CN104498575A - 具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽及其制备方法，所述方法包括如下步骤：将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶于磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中，得pH为7.2-7.8的酶悬浮液；将废啤酒酵母粉碎，置于反应釜中，加磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，得蛋白浓度为1-1.8％的啤酒酵母溶液；于啤酒酵母溶液中加酶悬浮液，进行酶解，得酶解液；调节酶解液的pH为3.9-4.1，灭酶活，于转速为3000-5000r/min离心12-17min，取上清液，干燥，即可。本发明所制得的多肽具有良好的抗氧化作用；且该方法使啤酒废酵母变废为宝，简单易操作，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及发酵领域，特别是涉及一种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽及其制备方法。
背景技术
啤酒酿制过程中的废弃物主要是啤酒糟和废酵母，其具有多种营养成分并易于提取，在食品工业、饲料工业和制药工业中有广泛应用。啤酒废弃物可以用于生产酵母浸膏、营养调味品、胞壁多糖、面包饼干等营养食品；在饲料工业上可以作为鱼虾饲料，生产发酵饲料及粗酶制剂；在医药上可作为提取SOD、FDP、RNA、葡聚糖及制取酒花素和复合磷酸酯酶等物质的好材料。啤酒废弃物的回收利用具有非常广阔的应用前景，具有较好的社会效益和经济效益。
而其中，啤酒废酵母有极高的利用价值，其含有6％～8％的核糖核酸，2％的B族维生素，1％的谷胱甘肽及辅酶A，还有人体必需的8种氨基酸，更值得关注的是，其含有50％左右的蛋白质，然而，关于利用啤酒废酵母制备功能多肽却鲜有研究。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法。
解决上述技术问题的具体技术方案如下：
一种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制酶悬浮液：将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶于磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中，制成pH为7.2-7.8的酶悬浮液；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量份配比为0.9-1.1:0.9-1.1；
(2)将废啤酒酵母粉碎，置于反应釜中，加磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，得蛋白浓度为1-1.8％的啤酒酵母溶液；
(3)于啤酒酵母溶液中加酶悬浮液进行酶解，得酶解液；所述酶解的温度为55-60℃，时间为3-4h，pH为5-6；所述酶悬浮液的添加量为：按啤酒酵母溶液中蛋白和酶悬浮液中酶的重量计，每100g蛋白中添加5-7g酶；
(4)灭酶活，并将灭酶活后的酶解液于转速为3000-5000r/min离心12-17min，取上清液，干燥，即可。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述酶解的温度为57-58℃，时间为3.4-3.6h，pH为5.3-5.5。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述酶悬浮液的添加量为：按啤酒酵母溶液中蛋白和酶悬浮液中酶的重量计，每100g蛋白中添加5.9-6.1g酶。
在其中一些实施例中，步骤(4)中所述转速为3800-4200r/min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述酶悬浮液的pH为7.5。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述啤酒酵母溶液的蛋白浓度为1.33-1.35％。
在其中一些实施例中，步骤(4)中所述干燥的温度为110-130℃，时间为22-26h。
在其中一些实施例中，步骤(4)中所述灭酶活的方法为：调节酶解液的pH至3.9-4.1，温度至89-91℃，保温18-22min。
在其中一些实施例中，步骤(4)中采用3.9-4.1mol/L的盐酸溶液调节酶解液的pH。
本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽。
本发明所述的种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽及其制备方法具有以下优点和有益效果：
本发明经发明人大量的实验和研究，得出：将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶以特定配比复合，溶于磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，制得酶悬浮液，将该酶液添加于啤酒废酵母溶液进行酶解，通过严格控制酶解条件进而制得具有良好的抗氧化作用的多肽；该方法使啤酒废酵母变废为宝，且简单易操作，适合大规模生产。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
下述实施例中所述磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液的配制方法为：取68.05g溶解于3500ml溶液蒸馏水中，用1M氢氧化钠溶液将pH值调至7.0，并定容至5000ml。
