CN113845519B - 一种微环境敏感型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微环境敏感型有机小分子荧光探针的设计及生物应用技术领域，公开了一种微环境敏感型荧光探针及其制备方法和应用，通过本发明方法制备得到分子式为C26H18N2OS3和C22H16N2OS2两个微环境敏感型探针。本发明微环境敏感型荧光探针合成简单，对微环境敏感，对HSA检测选择性好，灵敏度高，线性范围宽。此外，利用探针分子在低极性环境中较强的荧光信号，本发明荧光探针也能够靶向低极性的脂滴，并且通过探针分子在癌细胞和正常细胞中的脂滴成像，实现了癌细胞和正常细胞的区分，有能力用于潜在的癌症诊断；更进一步，分子式为C26H18N2OS3的探针分子还成功地用于活体斑马鱼中的脂滴成像。

Description

一种微环境敏感型荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微环境敏感型有机小分子荧光探针的设计及生物应用技术领域，具体为一种微环境敏感型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
细胞的重要组成部分，如蛋白质、核酸、细胞器等都有独特的分子结构并形成特定的生理微环境，如：人血清蛋白(HSA)形成的空腔是典型的低极性环境；癌细胞中，低极性高粘度的脂滴(LDs)数量会增多。当生物大分子、细胞器等浓度异常时，生理微环境会发生变化，引起相关疾病的发生，因此，检测生理微环境的变化非常重要。而微环境敏感型小分子荧光探针越来越成为研究热点之一。对此，有必要发明一种用于检测生理微环境变化的微环境敏感型荧光探针。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种微环境敏感型荧光探针及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供一种微环境敏感型荧光探针，所述探针为D-π-A结构的新型有机小分子荧光探针，具有TICT特征，其分子式为C26H18N2OS3，结构式为
Figure BDA0003270476640000011
或分子式为C22H16N2OS2，结构式为
Figure BDA0003270476640000012
本发明提供一种微环境敏感型荧光探针的制备方法，所述分子式为 C26H18N2OS3，结构式为
Figure BDA0003270476640000021
的微环境敏感型荧光探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1，将4-(二苯基氨基)苯基硼酸，5-溴噻吩-2-甲醛和四三苯基磷钯溶解在1，4-二氧六环(1,4-dioxane)和碳酸钠水溶液组成的混合溶液中，于氮气氛围中持续搅拌加热回流，通过TLC确认反应完成后，将混合物冷却至室温，过滤，收集得到的滤液用二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗涤两次，收集有机相，用无水Na2(SO4)干燥，旋干，柱色谱纯化得到黄色化合物1，即5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛(TPA-TA)；
Figure BDA0003270476640000022
步骤2，将TPA-TA、罗丹宁和尿素溶于无水乙醇中，将混合物搅拌加热回流，通过TLC确认反应完成后，将冷却至室温的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到绿色固体化合物2(TPA-TRDN)，即为所述微环境敏感型荧光探针，
Figure BDA0003270476640000023
本发明提供一种微环境敏感型荧光探针的制备方法，所述分子式为C22H16N2OS2，结构式为
Figure BDA0003270476640000031
的微环境敏感型荧光探针的制备方法包括以下步骤：将对二苯氨基苯甲醛、罗丹宁和尿素溶于无水乙醇中；将上述混合溶液持续搅拌加热回流；通过TLC确认反应完成后，将冷却至室温的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到红色固体(DPAR)，即为所述微环境敏感型荧光探针，
Figure BDA0003270476640000032
进一步，所述步骤1中1，4-二氧六环和碳酸钠水溶液的体积比为3：1，每 1mmol 5-溴噻吩-2-甲醛使用溶剂16mL，5-溴噻吩-2-甲醛：4-(二苯基氨基)苯基硼酸：四三苯基磷钯的摩尔比为1：0.9～1.1：0.055，加热回流时间为22～24h，搅拌转速为600-750rpm，柱色谱纯化的展开剂为乙酸乙酯：石油醚＝1：7，v/v；步骤2中TPA-TA、罗丹宁和尿素的摩尔比为1：0.9～1.1：1～1.5，每1mmol的 TPA-TA用无水乙醇12mL，加热回流时间为15-17h，搅拌转速为600-750rpm。
