CN116217946A - 一种细胞外囊泡富集材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞外囊泡富集材料领域，具体涉及一种细胞外囊泡富集材料及其制备方法和应用。在胺化聚丙烯酸微球材料基础上进行苯硼酸功能化修饰，即可制备得到苯硼酸修饰后的聚丙烯酸微球材料，再通过与DSPE‑PEG‑多巴胺在中性条件下通过苯硼酸‑邻二羟基的络合作用，即制备完成。该制备方法快速便捷、安全无毒，制备的DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料能够从细胞培液中高效快速地富集EVs，并且改变环境的pH，实现EVs的无损释放，用于进行下游的生物功能分析。同时可以结合分子生物学实验等技术对EVs内蛋白质或核酸进行提取和分析，这为EVs的下游功能分析提供可靠的方法，有利于生物样品中EVs的生物学功能的深入研究。
Description
技术领域
本发明属于细胞外囊泡富集材料领域，具体涉及一种细胞外囊泡富集材料及其制备方法和应用。
背景技术
硼酸与顺式邻二羟基分子之间具有选择性识别作用，当顺势邻二羟基物质所处的pH环境较高时(一般大于7)，硼酸配基化合物中的硼原子会和所处环境中的氢氧根发生络合作用，从而使硼原子的杂化状态由原来平面型的sp2状态转化为四面体的sp3状态，此时转化后的四面体型的硼酸化负离子就可以和顺式邻二羟基物质中相邻的两个羟基发生共价反应从而生成五元环或六元环的环状酯。但当所处环境的pH变为酸性时，硼酸配基化合物中的硼原子又会从四面体的sp3状态转变为原来的平面型的sp2杂化状态。这样就能促使生成的五元环或者六元环的环状酯可以顺利发生解离，释放出顺式邻二羟基分子。因此，可以通过改变环境的pH值用于控制硼酸-邻二羟基的结合。
细胞外囊泡(EVs)由不同种类的细胞(如肿瘤细胞、免疫细胞)分泌，其尺寸在30-1000nm，并且携带生物信息分子(如蛋白质、核酸、脂质体等)参与细胞间的信息交流。EVs与肿瘤的大小、淋巴结转移数量以及肿瘤细胞的类型密切相关。因此，肿瘤细胞来源的EVs是一种理想的肿瘤早期诊断的标志物，在肿瘤液体活检中受到了广泛关注。目前，从生物样本中分离出小细胞外囊泡大多基于超速离心法、免疫亲和、聚合物共沉淀、尺寸排阻及微流控等原理的提取方法。但是，以上方法都有不可避免的局限性，如耗时低效、步骤繁琐、纯度低以及易造成EVs的物理性结构损伤等。基于材料的捕获方法可以快速高效地捕获生物样本中的EVs，因此受到了越来越多的关注。二硬酯酰基磷脂乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)是一类PEG化磷脂，具有良好的生物相容性，常被用作纳米制剂载体材料。而DSPE分子具有亲脂性的脂肪酸尾，与细胞或EVs的磷脂膜具有较强的作用力，可被作为脂探针，用于体液中EVs的分离，将其通过化学反应键合到材料基质上，可以实现对EVs的高效富集。
发明内容
现有技术中存在的技术问题是具有不可避免的局限性，如耗时低效、步骤繁琐、纯度低以及易造成EVs的物理性结构损伤等。需要找到合适的替代方案来提高效果。
为了进一步提高聚合物材料对细胞外囊泡(EVs)的富集能力，改进材料的特性，本发明提供一种细胞外囊泡富集材料的制备方法(DSPE通过苯硼酸与邻二羟基的作用与聚丙烯酸微球相连)，包括如下步骤：
S11：制备DSPE-PEG-多巴胺和苯硼酸修饰聚丙烯酸微球；所述DSPE-PEG-多巴胺由反应性DSPE-PEG和多巴胺反应得到；所述苯硼酸修饰聚丙烯酸微球由胺化聚丙烯酸微球、对醛基苯硼酸和腈基硼氢化钠反应得到；
所述胺化聚丙烯酸微球购买自西安蓝晓科新材料股份有限公司。
S12：将所述DSPE-PEG-多巴胺、苯硼酸修饰聚丙烯酸微球、乙醇水溶液、Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)混合后反应，得到所述细胞外囊泡富集材料。
上述制备方法分三个过程进行，一个是合成DSPE-PEG-多巴胺的过程，然后是对合成苯硼酸修饰聚丙烯酸微球过程，最后是通过苯硼酸与邻二羟基的作用，最终合成DSPE聚丙烯酸微球。苯硼酸修饰聚丙烯酸微球的合成是以胺基化聚丙烯酸微球和对醛基苯硼酸为原理，室温下，在甲醇溶剂中氨基与醛基发生缩合反应形成碳氮双键，再通过氰基硼氢化钠还原，增加修饰官能团的稳定性；通过DSPE-PEG-COOH的羧基与多巴胺中的氨基发生缩合酰化反应，制备末端为多巴胺分子的DSPE-PEG-多巴胺单体；最后在生理条件下(PBS溶液中)，基于苯硼酸修饰聚丙烯酸微球中的苯硼酸官能团与DSPE-PEG-多巴胺中的邻二羟基的选择性识别作用(络合作用)，最终将DSPE修饰在聚丙烯酸微球上。
优选的，所述步骤S11中，反应的温度均为室温。
优选的，所述步骤S11中，反应性DSPE-PEG为DSPE-PEG-COOH。
优选的，所述步骤S11中，反应性DSPE-PEG和多巴胺的反应时间为4-8h。
优选的，所述步骤S11中，反应性DSPE-PEG和多巴胺反应后进行透析和冷冻干燥。