所述水解度的测定方法，采用PH-Star法：
水解度(DH)＝被水解的肽键的数目/总的肽键的数目
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式中V：水解过程中用去的NaOH的量(g)；
MP：蛋白质的总量(g)；
C：NaOH的浓度(mol/L)；
Htot：每克蛋白质中肽键的克当量(取8.38)；
A：a-氨基酸的解离度。
实施例1
本实施例中一种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制酶悬浮液：将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶于磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中，制成pH为7.5的酶悬浮液；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量份配比为1:1；
(2)将废啤酒酵母粉碎，置于反应釜中，加磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，得蛋白浓度为1.34％的啤酒酵母溶液；
(3)于啤酒酵母溶液中加酶悬浮液进行酶解，得酶解液；所述酶解的温度为57.5℃，时间为3.5h，pH为5.4，所述酶悬浮液的添加量为：按啤酒酵母溶液中蛋白和酶悬浮液中酶的重量计，每100g蛋白中添加6g酶；测量溶液的水解度为26.89％；
(4)用4.0mol/L的盐酸溶液调节酶解液的pH为4，并调节温度至90℃，保温20min，灭酶活，于转速为4000r/min离心15min，取上清液，于温度为120℃干燥24h，得多肽A。
实施例2
本实施例中一种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制酶悬浮液：将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶于磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中，制成pH为7.2的酶悬浮液；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量份配比为0.9:1；
(2)将废啤酒酵母粉碎，置于反应釜中，加磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，得蛋白浓度为1％的啤酒酵母溶液；
(3)于啤酒酵母溶液中加酶悬浮液进行酶解，得酶解液；所述酶解的温度为55℃，时间为3h，pH为5，所述酶悬浮液的添加量为：按啤酒酵母溶液中蛋白和酶悬浮液中酶的重量计，每100g蛋白中添加5g酶；测量溶液的水解度为24.21％；
(4)用4.0mol/L的盐酸溶液调节酶解液的pH为3.9，并调节温度至90℃，保温20min，灭酶活，于转速为3000r/min离心17min，取上清液，于温度为130℃干燥26h，得多肽B。
实施例3
本实施例中一种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制酶悬浮液：将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶于磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中，制成pH为7.8的酶悬浮液；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量份配比为1.1:1；
(2)将废啤酒酵母粉碎，置于反应釜中，加磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，得蛋白浓度为1.8％的啤酒酵母溶液；
(3)于啤酒酵母溶液中加酶悬浮液进行酶解，得酶解液；所述酶解的温度为60℃，时间为4h，pH为6，所述酶悬浮液的添加量为：按啤酒酵母溶液中蛋白和酶悬浮液中酶的重量计，每100g蛋白中添加7g酶；测量溶液的水解度为25.18％；
(4)用4.0mol/L的盐酸溶液调节酶解液的pH为4.1，并调节温度至90℃，保温20min，灭酶活，于转速为5000r/min离心12min，取上清液，于温度为110℃干燥22h，得多肽C。
对比例1
本对比例多肽a与实施例1所述制备方法基本相同，区别在于：步骤(3)所述酶解的温度为50℃，时间为5h，pH为5，所述酶悬浮液的添加量为：按啤酒酵母溶液中蛋白和酶悬浮液中酶的重量计，每100g蛋白中添加4g酶。
对比例2
本对比例多肽b与实施例1所述制备方法基本相同，区别在于：不含步骤(1)，即直接于啤酒酵母溶液中加酶，且所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量份配比为0.5:1.5。
实施例4功效实验
一、实验目的
通过对比分析评价实施例1-3所制得的啤酒酵母多肽的抗氧化作用。
二、实验方法
本实验分为实验组和对照组，其中：
实验组1为实施例1所制得的多肽A，
实验组2为实施例2所制得的多肽B，
实验组3为实施例3所制得的多肽C，
对照组1为对比例1所制得的多肽a，
对照组2为对比例2所制得的多肽b，
对照组3为谷胱甘肽；
采用下述方法，分别测定上述各多肽的抗氧化能力：
(1)多肽的还原能力
A、配制浓度为50mg/ml的多肽溶液；
B、在15ml试管中分别加1ml多肽溶液、2.5ml 0.2mol/l的磷酸盐缓冲溶液(pH)和5ml 1％铁氰化钾，置于50℃水浴中反应20min，急剧冷却，然后加入5ml 10％的三氯乙酸，摇匀、过滤，吸取上清液2.5ml，加入2.5ml蒸馏水和0.5ml 0.1％的三氯化铁溶液，样品在700nm处测定吸光值，吸光度值越大表明还原能力越强；
(2)多肽清除羟自由基的能力