进一步，所述对二苯氨基苯甲醛：罗丹宁：尿素的摩尔比为0.8～1.1：1： 1.3～1.5，每1mmol的罗丹宁用无水乙醇12mL，加热回流时间为14-16h，搅拌转速为600-750rpm。
本发明还提供一种微环境敏感型荧光探针的应用，可用于对人血清蛋白检测。
本发明还提供一种微环境敏感型荧光探针的应用，可用于特异性脂滴成像。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
1、本发明微环境敏感型荧光探针合成简单，且后续处理过程简单，最终合成的探针混合体系仅需冷乙醇洗涤就可纯化得到探针分子；对微环境极其敏感，在较低极性和较高粘度的环境中具有更强的荧光发射。
2、本发明荧光探针分子可用于对HSA检测，用于检测时的线性范围宽、检出限极其低(探针TPA-TRDN的线性范围为0.00-0.30mg/L，检出限为0.34 μg/L，探针DPAR的线性范围为0.00-0.09mg/L，检出限为0.98μg/L)，具有很高的灵敏度；而且本发明探针分子用于对HSA检测时，不受其它干扰物质的影响，具有高的选择性。
3、本发明探针分子能够靶向低极性的脂滴，并且通过探针分子在癌细胞和正常细胞中的脂滴成像，实现了癌细胞和正常细胞的区分，有能力用于潜在的癌症诊断；更进一步，本发明探针TPA-TRDN还成功地用于活体斑马鱼中的脂滴成像。
附图说明
图1为探针TPA-TRDN的荧光光谱随极性和粘度变化示意图；其中：(a)为探针分子的归一化荧光光谱随不同极性的溶剂变化示意图；(b)为探针分子的荧光光谱随不同比例的1,4-dioxane/H2O变化示意图；(c)为探针分子的荧光光谱随粘度变化示意图；
图2为探针DPAR的荧光光谱随极性和粘度变化示意图；其中：(a)为探针分子的荧光光谱随粘度变化示意图；(b)为探针分子的荧光光谱随极性变化示意图；
图3为探针TPA-TRDN对HSA传感的示意图；其中：(a)为探针分子本身及其加入HSA后的紫外及荧光光谱示意图；(b)为探针分子的荧光光谱随HSA 浓度变化示意图；(c)为探针分子与不同干扰分析物反应前后的荧光强度变化示意图；(d)为探针分子与HSA的对接模拟图；
图4为探针DPAR对HSA传感的示意图；其中：(a)为探针分子本身及其加入HSA后的紫外及荧光光谱示意图；(b)为探针分子的荧光光谱随HSA浓度变化示意图；(c)为探针分子与不同干扰分析物反应前后的荧光强度变化示意图；(d)为探针分子与HSA的对接模拟图；
图5为探针DPAR对HSA在HeLa细胞中的成像研究；HeLa细胞用DPAR (10μM)孵育20min：(a)为橙色通道；(b)为明场；(c)为(a)和(b)的重叠。HeLa 细胞继续与HSA(5μM)一起孵育20min：(d)为橙色通道；(e)为明场；(f)为(d) 和(e)重叠。
图6为探针TPA-TRDN与商业化脂滴染料BODIPY493/503分子在HeLa细胞中的共定位示意图；图中，(a)为TPA-TRDN的红色荧光；(b)为BODIPY 493/503的绿色荧光；(c)TPA-TRDN在绿色和红色通道中跨越细胞某一截面的强度分布图；(d)为(a)和(b)的重叠；(e)为HeLa细胞的明场；(f)为两个通道的强度散点图。条件：(a)λex＝514nm和λem＝550-650nm，(b)λex＝488nm和λem＝500-540nm。
图7为探针DPAR与商业化脂滴染料尼罗红分子在HeLa细胞中的共定位示意图；图中，(a)为DPAR的绿色荧光；(b)为尼罗红的红色荧光；(c)为绿色和红色通道跨越细胞某一截面的强度分布；(d)为(a)和(b)的重叠；(e)为HeLa细胞的明场；(f)为两个通道的强度散点图。条件：(a)λex＝488nm和λem＝500- 600nm，(b)λex＝514nm和λem＝600-670nm。
图8为探针TPA-TRDN在红色通道对癌细胞(A549和HeLa)和正常细胞 (TM3)中的特异性脂滴成像(λex＝514nm)。(a)-(c)为HeLa细胞的成像结果：(a)为红色通道；(b)为部分(a)放大4倍；(c)为复合场。(d) -(f)为A549细胞的成像结果：(d)为红色通道；(e)为部分(d)放大4倍； (f)为复合场。(g)-(i)为TM3细胞的成像结果：(g)红色通道；(h) 部分(g)放大4倍；(i)复合场。
