CN113866322A - 一种反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法，所述阿福拉纳中间体为4‑肟甲基‑1‑萘甲酸。该方法包括以下步骤：1)配制供试品溶液；2)使用反相高效液相色谱测定供试品溶液；3)利用面积归一化法确定供试品溶液中阿福拉纳中间体的含量。通过简单的流动相组分，就能实现供试品溶液中各色谱峰之间的完全分离，该方法检测结果精密度高、重复性好且稳定，能准确控制阿福拉纳中间体的纯度。

Description

一种反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法

技术领域

本发明属于药物分析化学技术领域，具体涉及一种反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法。

背景技术

异噁唑啉类杀虫剂阿福拉纳作为新一代犬用口服体外驱虫药，因其药效迅速、口服方便且美味适口而闻名。实验证明，因该药物杀灭虫蚤迅速，且能够持续抑制虫蚤产卵；驱杀蝉虫种类多，且药效通常持续4周以上，并广泛应用于环境治理方面。

阿福拉纳中间体化学名称为4-肟甲基-1-萘甲酸，是阿福拉纳原料药的一个关键中间体，其结构式如下所示：

目前有关4-肟甲基-1-萘甲酸的质量评价方法并无相关报道，为保证其作为中间体合成的阿福拉纳原料药的质量，进而确保用药安全，需要发明一种高效的检测方法确定阿福拉纳中间体的纯度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法，包括如下步骤：

配制阿福拉纳中间体供试品溶液；

使用反相高效液相色谱测定供试品溶液的色谱图，所述反相高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸水溶液，洗脱程序为梯度洗脱；

依据供试品溶液的色谱图，利用面积归一化法确定供试品溶液中阿福拉纳中间体的含量。

在一些实例中，所述流动相B为体积分数0.01％～0.02％三氟乙酸的水溶液。

在一些实例中，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：以体积分数计，0min～9min，40％～55％运行；9min～15min，55％～65％运行；15.1min～25min，40％运行。

在一些实例中，所述反相高效液相色谱的流速为1.0mL/min～1.2mL/min。

在一些实例中，所述反相高效液相色谱的柱温为25℃～40℃。

在一些实例中，所述反相高效液相色谱的进样量为5μL～15μL。

在一些实例中，所述反相高效液相色谱的紫外检测波长为240nm～250nm。

在一些实例中，所述供试品溶液采用体积分数为30％～60％的乙腈水溶液进行配制。

在一些实例中，所述供试品溶液的质量浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。

在一些实例中，包括如下步骤：

采用体积分数为30％～60％的乙腈水溶液配制阿福拉纳中间体供试品溶液，其质量浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。

使用反相高效液相色谱测定供试品溶液的色谱图，所述反相高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.01％～0.02％三氟乙酸的水溶液，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：0min～9min，40％～55％运行；9min～15min，55％～65％运行；15.1min～25min，40％运行。流速为1.0mL/min～1.2mL/min，柱温为25℃～40℃，进样量为5μL～15μL，检测波长为240nm～250nm。

在一些实例中，使用的色谱柱为YMC-Triart C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm。

依据供试品溶液的色谱图，利用面积归一化法确定供试品溶液中阿福拉纳中间体的含量。

本发明的有益效果是：

本发明的一些实例，能有效检测阿福拉纳中间体的含量，且色谱峰峰形较好，相邻色谱峰之间均能达到基线分离。该方法重复性与稳定性良好，为控制阿福拉纳合成过程中中间产品的质量提供了可能。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中供试品溶液的液相色谱图；

图2为本发明实施例5中阿福拉纳中间体的线性图；

图3为本发明对比例1中供试品溶液的液相色谱图；

图4为本发明对比例2中供试品溶液的液相色谱图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

方便比较起见，以下实施例和对比例中，如无特别说明，溶解待测样品所采用的溶剂均为体积分数为40％乙腈水溶液。三氟乙酸水溶液中，百分含量如无特别说明，均指体积分数。流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸水溶液。

