CN113862322A - 一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，提出了一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，包括以下步骤：(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入NaHCO3去除啤酒花，依次使用风味蛋白酶、乳酸菌和麦芽糖实现啤酒酵母的自溶；(2)酶解：采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶共同酶解；(3)灭酶、除核酸：灭酶后采用等电点法去除核酸；(4)脱色即得啤酒酵母多肽。本发明通过风味蛋白酶、乳酸菌共同对啤酒酵母自溶，大大提高了自溶的效果和效率，使酵母细胞内蛋白质迅速外流，为后续水解制备啤酒酵母多肽提供有利条件，大大提高了啤酒酵母多肽的产率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法及应用。
背景技术
啤酒生产工业会产生大量啤酒废酵母，虽然废酵母的活性有所下降，但是其中富含丰富的营养物质，例如蛋白质、核酸、矿物质、纤维素等。其中，蛋白质含量高达50％，氨基酸种类齐全，其比例接近联合国粮农组织(FAO)推荐比例，尤其是谷类食物中第一限制氨基酸赖氨酸含量丰富，具有潜在的应用价值。
我国是一个啤酒生产和消费大国，每年产生的啤酒废酵母约5万吨。这些啤酒废酵母除了部分经粗加工制成饲料等低附加值产品外，大部分被直接排弃，不但浪费了资源，还造成了环境的污染。如果能对啤酒废酵母进行合理的开发利用，对综合利用资源和环保都具有非常重要的意义。
专利申请CN 106701871 A和CN 106676152 A分别公开了一种利用啤酒废酵母制备多肽的方法，分别采用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行蛋白质水解得到粗多肽后再进行进一步除杂纯化，但是这两个专利申请中对啤酒废酵母的预处理仅仅采用NaHCO3对啤酒花进行了酯化，并未实现啤酒废酵母的自溶，因此后续直接的酶解反应效率较低，得到多肽的产率也较低。
发明内容
本发明提出一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，使用风味蛋白酶和乳酸菌共同处理啤酒酵母实现啤酒酵母的自溶，为后续蛋白质水解提供有利条件，显著提高多肽的收率。
本发明的技术方案如下：
一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，包括以下步骤：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入NaHCO3溶液，离心，沉淀加无菌水后，加入风味蛋白酶，灭酶后再加入乳酸菌和麦芽糖，离心，保留上清液；
(2)酶解：向步骤(1)上清液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解；
(3)灭酶、除核酸：煮沸灭酶，离心，上清液用等电点法去除核酸，离心，保留上清液；
(4)脱色：步骤(3)上清液中加入脱色剂，离心，上清液浓缩干燥，即得。
进一步地，所述步骤(1)中NaHCO3溶液质量百分浓度为0.1-2％，体积是啤酒酵母质量的2-3倍，配制后灭菌。
进一步地，所述步骤(1)中啤酒酵母加入NaHCO3溶液浸泡30-80min，3000-4000r/min离心15-20min。
进一步地，所述步骤(1)的沉淀中加无菌水，无菌水体积为沉淀质量的2-3倍。
进一步地，所述步骤(1)中风味蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1-2‰，添加后于40-50℃反应6-8h。
进一步地，所述步骤(1)中灭酶条件为将溶液煮沸10-15min，冷却至室温。
进一步地，所述步骤(1)中乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜热链球菌中的一种或多种。
进一步地，所述步骤(1)中乳酸菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL。
进一步地，所述步骤(1)中麦芽糖的添加量为5-10g/L。
进一步地，所述步骤(1)中加入乳酸菌和麦芽糖后于28-35℃反应24-36h，15,000-20,000r/min离心8-12min，上清液调节pH至6.5-7.5。
进一步地，所述步骤(2)中木瓜蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1-5‰，胰蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1-2‰，添加后于50-60℃反应8-15h。
更进一步地，所述木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1-2:1。