优选的，所述步骤S11中，反应性DSPE-PEG和多巴胺的质量比为4-6：1。
优选的，所述步骤S11中，胺化聚丙烯酸微球、对醛基苯硼酸和腈基硼氢化钠的反应时间为48-72h。
优选的，所述步骤S11中，胺化聚丙烯酸微球、对醛基苯硼酸和腈基硼氢化钠的质量比为4-6：7：6。
优选的，所述步骤S11中，胺化聚丙烯酸微球、对醛基苯硼酸和腈基硼氢化钠反应后离心处理。
进一步地，所述离心处理的转速为3000rpm/min，时间为10min。
优选的，所述步骤S12中，乙醇水溶液的浓度为20-40wt％。
优选的，所述步骤S12中，DSPE-PEG-多巴胺、苯硼酸修饰聚丙烯酸微球、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的质量比为1：5-15：5-15：20。
优选的，所述步骤S12中，反应的时间为5-7h。
制备得到的细胞外囊泡富集材料(DSPE修饰聚丙烯酸微球材料)利用苯硼酸官能团与DSPE-PEG-多巴胺中的邻二羟基的选择性识别作用，在其表面修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)用于捕获生物样本中(细胞培养液、尿液、血浆、唾液以及脑脊液等)的细胞外囊泡，并且可以通过控制溶液pH(偏酸性)的方法实现细胞外囊泡的无损伤释放，可以将其用于下游的功能分析中。所述的制备方法快速便捷、安全无毒，且所制备的DSPE修饰聚丙烯酸微球材料能够从细胞培液中高效快速地富集细胞外囊泡。此外，结合分子生物学实验等技术对EVs内蛋白质进行提取和分析，同时利用在弱酸下使材料解体的方式实现材料与EVs的快速分离，这为EVs的下游功能分析提供了可靠的方法，有利于生物样品中EVs的生物学功能的深入研究。
本发明还提供一种上述制备方法制备得到的细胞外囊泡富集材料。
本发明还提供上述细胞外囊泡富集材料在富集细胞外囊泡的应用，包括如下步骤：
S21：将生物样本、PBS溶液、壬基酚聚氧乙烯醚和曲拉通X-100混合，得到混合溶液；
S22：将所述混合溶液孵育后除杂，完成对细胞外囊泡的富集；
S23：调节缓冲溶液pH值，完成对细胞外囊泡的无损释放。
优选的，所述生物样本为细胞培液、尿液、血浆、唾液和脑脊液。
优选的，所述步骤S22中，孵育的温度为室温，孵育的时间为0.5-1.5h。
在聚丙烯酸微球为基础上设计合成一种表面带有苯硼酸官能团的材料，并利用其表面活性官能团与邻二羟基(多巴胺)的特异性识别作用实现DSPE修饰，所制备的DSPE修饰的聚丙烯酸微球材料能够从细胞培液等生物样本中快速高效地富集EVs。结合分子生物学实验对EVs内含核酸及蛋白质进行提取和分析，同时以弱酸条件下使苯硼酸与邻二羟基分离的方式获得游离的EVs。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
1、本方法所制备的DSPE修饰聚丙烯酸微球具有良好的物理和化学稳定性，能够长期分散在PBS中存于4℃。DSPE修饰聚丙烯酸微球对EVs的富集原理，是基于DSPE脂链尾嵌插入EVs的磷脂双分子膜中以非共价键形式来实现的。
2、本方法所制备材料可以在常温下高效富集细胞培液中的EVs。0.1mgDSPE修饰聚丙烯酸微球材料能够富集200μL细胞培液里的EVs，并在30min内实现对EVs的富集。
3、本方法的合成及修饰过程简单易操作，且反应过程具有条件温和和重现性好等优点。
附图说明
图1为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料的扫描电镜图。
图2为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球富集、洗脱后EVs的透射电镜图。
图3为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料所富集EVs促进脐静脉内皮细胞迁移的结果示意图。
图4为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料富集到EVs的LC-MS/MS的GO分析(Biological Process)结果。
图5为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料所富集EVs促进脐静脉内皮细胞迁移的结果数据图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1)向1.5mL离心管中加入10mgDSPE-PEG-COOH；
2)向步骤1)的反应容器中加入1mL含2mg多巴胺的甲醇溶液；
3)将上述反应体系置于室温，在振荡器上反应4h后，转移至1500Da透析膜中透析过夜；
4)将透析过的溶液冻干，得到DSPE-PEG-多巴胺；
5)向50mL的圆底烧瓶加入0.5g胺化聚丙烯酸微球；
6)向步骤5)的反应容器中加入30mL甲醇，超声分散；
7)向步骤6)的反应容器中依次加入0.7g对醛基苯硼酸和0.6g腈基硼氢化钠；
8)将步骤7)的反应容器放在室温下，反应72小时；