实施例1

S1：配制供试品溶液：称取阿福拉纳中间体供试品适量于20mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀，配制成每1mL含中间体0.5mg的试样溶液；

S2：反相高效液相色谱测定：YMC-Triart C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：0.01v/v％三氟乙酸水溶液＝(40～65)：(60～35)(v/v)进行梯度洗脱，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：0min～9min，40％～55％运行；9min～15min，55％～65％运行；15.1min～25min，40％运行。流速：1.0mL/min；柱温：30℃；紫外检测器检测波长：245nm；进样量：10μL；将样品溶液注入液相色谱仪，检测结果如图1所示。

由图1可知：供试品溶液中主成分保留时间为6.35min，理论塔板数为21148，拖尾因子为0.98，主成分与相邻杂质之间分离度为4.37，各组分均能有效分离。由面积归一化法得到阿福拉纳中间体的含量为97.66％，单个最大杂质含量为1.46％。

实施例2：三氟乙酸水溶液体积分数对反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的影响

S1：按照实施例1配制供试品溶液；

S2：在实施例1色谱条件中，保持乙腈不变，改变流动相B中三氟乙酸的体积分数，并取供试品进样考察，结果如表1所示。其中分离度是指阿福拉纳中间体与相邻杂质间的分离度。

表1

流动相B	保留时间	塔板数	拖尾因子	分离度	杂质个数
						0.01v/v％三氟乙酸水溶液	6.56min	21148	0.98	4.37	10
0.02v/v％三氟乙酸水溶液	6.59min	26453	1.09	4.22	10
						0.03v/v％三氟乙酸水溶液	6.58min	26949	0.89	4.50	9
0.04v/v％三氟乙酸水溶液	6.56min	26855	0.82	4.24	9

试验结果表明，当流动相B为0.03v/v％、0.04v/v％三氟乙酸水溶液时，仅能检测到9个杂质，且存在相邻杂质之间无法达到基线分离；当流动相B中三氟乙酸含量在0.01v/v％～0.02v/v％条件下，均可以用于本发明反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法中。

实施例3：柱温对反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的影响

S1：按照实施例1配制供试品溶液；

S2：在实施例1色谱条件的基础上改变柱温，并取供试品溶液进样考察，结果如表2所示。

表2

柱温	保留时间	塔板数	拖尾因子	分离度	杂质个数
						20℃	7.09min	24252	0.97	4.42	8
25℃	6.82min	27760	0.92	4.48	10
						30℃	6.56min	21148	0.98	4.37	10
35℃	6.31min	26000	0.95	4.45	10
						40℃	6.09min	25114	0.96	4.28	10

试验结果表明，温度过低，阿福拉纳中间体检测受影响，杂质未能全检出。柱温在25℃～40℃范围内，阿福拉纳中间体的含量均无明显变化，随着温度的升高，主成分保留时间逐渐减小。在25℃～40℃柱温下，均可用于本发明反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法中。

实施例4：流速对反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的影响

S1：按照实施例1配制供试品溶液；

S2：在实施例1色谱条件的基础上改变流速，并取供试品溶液进样考察，结果如表3所示。

表3

流速	保留时间	塔板数	拖尾因子	分离度	杂质个数
						0.8mL/min	7.99min	30489	0.99	4.40	9
0.9mL/min	7.08min	28953	0.96	4.38	9
						1.0mL/min	6.56min	21148	0.98	4.37	10
1.1mL/min	6.07min	25516	0.95	4.25	10
						1.2mL/min	5.56min	16961	0.95	4.07	10
1.3mL/min	5.18min	21224	0.97	4.32	10

试验结果表明，流速低于0.9mL/min下，仅能检测出9个杂质；流速为1.3mL/min时，压力接近仪器最大耐受压力；流速在1.0mL/min～1.2mL/min下，均能有效准确检测阿福拉纳中间体的含量，优选流速为1.0mL/min～1.2mL/min。