进一步地，所述步骤(3)中灭酶具体为煮沸10-15min，然后6000-8000r/min离心15-20min。
进一步地，所述步骤(3)中等电点法具体为上清液加入0.1-1mol/LHCl调节pH至2.0-3.0，静置6-8h后6000-8000r/min离心15-20min，保留上清液。
进一步地，所述步骤(4)中脱色剂为活性炭、大孔树脂、硅藻土中的一种或多种。
更进一步地，所述脱色剂为硅藻土和大孔树脂D392，二者的质量比为1:3-5。
进一步地，所述步骤(4)中脱色剂添加量为上清液体积的1-3‰。
进一步地，所述步骤(4)中脱色剂脱色5-8h后，6000-8000r/min离心15-20min，50-60℃旋转蒸发浓缩后，置真空干燥箱，以氯化钙为干燥剂，40-50℃干燥20-30h，即得啤酒酵母多肽。
本发明进一步提供上述制备方法制备得到的啤酒酵母多肽。
本发明还提供上述制备方法制备得到的啤酒酵母多肽在制备抗氧化食品中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明在啤酒酵母自溶阶段采用NaHCO3与啤酒花酯化以去除啤酒花的苦味，添加风味蛋白酶和乳酸菌配合使用以加速啤酒酵母的自溶。首先，风味蛋白酶可以促进啤酒酵母细胞壁和细胞膜的分离，同时溶解细胞壁表面的蛋白质而溶解细胞壁，为后续细胞膜破裂提供有利条件。其次，乳酸菌与啤酒酵母竞争麦芽糖等营养物质，使啤酒酵母失去营养供给从而逐渐失去活性进而发生细胞膜的破损，酵母细胞内容物蛋白质、核酸、多糖等物质外泄，为后续多肽的制备提供有利条件。并且后续高速离心能彻底去除乳酸菌，不影响啤酒酵母提取多肽的纯度。
2、本发明采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶的方式进行啤酒酵母中蛋白的水解，水解效率更高，产物收率更高。
3、本发明采用硅藻土和大孔树脂D392共同对多肽溶液进行脱色处理，不仅能尽可能降低对多肽的吸附，还能显著提高脱色的效率和效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1
一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，包括以下步骤：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入3倍体积质量百分浓度为1％的NaHCO3溶液中浸泡60min，3500r/min离心15min，取沉淀加3倍体积无菌水后，加入风味蛋白酶，于45℃反应7h，煮沸13min灭酶后冷却至室温，再加入嗜酸乳杆菌和麦芽糖，于28℃反应24h，15,000r/min离心12min，保留上清液，调节pH7.0；
其中，NaHCO3溶液配制后灭菌，风味蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1.5‰，嗜酸乳杆菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL，麦芽糖的添加量为8g/L；
(2)酶解：向步骤(1)上清液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶于55℃酶解反应12h；
其中，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的添加量分别为啤酒酵母质量的3‰和1.5‰；
(3)灭酶、除核酸：煮沸12min灭酶，7000rmin离心20min，上清液加入0.5mol/LHCl调节pH至2.5静置7h后7000r/min离心20min，去除核酸，保留上清液；
(4)脱色：步骤(3)中上清液中加入质量比为1:4的硅藻土和大孔树脂D392的混合脱色剂，搅拌脱色6h后，7000r/min离心20min，上清液于55℃旋转蒸发浓缩后置真空干燥箱，以氯化钙为干燥剂，45℃干燥24h，即得啤酒酵母多肽；
其中，混合脱色剂的添加量为上清液体积的2‰。
实施例2
一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，包括以下步骤：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入3倍体积质量百分浓度为0.1％的NaHCO3溶液中浸泡80min，3000r/min离心20min，取沉淀加3倍体积无菌水后，加入风味蛋白酶，于40℃反应8h，煮沸15min灭酶后冷却至室温，再加入瑞士乳杆菌和麦芽糖，于35℃反应36h，15,000r/min离心12min，保留上清液，调节pH6.5；
其中，NaHCO3溶液配制后灭菌，风味蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1‰，瑞士乳杆菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL，麦芽糖的添加量为5g/L；
