h的速度，同时逐滴加入到50 mL浓度为20 mM的咪唑-2-甲醛和2mM-10 mM的过渡金属盐的DMF溶液中，反应5 min；12000 rpm离心10 min，甲醇洗涤三次，即可得到MOF/Metal前体；取500 mg所得的MOF/Metal前体物质高温煅烧3小时，温度在800~1800oC之间，得到保护性纳米材料；所得的保护性纳米材料分散到PBS缓冲溶液中，控制其浓度为0.2~10 mg/mL，得到纳米材料溶液；
2）培养肠道益生菌，离心收集并将其重新分散到缓冲液中制成溶液B；
3）将1）所得溶液A和2）所得溶液B混合震荡5~15min，控制混合后的溶液中肠道益生菌的浓度为0.5~50×106 CFU/mL，疏水的纳米材料的浓度为0.1~5 mg/mL；离心收集肠道益生菌、洗涤，得到由疏水纳米材料保护的肠道益生菌，即所述的可抵抗消化酶的肠道益生菌。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的过渡金属是铜、铁、锌或金中的任意一种或两种以上的混合物。
10.权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的过渡金属是铜、铁或金中的任意一种。
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