实施例5：线性试验

S1：分别制备50％、80％、100％、120％和150％的阿福拉纳中间体供试品溶液，每个浓度各一份，每份样品检测3次；

S2：按照实施例1中的高效液相色谱条件对5个浓度水平的限度溶液测定峰面积，得到阿福拉纳中间体线性图如图2所示。

由图2可看出，阿福拉纳中间体峰面积与浓度线性关系优异，其线性方程为y＝274.14x+182.93，计算得相关系数r大于0.995，符合要求。

实施例6：中间精密度与稳定性试验

S1：按照实施例1配制2份供试品溶液；

S2：按照实施例1中的反相高效液相色谱条件进行测定，使用两台不同型号高效液相色谱仪进行中间精密度试验；取中间精密度试验样品日光下放置24小时后进行溶液稳定性试验，结果如表4所示。

表4

试验结果表明，阿福拉纳中间体含量稳定，各理化参数均无明显变化，表明本发明的反相高效液相色谱方法精密度高，稳定性良好。

实施例7：重复性

S1：按照实施例1配制6份阿福拉纳中间体供试品溶液；

S3：按照实施例1中的高效液相色谱条件测定样品溶液，供试品溶液中主成分及单个最大杂质含量如表5所示。

表5

编号	峰面积	阿福拉纳中间体	单个最大杂质	杂质个数
					1	320.65	97.68％	1.62％	10
2	323.58	97.66％	1.63％	10
					3	319.33	97.60％	1.54％	10
4	321.81	97.65％	1.54％	10
					5	319.39	97.64％	1.55％	10
6	320.87	97.65％	1.59％	10

试验结果表明，采用本方法测定阿福拉纳中间体含量重复性较好，说明本方法准确可靠。

对比例1

对比例1和实施例1的检测方法相同，不同之处在于S2的色谱条件具体为：

流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸水溶液＝(40～65):(60～35)(v/v)进行梯度洗脱，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：0min～15min，40％～55％运行；15min～30min，55％～65％运行；31min～40min，40％运行。流速：0.7mL/min；检测结果如图3所示。

从图3可看出，该色谱条件下多个杂质未检出，该方法无法对阿福拉纳中间体的含量进行准确检测。

对比例2

对比例2和实施例1的检测方法相同，不同之处在于S2的色谱条件具体为：

流动相为乙腈:水＝(40～65):(60～35)(v/v)进行梯度洗脱，检测结果如图4所示。

从图4可看出，在该色谱条件下，各杂质虽能检出，但主成分色谱峰异常，出现前沿现象，该方法无法对阿福拉纳中间体的含量进行准确检测。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种反相高效液相色谱检测阿福拉纳中间体的方法，包括如下步骤：

配制阿福拉纳中间体供试品溶液；

使用反相高效液相色谱测定供试品溶液的色谱图，所述反相高效液相色谱的流动相为乙腈和三氟乙酸水溶液的混合液，洗脱程序为梯度洗脱；

依据供试品溶液的色谱图，利用面积归一化法确定供试品溶液中阿福拉纳中间体的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积分数为0.01%～0.02%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：梯度洗脱时间及流动相中乙腈的体积比顺序为：以体积分数计，0min～9min，40%～55%运行；9min～15min，55%～65%运行；15.1min～25min，40%运行。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱的流速为1.0mL/min～1.2mL/min。

5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱的柱温为25℃～40℃。

6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱的进样量为5μL～15μL。

7.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱的紫外检测波长为240nm～250nm。

8.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述供试品溶液采用体积分数为30%～60%的乙腈水溶液进行配制。

9.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述供试品溶液的质量浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

配制阿福拉纳中间体供试品溶液；

使用反相高效液相色谱测定供试品溶液的色谱图，所述反相高效液相色谱的流动相为乙腈和含体积分数0.01%～0.02%三氟乙酸的水溶液，梯度洗脱时间及流动相中乙腈的体积比顺序为：0min～9min，40%～55%运行；9min～15min，55%～65%运行；15.1min～25min，40%运行；流速为1.0mL/min～1.2mL/min；柱温为25℃～40℃；检测波长为240nm～250nm；

依据供试品溶液的色谱图，利用面积归一化法确定供试品溶液中阿福拉纳中间体的含量。

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