(2)酶解：向步骤(1)上清液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶于50℃酶解反应15h；
其中，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的添加量分别为啤酒酵母质量的1‰和1‰；
(3)灭酶、除核酸：煮沸10min灭酶，6000r/min离心20min，上清液加入0.1mol/LHCl调节pH至2.0，静置6h后6000r/min离心20min，去除核酸，保留上清液；
(4)脱色：步骤(3)中上清液中加入质量比为1:3的硅藻土和大孔树脂D392的混合脱色剂，搅拌脱色8h后，6000r/min离心20min，上清液于50℃旋转蒸发浓缩后置真空干燥箱，以氯化钙为干燥剂，40℃干燥30h，即得啤酒酵母多肽；
其中，混合脱色剂的添加量为上清液体积的1‰。
实施例3
一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，包括以下步骤：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入2倍体积质量百分浓度为2％的NaHCO3溶液中浸泡30min，4000r/min离心15min，取沉淀加3倍体积无菌水后，加入风味蛋白酶，于50℃反应6h，煮沸10min灭酶后冷却至室温，再加入嗜热链球菌和麦芽糖，于28℃反应36h，20,000r/min离心8min，保留上清液，调节pH7.5；
其中，NaHCO3溶液配制后灭菌，风味蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的2‰，嗜热链球菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL，麦芽糖的添加量为10g/L；
(2)酶解：向步骤(1)上清液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶于60℃酶解反应8h；
其中，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的添加量分别为啤酒酵母质量的5‰和2‰；
(3)灭酶、除核酸：煮沸15min灭酶，8000r/min离心15min，上清液加入1mol/LHCl调节pH至3.0，静置8h后8000r/min离心15min，去除核酸，保留上清液；
(4)脱色：步骤(3)中上清液中加入质量比为1:5的硅藻土和大孔树脂D392的混合脱色剂，搅拌脱色8h后，8000r/min离心15min，上清液于60℃旋转蒸发浓缩后置真空干燥箱，以氯化钙为干燥剂，50℃干燥20h，即得啤酒酵母多肽；
其中，混合脱色剂的添加量为上清液体积的3‰。
实施例4
一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，包括以下步骤：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入3倍体积质量百分浓度为1％的NaHCO3溶液中浸泡60min，3500r/min离心15min，取沉淀加3倍体积无菌水后，加入风味蛋白酶，于45℃反应7h，煮沸13min灭酶后冷却至室温，再加入嗜酸乳杆菌和麦芽糖，于28℃反应24h，15,000r/min离心12min，保留上清液，调节pH7.0；
其中，NaHCO3溶液配制后灭菌，风味蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1.5‰，嗜酸乳杆菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL，麦芽糖的添加量为8g/L；
(2)酶解：向步骤(1)上清液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶于55℃酶解反应12h；
其中，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的添加量分别为啤酒酵母质量的3‰和1.5‰；
(3)灭酶、除核酸：煮沸12min灭酶，7000r/min离心20min，上清液加入0.5mol/LHCl调节pH至2.5，静置7h后7000r/min离心20min，去除核酸，保留上清液；
(4)脱色：步骤(3)中上清液中加入质量比为1:4的硅藻土和活性炭的混合脱色剂，搅拌脱色6h后，7000r/min离心20min，上清液于55℃旋转蒸发浓缩后置真空干燥箱，以氯化钙为干燥剂，45℃干燥24h，即得啤酒酵母多肽；
其中，混合脱色剂的添加量为上清液体积的2‰。
实施例5