9)分次取步骤8)中的反应产物转移至离心管中，以3000rpm/min的转速离心10min后弃去上清，收集得到苯硼酸修饰的聚丙烯酸微球；
10)取5mgDSPE-PEG-多巴胺和50mg苯硼酸修饰的聚丙烯酸微球，加入到1.5mL离心管中；
11)向步骤10)的反应容器中加入1mL30％乙醇溶液并超声使其溶解；
12)向步骤11)的反应容器中加入50mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和100mg的碳二亚胺(EDC)；
13)向步骤12)的反应容器中加入4mLTris-HCl缓冲液(pH＝6.5)，匀速混悬下反应6h；
14)分次取反应产物转移至离心管中，离心后收集白色材料；
15)用PBS缓冲液将步骤14)中得到的材料清洗2遍后干燥，即可得均匀分散的DSPE功能化聚丙烯酸微球材料。
实施例2
1)向1.5mL离心管中加入8mgDSPE-PEG-COOH；
2)向步骤1)的反应容器中加入1mL含2mg多巴胺的甲醇溶液；
3)将上述反应体系置于室温，在振荡器上反应4h后，转移至1500Da透析膜中透析过夜；
4)将透析过的溶液冻干，得到DSPE-PEG-多巴胺；
5)向50mL的圆底烧瓶加入0.4g胺化聚丙烯酸微球；
6)向步骤5)的反应容器中加入30mL甲醇，超声分散；
7)向步骤6)的反应容器中依次加入0.7g对醛基苯硼酸和0.6g腈基硼氢化钠；
8)将步骤7)的反应容器放在室温下，反应48小时；
9)分次取步骤8)中的反应产物转移至离心管中，以3000rpm/min的转速离心10min后弃去上清，收集得到苯硼酸修饰的聚丙烯酸微球；
10)取5mgDSPE-PEG-多巴胺和25mg苯硼酸修饰的聚丙烯酸微球，加入到1.5mL离心管中；
11)向步骤10)的反应容器中加入1mL20wt％乙醇溶液并超声使其溶解；
12)向步骤11)的反应容器中加入25mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和100mg的碳二亚胺(EDC)；
13)向步骤12)的反应容器中加入4mLTris-HCl缓冲液(pH＝6.5)，匀速混悬下反应5h；
14)分次取反应产物转移至离心管中，离心后收集白色材料；
15)用PBS缓冲液将步骤14)中得到的材料清洗2遍后干燥，即可得均匀分散的DSPE功能化聚丙烯酸微球材料。
实施例3
1)向1.5mL离心管中加入12mgDSPE-PEG-COOH；
2)向步骤1)的反应容器中加入1mL含2mg多巴胺的甲醇溶液；
3)将上述反应体系置于室温，在振荡器上反应8h后，转移至1500Da透析膜中透析过夜；
4)将透析过的溶液冻干，得到DSPE-PEG-多巴胺；
5)向50mL的圆底烧瓶加入0.6g胺化聚丙烯酸微球；
6)向步骤5)的反应容器中加入30mL甲醇，超声分散；
7)向步骤6)的反应容器中依次加入0.7g对醛基苯硼酸和0.6g腈基硼氢化钠；
8)将步骤7)的反应容器放在室温下，反应72小时；
9)分次取步骤8)中的反应产物转移至离心管中，以3000rpm/min的转速离心10min后弃去上清，收集得到苯硼酸修饰的聚丙烯酸微球；
10)取5mgDSPE-PEG-多巴胺和75mg苯硼酸修饰的聚丙烯酸微球，加入到1.5mL离心管中；
11)向步骤10)的反应容器中加入1mL40wt％乙醇溶液并超声使其溶解；
12)向步骤11)的反应容器中加入75mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和100mg的碳二亚胺(EDC)；
13)向步骤12)的反应容器中加入4mLTris-HCl缓冲液(pH＝6.5)，匀速混悬下反应7h；
14)分次取反应产物转移至离心管中，离心后收集白色材料；
15)用PBS缓冲液将步骤14)中得到的材料清洗2遍后干燥，即可得均匀分散的DSPE功能化聚丙烯酸微球材料。
实施例4
1)分别取200μLSW480和SW620细胞培养液，加入到1.5mL离心管中；
2)向步骤1)中反应容器加入800μLPBS和10μL1％壬基酚聚氧乙烯醚和曲拉通X-100混合溶液；
3)向步骤2)中反应容器加入实施例1中所制备的富集材料，室温孵育1h；
4)离心，去除步骤3)反应容器中的溶液上清，再用PBS洗涤富集材料2次；
5)使用100mM稀盐酸调节溶液pH至4，实现细胞外囊泡的释放。
6)离心，去除步骤5)反应容器中的材料，冷冻浓缩细胞外囊泡样品。
7)在铺满脐静脉内皮细胞的6孔板中，使用移液枪枪头垂直6孔板横线划痕，然后用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，最后加入无血清培养基；
8)用PBS分散步骤6)中获得的细胞外囊泡样品(来源于SW480和SW620)，加入到步骤7)的6孔板中，并采用PBS作为空白对照；
9)将6孔板放入37℃，5％CO2培养箱中培养。按24和48小时取样，拍照观察。
效果评价1