图9为探针DPAR在癌细胞(A549和HeLa)和正常细胞(TM3)中的特异性脂滴成像；(a)-(c)为HeLa细胞的成像结果：(a)为绿色通道；(b)为复合场； (c)为明场。(d)-(f)为A549细胞的成像结果：(d)为绿色通道；(e)为复合场；(f)为明场。(g)-(i)为TM3细胞的成像结果：(g)为绿色通道；(h)为复合场；(i)为明场。
图10为探针TPA-TRDN在癌细胞中随不同浓度的油酸及不同的油酸孵育时间的脂滴成像示意图；A549细胞用50μM油酸处理不同时间：(a)0h，(b)2h， (c)4h；HeLa细胞用不同浓度的油酸处理2h：(d)0μM，(e)50μM，(f) 100μM。
图11为探针DPAR在癌细胞中随不同浓度的油酸及不同的油酸孵育时间的脂滴成像示意图；第一行为A549细胞用50μM油酸处理不同时间(0h、2h、 4h)。第二行为HeLa细胞用不同浓度(0μM、50μM、100μM)的油酸处理2 h。
图12为探针TPA-TRDN对斑马鱼中的脂滴成像示意图；空白对照：(a) 红色通道，(b)复合场。斑马鱼用10μM TPA-TRDN染色5h：(c)红色通道，(d)复合场。(e)随着激光照射扫描时间的增加，TPA-TRDN(10μM)染色的斑马鱼的荧光损失。插图：斑马鱼用激光照射扫描2次和30次。
图13为探针TPA-TRDN的合成路线图；
图14为探针DPAR的合成路线图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1
制备探针TPA-TRDN的化合物1的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，先分别加入4-(二苯基氨基)苯基硼酸(1mmol，0.289g)，5-溴噻吩-2-甲醛 (1mmol，0.191g)和四三苯基磷钯(0.055mmol，0.06g)，再加入12mL的1， 4-二氧六环，4mL的碳酸钠水溶液(2mmol)，将混合物经氮气保护持续加热回流搅拌(600rpm)22小时。通过TLC确认反应完成后，将混合物冷却至室温，将反应液过滤后用二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗涤两次，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，并通过柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚,1/7,v/v)进一步纯化产物，得到黄色固体化合物1(TPA-TA)(0.290g，81.6％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ(600MHz,DMSO)9.87(1H,s),8.01(1H,s), 7.70(2H,d,J7.0),7.61(1H,s),7.36(4H,t,J 6.9),7.13(2H,t,J 7.4),7.11(4H,t, J 8.6),6.96(2H,d,J 7.9)。
实施例2
制备探针TPA-TRDN的化合物1的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，先分别加入4-(二苯基氨基)苯基硼酸(1.1mmol，0.318g)，5-溴噻吩-2-甲醛(1mmol，0.191g)和四三苯基磷钯(0.055mmol，0.06g)，再加入12mL的1，4-二氧六环，4mL的碳酸钠水溶液(2mmol)，将混合物经氮气保护持续加热回流搅拌(650rpm)23小时。通过TLC确认反应完成后，将混合物冷却至室温，将反应液过滤后用二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗涤两次，无水Na2SO4 干燥，减压除去溶剂，并通过柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚,1/7,v/v)进一步纯化产物，得到黄色固体化合物1(TPA-TA)(0.267g，75.2％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ(600MHz,DMSO)9.87(1H,s),8.01(1H,s), 7.70(2H,d,J7.0),7.61(1H,s),7.36(4H,t,J 6.9),7.13(2H,t,J 7.4),7.11(4H,t, J 8.6),6.96(2H,d,J 7.9)。
实施例3