一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，包括以下步骤：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入3倍体积质量百分浓度为1％的NaHCO3溶液中浸泡60min，3500r/min离心15min，取沉淀加3倍体积无菌水后，加入风味蛋白酶，于45℃反应7h，煮沸13min灭酶后冷却至室温，再加入嗜酸乳杆菌和麦芽糖，于28℃反应24h，15,000r/min离心12min，保留上清液，调节pH7.0；
其中，NaHCO3溶液配制后灭菌，风味蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1.5‰，嗜酸乳杆菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL，麦芽糖的添加量为8g/L；
(2)酶解：向步骤(1)上清液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶于55℃酶解反应12h；
其中，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的添加量分别为啤酒酵母质量的3‰和1.5‰；
(3)灭酶、除核酸：煮沸12min灭酶，7000r/min离心20min，上清液加入0.5mol/LHCl调节pH至2.5，静置7h后7000r/min离心20min，去除核酸，保留上清液；
(4)脱色：步骤(3)中上清液中加入质量比为1:1:3的硅藻土、大孔树脂D392和活性炭的混合脱色剂，搅拌脱色6h后，7000r/min离心20min，上清液于55℃旋转蒸发浓缩后置真空干燥箱，以氯化钙为干燥剂，45℃干燥24h，即得啤酒酵母多肽；
其中，混合脱色剂的添加量为上清液体积的2‰。
对比例1
啤酒酵母自溶阶段采用NaCl溶液代替风味蛋白酶，其余同实施例1。
具体为：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入3倍体积质量百分浓度为1％的NaHCO3溶液中浸泡60min，3500r/min离心15min，取沉淀加3倍体积4.0％NaCl溶液，再加入嗜酸乳杆菌和麦芽糖，于28℃反应24h，15,000r/min离心12min，保留上清液，调节pH6.5-7.5；
其中，NaHCO3和NaCl溶液配制后灭菌，嗜酸乳杆菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL，麦芽糖的添加量为8g/L。
对比例2
啤酒酵母自溶阶段采用中性蛋白酶代替风味蛋白酶，其余同实施例1。
对比例3
啤酒酵母自溶阶段采用醋酸杆菌代替嗜酸乳杆菌，由于醋酸杆菌利用乙醇为营养物质，相应的将麦芽糖替换为乙醇，具体为：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入3倍体积质量百分浓度为1％的NaHCO3溶液中浸泡60min，3500r/min离心15min，取沉淀加3倍体积无菌水后，加入风味蛋白酶，于45℃反应7h，煮沸13min灭酶后冷却至室温，再加入醋酸杆菌和乙醇，于28℃反应24h，15,000r/min离心12min，保留上清液，调节pH6.5-7.5；
其中，NaHCO3溶液配制后灭菌，风味蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1.5‰，醋酸杆菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL，添加无水乙醇，使体系内无水乙醇浓度达到5％；
其余同实施例1。
对比例4
采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶代替胰蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶进行蛋白质的水解，其余同实施例1。
实验例1不同啤酒酵母多肽的含量、收率、纯度
参考GB/T22492/2008《大豆肽粉》中附录B肽含量检验记载的方法，测定实施例1-5，对比例1-4的肽含量。
多肽纯度＝肽含量/干物质质量×100％，其中干物质为经处理后得到的啤酒酵母多肽总量。
多肽得率＝肽含量/啤酒酵母质量×100％，其中啤酒酵母质量为最开始用于制备的啤酒酵母的总量。
表1不同啤酒酵母多肽的含量、收率、纯度