图1为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球的扫描电镜图。材料呈均匀尺寸的球状。
图2为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料所富集到EVs的透射电镜图。具有典型的囊泡结构，并且结构完整。
图3为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料富集到的EVs促进细胞迁移的结果示意图。用材料富集SW620和SW480细胞培液中的EVs，用酸洗脱分离后用于观察EVs对HUEVC迁移能力的影响，并与PBS对照组进行比较。如图显示，与对照组相比，用DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料提取的EVs均能够促进HUEVC的迁移，优于PBS对照组，并且转移性细胞系SW620来源的EVs效果更为明显。说明该方法提取分离的EVs仍具有较好的生理活性。
图4为DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料用于富集尿液中EVs的LC-MS/MS分析图。用材料分别富集健康人和结直肠癌患者尿液中的EVs并进行蛋白组学分析，对其中差异蛋白质进行GO分析，从而判断影响癌症进程的信号通路。
由实施例和附图可见，该制备方法操作简单、条件温和，由此制备的DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料能够实现对细胞培液和尿液中EVs的高效富集，从而通过Westernblotting实验对其内含的蛋白的表达水平进行分析，还可以结合LC-MS/MS技术进行EVs的蛋白组学分析。同时分离后的EVs仍具有生理活性，能够用于后续的功能分析。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种细胞外囊泡富集材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S11：制备DSPE-PEG-多巴胺和苯硼酸修饰聚丙烯酸微球；所述DSPE-PEG-多巴胺由反应性DSPE-PEG和多巴胺反应得到；所述苯硼酸修饰聚丙烯酸微球由胺化聚丙烯酸微球、对醛基苯硼酸和腈基硼氢化钠反应得到；
S12：将所述DSPE-PEG-多巴胺、苯硼酸修饰聚丙烯酸微球、乙醇水溶液、Tris-HCl缓冲液、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺混合后反应，得到所述细胞外囊泡富集材料。
2.如权利要求1所述的细胞外囊泡富集材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，反应性DSPE-PEG为DSPE-PEG-COOH。
3.如权利要求1所述的细胞外囊泡富集材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，反应性DSPE-PEG和多巴胺的反应时间为4-8h。
4.如权利要求1所述的细胞外囊泡富集材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，反应性DSPE-PEG和多巴胺的质量比为4-6：1。
5.如权利要求1所述的细胞外囊泡富集材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，胺化聚丙烯酸微球、对醛基苯硼酸和腈基硼氢化钠的反应时间为48-72h。
6.如权利要求1所述的细胞外囊泡富集材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，胺化聚丙烯酸微球、对醛基苯硼酸和腈基硼氢化钠的质量比为4-6：7：6。
7.如权利要求1所述的细胞外囊泡富集材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S12中，DSPE-PEG-多巴胺、苯硼酸修饰聚丙烯酸微球、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的质量比为1：5-15：5-15：20。
8.如权利要求1所述的细胞外囊泡富集材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S12中，反应的时间为5-7h。
9.一种权利要求1-8中任一项所述制备方法制备得到的细胞外囊泡富集材料。
10.权利要求9所述细胞外囊泡富集材料在富集细胞外囊泡的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S21：将生物样本、PBS溶液、壬基酚聚氧乙烯醚和曲拉通X-100混合，得到混合溶液；
S22：将所述混合溶液孵育后除杂，完成对细胞外囊泡的富集；
S23：调节缓冲溶液pH值，完成对细胞外囊泡的无损释放。
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