CN113862208B - 芥子碱降解菌的多级优化筛选方法及得到的芥子碱降解菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芥子碱降解菌的多级优化筛选方法及得到的芥子碱降解菌，包括以下步骤：S1、建立动物模型，在鸡日粮中添加15－25％白芥子饲喂28d及以上；S2、在无菌条件下收集S1的试验鸡肠道内容物，并接种于白芥子液体培养基中培养；S3、取S2中的培养液，并在芥子碱固体培养基上划线，然后置于恒温培养箱培养；S4、在S3的培养基上挑取不同的单一菌落于芥子碱液体培养基中培养即得。本发明首先利用特殊的动物模型创建目标菌种获得条件，再采用独特的分级培养条件创制目标菌种富集纯化培养方法，创立了一套芥子碱降解菌的多级优化筛选模式，能一次性有效筛选出大量芥子碱降解优势菌株，提高了生产效率，解决了现有技术所存在的不足。

Description

芥子碱降解菌的多级优化筛选方法及得到的芥子碱降解菌

技术领域

本发明涉及微生物筛选技术领域，特别涉及一种芥子碱降解菌的多级优化筛选方法及得到的芥子碱降解菌。

背景技术

菜籽粕、白芥子等十字花科类原料因营养全面丰富、来源广泛和价格低廉等特点成为潜在的优势饲料资源。但此类原料中的主要抗营养因子——芥子碱会对动物产生以下抗营养作用：1)芥子碱味道苦涩，严重影响动物采食量；2) 芥子碱可与蛋白质或矿物质形成复合物，从而降低饲料养分的消化吸收率，对动物生长发育和健康造成不良影响；3)芥子碱易被肠道微生物降解为腥味物质，诱发畜禽的鱼腥味综合征，严重影响畜产品品质和人类健康；4)芥子碱具有抗雄激素活性，能抑制精子成熟，引起动物生殖功能障碍。芥子碱的以上抗营养作用极大限制了十字花科原料在工业饲料中的应用，只有最大程度地去除芥子碱，才能提高十字花科植物资源的综合利用价值，从而为开发新型优质饲料资源、缓解我国饲料原料供需矛盾提供技术支撑。微生物发酵法是目前降解抗营养因子的最安全、最有效的手段。有效筛选出具有芥子碱降解功能的微生物，是芥子碱微生物降解的技术基础。

中国专利CN101497867B公开了一种链霉菌的分离培养方法，该方法是从海泥中分离培养出具有抗植物病菌作用的菌种，其培养基组成包括酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯和葡萄糖等多种氮源和糖源，组分多而复杂。中国专利 CN113215056A公开了一种凝结芽孢杆菌的筛选方法，该方法是对已知菌种采用水浴-平板法进行多次重复筛选，重复次数高达49次，循环工序极多。中国专利CN104845918B公开了本项目组前期发明的一种产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离培养方法，该方法从蛋鸡空肠和回肠分离菌株，适宜培养时间大于5天。与本发明相比，筛选的菌株种类单一，发酵培养时间较长，不利于商业化生产。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种芥子碱降解菌的多级优化筛选方法及得到的芥子碱降解菌，本发明首先利用特殊的动物模型创建目标菌种获得条件，再采用独特的分级培养条件创制目标菌种富集纯化培养方法，创立了一套芥子碱降解菌的多级优化筛选模式，能一次性有效筛选出大量芥子碱降解优势菌株，解决了现有技术所存在的不足。

本发明采用的技术方案如下：一种芥子碱降解菌的多级优化筛选方法，包括以下步骤：

S1、一级筛选：建立动物模型，在鸡日粮中添加15-25％白芥子饲喂28d及以上；

S2、二级筛选：在无菌条件下收集S1的试验鸡肠道内容物，并接种于白芥子液体培养基中，然后置于空气摇床于30-45℃培养30-50h；

S3、三级筛选：取S2中的培养液，并在芥子碱固体培养基上划线，然后置于恒温培养箱于30-45℃培养34-60h；

S4、四级筛选：在S3的培养基上挑取不同的单一菌落于芥子碱液体培养基中，置于空气摇床于30-45℃培养20-40h后即得。

在本发明的筛选方法中，建立动物模型的目的在于，激活鸡肠道内能够利用芥子碱的目标菌种，通过在鸡日粮中添加15-20％白芥子饲喂28d以上，就能为获得芥子碱降解菌提供优质的物质基础，而饲喂28d以上是本发明根据动物试验开展14d、21d、28d、35d收集鸡肠道内容物筛菌后的结果来确立的。