由上表数据可以看出，本申请实施例1-3制备得到的多肽纯度达到93％以上，收率30％以上。实施例4和5采用含活性炭的脱色剂，虽然对溶液的脱色效果较好，但是活性炭对多肽的吸附也较大，使得多肽的收率下降。对比例1采用NaCl溶液代替风味蛋白酶，有文献证明NaCl能够促进酵母细胞质壁分离，实现酵母的自溶，但是本发明采用风味蛋白酶进行啤酒酵母的自溶，能够使酵母菌细胞壁被溶解，促进后续乳酸菌对酵母的自溶作用，因此使用NaCl自溶时，多肽纯度和收率都有显著下降。对比例2采用中性蛋白酶代替风味蛋白酶，中性蛋白酶对啤酒酵母的自溶效果较差，最终多肽收率为23.55％，纯度88.1％。对比例3采用醋酸菌代替乳酸菌对啤酒酵母进行自溶，醋酸菌将乙醇氧化为醋酸，醋酸的存在会影响酵母的生长，但是申请人发现其很难导致酵母细胞膜的破裂，因此，最终多肽的收率并不高，仅为20.1％，并且由于醋酸的影响，导致多肽的纯度也收到相应的影响，仅为78.5％。对比例4采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶混合进行酶解，这两种酶是目前公认的用于制备啤酒酵母多肽的酶解酶，但是发明人在研发阶段发现胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的使用具有更高的收率，可能是因为在自溶阶段采用了风味蛋白酶，其后续采用的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶相容性更高，而采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶会产生一定的竞争抑制。
实验例2不同啤酒酵母多肽的抗氧化能力
按照GB/T39100-2020《多肽抗氧化性测定DPPH和ABTS法》中DPPH法测定实施例1-5，对比例1-4制得的啤酒酵母多肽的抗氧化活性，结果见表2。
表2不同啤酒酵母多肽抗氧化活力
由上表数据可以看出，本申请实施例1-3制备得到的多肽DPPH清除率高达89％以上。实施例4和5采用含活性炭的脱色剂，对多肽的吸附较大，最终导致多肽的抗氧化活性也相应收到一定影响。对比例1采用NaCl溶液代替风味蛋白酶，最终制备得到的多肽DPPH清除率为80％，抗氧化活性有一定降低。对比例2采用中性蛋白酶代替风味蛋白酶，酶对多肽的活性影响较小，最终制备得到的多肽DPPH清除率为91％。对比例3采用醋酸菌代替乳酸菌对啤酒酵母进行自溶，由于醋酸菌产生的醋酸为酸性物质，对于多肽活性有很大影响，最终其DPPH清除率仅为76％。对比例4采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶混合进行酶解，对多肽的活性影响也较小，最终制备得到的多肽DPPH清除率为88％。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)啤酒酵母自溶：啤酒酵母加入NaHCO3溶液，离心，沉淀中加无菌水后，加入风味蛋白酶，灭酶后再加入乳酸菌和麦芽糖，离心，保留上清液；
(2)酶解：向步骤(1)上清液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解；
(3)灭酶、除核酸：煮沸灭酶，离心，上清液用等电点法去除核酸，离心，保留上清液；
(4)脱色：步骤(3)上清液中加入脱色剂，离心，上清液浓缩干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，其特征在于，NaHCO3溶液质量百分浓度为0.1-2％，体积是啤酒酵母质量的2-3倍，配制后灭菌。
3.根据权利要求1所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中风味蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1-2‰，添加后于40-50℃反应6-8h。
4.根据权利要求1所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜热链球菌中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中乳酸菌的添加量为5×103-5×104cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中木瓜蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1-5‰，胰蛋白酶的添加量为啤酒酵母质量的1-2‰，添加后于50-60℃反应8-15h。
7.根据权利要求1所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中等电点法具体为上清液加入0.1-1mol/LHCl溶液调节pH至2.0-3.0，静置6-8h后6000-8000r/min离心15-20min，保留上清液。
8.根据权利要求1所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中脱色剂为活性炭、大孔树脂、硅藻土中的一种或多种。
9.一种权利要求1-8任一项所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法制备得到的啤酒酵母多肽。
10.根据权利要求1-8任一项所述的高抗氧化活性的啤酒酵母多肽制备方法制备得到的啤酒酵母或权利要求9所述的啤酒酵母多肽在制备抗氧化食品中的应用。
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