A、配制浓度为50mg/ml的多肽溶液；
B、依次加入0.5ml 10mmol/l水杨酸-乙醇溶液、0.5ml多肽溶液、0.5ml10mmol/l FeSO4溶液、3.5ml蒸馏水于试管中，再加入5ml 100mmol/l H2O2进行反应，摇匀后于510nm处测定吸光度A1；取0.5ml蒸馏水代替10mmol/lFeSO4溶液所测的吸光度为A2；取0.5ml蒸馏水代替多肽溶液所测得的吸光度为A3，羟自由基的清除率P(％)计算公式为：
(3)多肽清除1,1-二苯基-苦基肼自由基的能力
A、配制浓度为50mg/ml的多肽溶液；
B、采用DPPH·酶标仪法，加上述多肽溶液100μL和1mmol/L的DPPH自由基甲醇溶液100μL于96孔酶标仪板中，震荡30s，37℃保温20min，后在517nm波长下测定，平行测定3次，后按照下述公式计算
自由基清除率＝[1-(Ap-Ac)/Amax]×100％
三、实验结果
A、多肽的还原能力结果
结果参见表1，从表1可知：实验组1-3所制得的多肽的吸光度值明显大于对照组1和对照组2所制得的多肽的吸光度值，实验组1所制得的多肽的吸光度值略大于对照组3，实验组2和3所制得的多肽的吸光度值略小于对照组3。说明实施例1所制得的多肽具有较好的还原能力。
表1 实验组和对照组所制得的多肽的还原能力结果表
| 组别 | 吸光度值 |
| 对照组1 | 0.322 |
| 对照组2 | 0.361 |
| 对照组3 | 0.519 |
| 实验组1 | 0.557 |
| 实验组2 | 0.481 |
| 实验组3 | 0.469 |
B、多肽清除羟自由基的能力结果
结果参见表1，从表1可知：与对照组1-3相比，实验组1-3所制得的多肽具有良好的清除羟自由基的能力。
表2 实验组和对照组所制得的多肽清除羟自由基能力结果表
| 组别 | 羟自由基清除率 |
| 对照组1 | 18％ |
| 对照组2 | 20％ |
| 对照组3 | 30％ |
| 实验组1 | 65％ |
| 实验组2 | 60％ |
| 实验组3 | 61％ |
C、多肽清除1,1-二苯基-苦基肼自由基的能力结果
结果参见表3，从表3可知：与对照组1-3相比，实验组1-3所制得的多肽具有良好的清除1,1-二苯基-苦基肼自由基的能力。
表3 实验组和对照组所制得的多肽清除DPPH能力结果表
| 组别 | DPPH清除率 |
| 对照组1 | 73％ |
| 对照组2 | 70％ |
| 对照组3 | 85％ |
| 实验组1 | 89％ |
| 实验组2 | 86％ |
| 实验组3 | 86％ |
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制酶悬浮液：将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶于磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中，得pH为7.2-7.8的酶悬浮液；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量份配比为0.9-1.1:0.9-1.1；
(2)将废啤酒酵母粉碎，置于反应釜中，加磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，得蛋白浓度为1-1.8％的啤酒酵母溶液；
(3)于啤酒酵母溶液中加酶悬浮液，进行酶解，得酶解液；所述酶解的温度为55-60℃，时间为3-4h，pH为5-6；所述酶悬浮液的添加量为：按啤酒酵母溶液中蛋白和酶悬浮液中酶的重量计，每100g蛋白中添加5-7g酶；
(4)灭酶活，并将灭酶活后的酶解液于转速为3000-5000r/min离心12-17min，取上清液，干燥，即可。
2.根据权利要求1所述的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述酶解的温度为57-58℃，时间为3.4-3.6h，pH为5.3-5.5。
3.根据权利要求1或2所述的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述酶悬浮液的添加量为：按啤酒酵母溶液中蛋白和酶悬浮液中酶的重量计，每100g蛋白中添加5.9-6.1g酶。
4.根据权利要求1或2所述的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述转速为3800-4200r/min。
5.根据权利要求1或2所述的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述酶悬浮液的pH为7.5。
6.根据权利要求1或2所述的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述啤酒酵母溶液的蛋白浓度为1.33-1.35％。
7.根据权利要求1或2所述的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述干燥的温度为110-130℃，时间为22-26h。
8.根据权利要求1或2所述的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述灭酶活的方法为：调节酶解液的pH至3.9-4.1，温度至89-91℃，保温18-22min。
9.根据权利要求8所述的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中采用3.9-4.1mol/L的盐酸溶液调节酶解液的pH。
10.如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的具有抗氧化作用的啤酒酵母多肽。
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