作为优选，在S2中，试验鸡肠道内容物来源于试验鸡的盲肠。

在本发明中，所述白芥子液体培养基的制备方法包括以下步骤：

A、将白芥子粉碎后，称取设计量的白芥子粉末，然后加入到水中，在电炉上加热煮沸后再持续煮沸25-50min；

B、用多层纱布过滤除去渣后，得到白芥子汁；

C、向白芥子汁中加入设计量的芥子碱硫氰酸盐，搅匀后即得到白芥子液体培养基。

在本发明白芥子液体培养基的制备方法中，通过向白芥子汁中加入设计量的芥子碱硫氰酸盐可以尽可能准确定位目标优势菌群，提高筛选效率。

作为优选，所述砂布的层数为4层。

进一步，所述步骤A中，白芥子与水的比例为150-250mg：1000mL，具体比例可根据实际情况选择。

进一步，所述芥子碱硫氰酸盐与白芥子汁的比例为150-300mg：100mL，具体比例可根据实际情况选择。

在本发明中，所述芥子碱固体培养基的组成：(NH₄)₂SO₄ 2g_、KI 3g、MgSO₄.7H₂O 1g、MnSO₄·H₂O 1g、NaCl 3g、FeSO₄.7H₂O 0.5g、CuCl₂ 1g、芥子碱硫氰酸盐3.5g、琼脂20g、水1000ml。当然，也可以采用现有的芥子碱固体培养基，具体用量可根据实际情况调整。

本发明还包括一种芥子碱降解菌，所述芥子碱降解菌通过上述多级优化筛选方法筛选得到。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明首先利用特殊的动物模型创建目标菌种获得条件，再采用独特的分级培养条件创制目标菌种富集纯化培养方法，创立了芥子碱降解菌体内激活筛选→在白芥子液体培养基中初筛→芥子碱固体培养基分离纯化→芥子碱液体培养基富集的多级优化筛选方法，能一次性有效筛选出大量芥子碱降解优势菌株，筛选出的菌种可在短时间有效降解芥子碱，提高了生产效率，解决了现有技术所存在的不足。

附图说明

图1和图2是本发明在两种不同处理条件下筛选目标菌的平板对比示意图；其中，图1为实施例，图2为对比例；

图3是本发明的不同实施例菌株在不同培养时间对芥子碱相对浓度的影响示意图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种芥子碱降解菌的多级优化筛选方法，包括以下步骤：

1)一级筛选：建立动物模型，在鸡日粮中添加20％白芥子饲喂14d；

2)二级筛选：无菌条件下收集试验鸡盲肠内容物，接种于白芥子液体培养基中，置于空气摇床37℃培养48h；

3)三级筛选：取2)中培养液在芥子碱固体培养基上划线，置于恒温培养箱37℃培养48h；

4)四级筛选：在3)中培养基上挑取不同的单一菌落于芥子碱液体培养基中，置于空气摇床37℃培养24h，-20℃冰箱保存；

进一步地，在步骤2)中，所述白芥子液体培养基的制备方法为：将新鲜白芥子粉碎后，称取200g白芥子粉末，加入到1000ml蒸馏水中，在电炉上加热煮沸后再持续煮沸30min，然后用4层纱布过滤除去渣获得白芥子汁，量取100ml 白芥子汁，加入220mg芥子碱硫氰酸盐，搅匀后制得白芥子液体培养基。

实施例2

实施例2与实施例1相同，其不同之处在于，实施例2中鸡的饲喂天数为 21d，后续步骤同实施例1。

实施例3(最优例)

实施例3与实施例1相同，其不同之处在于，实施例3中鸡的饲喂天数为 28d，后续步骤同实施例1。

实施例4

实施例4与实施例1相同，其不同之处在于，实施例4中鸡的饲喂天数为 35d，后续步骤同实施例1。

实施例5(次优例)

一种芥子碱降解菌的多级优化筛选方法，包括以下步骤：

1)一级筛选：建立动物模型，在鸡日粮中添加20％白芥子饲喂28d；

2)二级筛选：无菌条件下收集试验鸡盲肠内容物，接种于白芥子液体培养基中，置于空气摇床37℃培养38h；

3)三级筛选：取2)中培养液在芥子碱固体培养基上划线，置于恒温培养箱37℃培养36h；

4)四级筛选：在3)中培养基上挑取不同的单一菌落于芥子碱液体培养基中，置于空气摇床37℃培养30h，-20℃冰箱保存。

进一步地，在步骤2)中，所述白芥子液体培养基的制备方法为：将新鲜白芥子粉碎后，称取180g白芥子粉末，加入到1000ml蒸馏水中，在电炉上加热煮沸后再持续煮沸40min，然后用4层纱布过滤除去渣获得白芥子汁，量取100ml 白芥子汁，加入190mg芥子碱硫氰酸盐，搅匀后制得白芥子液体培养基。

实施例6

一种芥子碱降解菌的多级优化筛选方法，包括以下步骤：

1)一级筛选：建立动物模型，在鸡日粮中添加20％白芥子饲喂35d；

2)二级筛选：无菌条件下收集试验鸡盲肠内容物，接种于白芥子液体培养基中，置于空气摇床37℃培养40h；

3)三级筛选：取2)中培养液在芥子碱固体培养基上划线，置于恒温培养箱37℃培养38h；

4)四级筛选：在3)中培养基上挑取不同的单一菌落于芥子碱液体培养基中，置于空气摇床37℃培养36h，-20℃冰箱保存。

进一步地，在步骤2)中，所述白芥子液体培养基的制备方法为：将新鲜白芥子粉碎后，称取160g白芥子粉末，加入到1000ml蒸馏水中，在电炉上加热煮沸后再持续煮沸45min，然后用4层纱布过滤除去渣获得白芥子汁，量取100ml 白芥子汁，加入170mg芥子碱硫氰酸盐，搅匀后制得白芥子液体培养基。

