CN105603031A - 一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法 - Google Patents

一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法 Download PDF

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洪鹏志
刘唤明
周春霞
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Abstract

本发明公开了一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，包括以下主要步骤：将新鲜的水产蛋白绞碎；绞碎后的水产蛋白加入到发酵罐中，并添加营养物和水混匀作为发酵培养基；发酵罐中接入能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（<i>Bacillus？subtilis</i>）HL-2于50℃～55℃进行好氧发酵42h～48h；发酵结束后，发酵液先后经过滤、超滤和纳滤后得到浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得到活性肽成品。本发明技术无需高温处理，更多地保留了制备的功能肽和水产蛋白本身所含功能性成分的生物学活性，并且简化了活性肽的制备工序和降低了活性肽的生产成本，有着良好的应用前景。

Description

一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法
技术领域
本发明涉及一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，属于水产品加工与利用的领域。
背景技术
蛋白质酶解的后的产物小肽不但容易消化、吸收，而且还具有抗高血压、抗胆固醇、抗血栓形成、改善脂质代谢、增强人体体能、帮助恢复疲劳、促进钙磷和其它微量元素的吸收、促进大脑发育、提高记忆力、增强巨噬细胞和B细胞活力、增强免疫功能、保护表皮细胞、防止黑色素沉淀、消除体内自由基等功效。
关于水产蛋白活性肽的制备，国内进行了大量的研究。目前，水产蛋白活性肽的制备方法主要有自溶酶解、酶解法、液态发酵法和固态发酵与液态酶解相结合的方法这四种。专利申请200810195646.4“内源酶制备生物活性小肽的工艺”公开了一种利用海洋低值鱼体内的内源酶自溶酶解的方法制备水产蛋白生物活性小肽的方法。专利申请201410145196.3“一种制备扇贝裙边活性肽的方法”公开了一种酶解法制备水产蛋白活性肽的方法。专利申请CN102028091A“一种纳豆菌发酵法制备低分子鱼肽的方法”公开了一种液体发酵法制备鱼蛋白肽的方法，专利申请201210539941.3“一种由鱼蛋白肽和与大豆肽组成的蛋白肽的生产方法”公开了一种由固态发酵与液态酶解相结合制备水产蛋白活性肽的方法。
现有的水产蛋白活性肽制备技术中存在以下缺陷。首先，现有的水产蛋白活性肽制备技术中都有高温处理的过程。以上制备技术中都有高温灭酶这一工序；微生物发酵的方法原料需要灭菌。以上这些高温处理，会在一定程度减弱制备的功能肽或水产蛋白本身所含功能性成分的生物学活性；另外高温处理会显著增强美拉德反应，使得酶解液颜色变深，为成品加工过程增加了负担。其次，外加酶酶解的方法需要外加蛋白酶，增加了成本；自溶酶解由于内源酶的不足，导致酶解不彻底。另外，微生物发酵法虽然不用外加蛋白酶，但是原料需要灭菌导致内源酶失活，不能充分地有效利用内源酶。
发明内容
针对现有的水产蛋白活性肽制备技术所存在的问题。本发明的主要目的是提供一种低温的制备水产蛋白活性肽的方法，以便更好地保留制备的功能肽和水产蛋白本身所含功能性成分的生物学活性。本发明的另一目的是提供一种发酵法制备活性肽的方法，使得微生物发酵与内源酶酶解过程能有机结合在一起。本发明还有一目的是简化活性肽的制备工序，降低其生产成本。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用；
（2）将新鲜的水产蛋白绞碎后备用；
（3）将步骤（2）制得的绞碎的水产蛋白放入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到发酵培养基；
（4）往步骤（3）获得的发酵培养上接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液；
（5）液态发酵过程的控制：发酵温度为50℃～55℃，无菌空气通入量为0.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm～350rpm，发酵时间为42h～48h；
（6）成品处理：将步骤（5）得到的发酵液进行过滤去除沉淀得到上清液；上清液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
所述步骤（1）中所用的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2已于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60001，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
所述步骤（2）中的水产蛋白为罗非鱼下脚料、南极磷虾、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、牡蛎、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种。
所述步骤（3）中水产蛋白的加入量以添加的水产蛋白的质量占发酵培养基总质量百分比计，为10%～30%。所述步骤（3）中营养物为葡萄糖、食品级氯化钙、食品级氯化亚铁和食品级磷酸氢二钾组成的混合物。所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，食品级氯化钙0.01%～5%，食品级氯化亚铁0.01%～5%，食品级磷酸氢二钾0.01%～5%。
所述步骤（4）中枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液的接种量以接入的种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为1%～15%。
与现有技术相比，本发明具有以下优点。
（1）整个制备过程没有高温处理，这不但可以更好地保留水产蛋白本身所含有的功能性成分的生物学活性，例如虾头和南极磷虾中的虾青素；而且还能更好地保留所制备的功能肽的生物学活性。本发明申请采用耐高温地衣芽孢杆菌发酵，在高温条件下可以抑制致病菌和腐败菌的生长，因此本技术中培养基无需灭菌，这也是现有的采用常温菌种进行发酵法制备活性肽无法做到的。另外，本技术采用超滤膜去除酶解液中的蛋白酶，无需采用高温的方式进行灭酶。
（2）简化了工序，降低了成本。由于本发明申请没有高温灭酶的过程，这不但降低了能耗，而且还会大大降低酶解液的美拉德反应，所以发酵液的颜色比较浅。而后续的膜分离又有一定的脱色效果，因此本技术中可以无需脱色这个程序，简化了工序，降低了成本。
（3）内源酶酶解与微生物发酵的完美结合。现有的发酵技术中，原料都需灭菌，这不但增加了能耗，而且又使得水产蛋白的内源酶失活。而本技术中原料无需灭菌，保留了水产蛋白中内源酶的活性。并且，微生物发酵的温度与内源酶的最适酶解温度一致，使得内源酶酶解与微生物发酵能完美结合在一起。正是由于本发明中充分利用内源酶的酶解作用，使得本发明无需另加蛋白酶。
（4）制备成本不但要低于现有发酵技术，而且发酵效果也要优于现有的发酵技术。与现有的采用发酵法制备活性肽的技术相比，本发明申请原料无需灭绝，可降低能耗和成本。由于本发明申请提供的技术方案无需高温灭绝，保留了水产蛋白内源蛋白酶的酶活，这是现有的采用常温发酵菌种制备活性肽无法做到的，另外，在高温下酶的活性更强，因此，本技术采用耐高温菌种进行发酵，水产蛋白的水解度要高于现有的常温菌种发酵技术。
本发明提供了一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法。本发明技术作用条件温和，更多地保留了制备的功能肽和水产蛋白本身所含功能性成分的生物学活性，并且简化了活性肽制备的工序和降低了活性肽的生产成本，有着良好的应用前景。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面就水产蛋白的种类、发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2
接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用。将新鲜的南极磷虾绞碎后备用。将20公斤绞碎的南极磷虾和100公斤水加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入105克葡萄糖、452克食品级氯化钙、380克食品级氯化亚铁和580克食品级磷酸氢二钾，获得发酵培养基；往发酵罐中的发酵培养基中加入10公斤枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液；发酵温度为50℃，无菌空气通入量为1.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为250rpm～350rpm，发酵时间为42h；发酵结束后，发酵液进行过滤去除沉淀得到上清液；上清液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
实施例2：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用。将新鲜的虾头碎后备用。将21公斤绞碎的虾头和100公斤水加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入102克葡萄糖、409克食品级氯化钙、389克食品级氯化亚铁和559克食品级磷酸氢二钾，获得发酵培养基；往发酵罐中的发酵培养基中加入9公斤枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液；发酵温度为55℃，无菌空气通入量为1.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为250rpm～350rpm，发酵时间为48h；发酵结束后，发酵液进行过滤去除沉淀得到上清液；上清液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
实施例3：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用。将新鲜的罗非鱼下脚料绞碎后备用。将18公斤绞碎的罗非鱼下脚料和100公斤水加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入102克葡萄糖、456克食品级氯化钙、356克食品级氯化亚铁和586克食品级磷酸氢二钾，获得发酵培养基；往发酵罐中的发酵培养基中加入8公斤枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液；发酵温度为53℃，无菌空气通入量为1.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为250rpm～350rpm，发酵时间为45h；发酵结束后，发酵液进行过滤去除沉淀得到上清液；上清液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。

Claims (7)

1.一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用；
（2）将新鲜的水产蛋白绞碎后备用；
（3）将步骤（2）制得的绞碎的水产蛋白放入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到发酵培养基；
（4）往步骤（3）获得的发酵培养上接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液；
（5）液态发酵过程的控制：发酵温度为50℃～55℃，无菌空气通入量为0.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm～350rpm，发酵时间为42h～48h；
（6）成品处理：将步骤（5）得到的发酵液进行过滤去除沉淀得到上清液；上清液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
2.根据权利要求1所述的一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCCNo：60001。
3.根据权利要求1所述的一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，其特征在于：所述步骤（2）中的水产蛋白为罗非鱼下脚料、南极磷虾、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、牡蛎、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，其特征在于：所述步骤（3）中水产蛋白的加入量以添加的水产蛋白的质量占发酵培养基总质量百分比计，为10%～30%。
5.根据权利要求1所述的一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，其特征在于：所述步骤（3）中营养物为葡萄糖、食品级氯化钙、食品级氯化亚铁和食品级磷酸氢二钾组成的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，食品级氯化钙0.01%～5%，食品级氯化亚铁0.01%～5%，食品级磷酸氢二钾0.01%～5%。
7.根据权利要求1所述的一种无高温处理的制备水产蛋白活性肽方法，其特征在于：所述步骤（4）中枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液的接种量以接入的种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为1%～15%。
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