实施例7

实施例7与实施例3相同，其不同之处在于，实施例7收集的是空肠内容物，其余步骤同实施例3。

实施例8

实施例8与实施例3相同，其不同之处在于，实施例8收集的是回肠内容物，其余步骤同实施例3。

实施例9

实施例9与实施例3相同，其不同之处在于，白芥子液体培养基中不加入芥子碱硫氰酸盐。

功效评价试验1

设计对比试验，对比例为不饲喂白芥子，直接取鸡盲肠内容物，实施例为在鸡日粮中添加20％白芥子饲喂28d后取盲肠内容物，将2种内容物在白芥子液体培养基中培养38h，再将两种菌液分别接种培养于芥子碱固体培养基中培养 36h，肉眼观察2种不同处理条件下目标菌生长情况，结果见图1和图2。

由图1和图2可知，对比例固体培养基上仅有少量菌落，而实施例培养基上长出了大量菌落，结果显示构建前期大量采食白芥子的动物模型，对成功筛选出目标菌株是必要的。

功效评价试验2

采用平板计数法计算实施例3、7和8中菌落数差异，比较肠道中不同取样位置对目标菌生长情况的影响，结果见表1。

表1不同取样位置条件下目标菌的生长情况

组别	取样位置	菌落数(个)
			实施例3	盲肠	14
实施例7	空肠	2
			实施例8	回肠	3

由表1可知，实施例3在鸡盲肠段取样筛选出的芥子碱降解菌更多，说明相比空肠段和回肠段，盲肠段存在更多的芥子碱降解目标菌群。

功效评价试验3

采用单因子试验设计，将实施例1-9制得菌株于芥子碱液体培养基中，空气摇床37℃培养3d。各实施例芥子碱起始浓度相同，记为100％，测定培养后第 1d、2d、3d各实施例培养液中芥子碱的含量，折算为相对浓度，比较不同菌株在不同培养时间对芥子碱的降解效果，见图3。

由图3可知：

(1)与实施例3、4相比，实施例1和实施例2中芥子碱相对浓度在3d内变化不明显，实施例1和实施例2对应菌株的一级筛选中，鸡采食白芥子的时间分别为14d和21d，可能是因为鸡采食白芥子的时间较短，盲肠中芥子碱降解菌的活力没有得到充分激发。结果显示本发明要求的鸡采食白芥子的时间在28d 以上是技术关键点之一。

(2)实施例3、4、5和6获得菌株在3d的时间内均能将芥子碱的相对浓度降低到5％以下，其中实施例3芥子碱的相对浓度仅为1％，说明这几种实施例均实现了短时间有效降解芥子碱的技术目标。

(3)与实施例3相比，实施例7和实施例8芥子碱相对浓度在3d内的降低幅度较小，显示盲肠段筛选出的菌株较空肠段和回肠段筛选出的菌株在短时间降解芥子碱的效果更好。

(4)与实施例3相比，实施例9芥子碱相对浓度在3d内的降低幅度较小，提示在白芥子培养基中加入芥子碱硫氰酸盐能够更准确定位目标优势菌群，提高了筛选效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种芥子碱降解菌的多级优化筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、一级筛选：建立动物模型，在鸡日粮中添加15-25%白芥子饲喂28d及以上；

S2、二级筛选：在无菌条件下收集S1的试验鸡肠道内容物，试验鸡肠道内容物来源于试验鸡的盲肠，并接种于白芥子液体培养基中，然后置于空气摇床于30-45℃培养30-50h；所述白芥子液体培养基的制备方法包括以下步骤：A、将白芥子粉碎后，称取设计量的白芥子粉末，然后加入到水中，在电炉上加热煮沸后再持续煮沸25-50min；B、用多层纱布过滤除去渣后，得到白芥子汁；

C、向白芥子汁中加入设计量的芥子碱硫氰酸盐，搅匀后即得到白芥子液体培养基；

S3、三级筛选：取S2中的培养液，并在芥子碱固体培养基上划线，然后置于恒温培养箱于30-45℃培养34-60h；所述芥子碱固体培养基的组成：(NH₄)₂SO₄为2g、KI为3g、MgSO₄·7H₂O为1g、MnSO₄·H₂O为1g、NaCl为3g、FeSO₄ ·7H₂O为0.5g、CuCl₂为1g、芥子碱硫氰酸盐为3.5g、琼脂为20g、水为1000ml；

S4、四级筛选：在S3的培养基上挑取不同的单一菌落于芥子碱液体培养基中，置于空气摇床于30-45℃培养20-40h后即得。

2.如权利要求1所述的芥子碱降解菌的多级优化筛选方法，其特征在于，所述纱布的层数为4层。

3.如权利要求1所述的芥子碱降解菌的多级优化筛选方法，其特征在于，所述芥子碱硫氰酸盐与白芥子汁的比例为150-300mg：100mL。