制备探针TPA-TRDN的化合物1的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，先分别加入4-(二苯基氨基)苯基硼酸(0.9mmol，0.260g)，5-溴噻吩-2-甲醛(1mmol，0.191g)和四三苯基磷钯(0.055mmol，0.06g)，再加入12mL的1， 4-二氧六环，4mL的碳酸钠水溶液(2mmol)，将混合物经氮气保护持续加热回流搅拌(750rpm)24小时。通过TLC确认反应完成后，将混合物冷却至室温，将反应液过滤后用二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗涤两次，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，并通过柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚,1/7,v/v)进一步纯化产物，得到黄色固体化合物1(TPA-TA)(0.219g，68.5％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ(600MHz,DMSO)9.87(1H,s),8.01(1H,s), 7.70(2H,d,J7.0),7.61(1H,s),7.36(4H,t,J 6.9),7.13(2H,t,J 7.4),7.11(4H,t, J 8.6),6.96(2H,d,J 7.9)。
实施例4
探针分子TPA-TRDN的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，将 TPA-TA(0.5mmol，0.178g)，罗丹宁(0.45mmol，0.060g)和尿素(0.75mmol，0.045g)溶于6mL无水乙醇中并持续搅拌(600rpm)加热回流15h。通过TLC 确认反应完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到绿色固体化合物2 (TPA-TRDN)(0.151g,71.2％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.77(s,1H),7.87(s,1H),7.70(s,1H),7.65 (d,J＝7.2Hz,2H),7.59(s,1H),7.34(d,J＝6.2Hz,4H),7.12(t,J＝13.2Hz,2H), 7.08(d,J＝7.1Hz,4H),6.95(d,J＝7.7Hz,2H).13CNMR(600MHz,DMSO-d6) δ194.9,169.4,152.0,148.5,146.9,137.9,135.9,130.1,127.4,126.3,125.2,125.0, 124.5,122.4,122.3.MS calcdfor C26H18N2OS3[M-H]-,469.0581；found 469.0509.
实施例5
探针分子TPA-TRDN的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，将 TPA-TA(0.5mmol，0.178g)，罗丹宁(0.5mmol，0.067g)和尿素(0.75mmol， 0.045g)溶于6mL无水乙醇中并持续搅拌(700rpm)加热回流16h。通过TLC 确认反应完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到绿色固体化合物2 (TPA-TRDN)(0.188g,79.8％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.77(s,1H),7.87(s,1H),7.70(s,1H),7.65 (d,J＝7.2Hz,2H),7.59(s,1H),7.34(d,J＝6.2Hz,4H),7.12(t,J＝13.2Hz,2H), 7.08(d,J＝7.1Hz,4H),6.95(d,J＝7.7Hz,2H).13CNMR(600MHz,DMSO-d6) δ194.9,169.4,152.0,148.5,146.9,137.9,135.9,130.1,127.4,126.3,125.2,125.0, 124.5,122.4,122.3.MS calcdfor C26H18N2OS3[M-H]-,469.0581；found 469.0509.
实施例6
探针分子TPA-TRDN的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，将 TPA-TA(0.5mmol，0.178g)，罗丹宁(0.5mmol，0.067g)和尿素(0.5mmol，0.030 g)溶于6mL无水乙醇中并持续搅拌(750rpm)加热回流17h。通过TLC确认完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到绿色固体化合物2 (TPA-TRDN)(0.142g,60.3％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.77(s,1H),7.87(s,1H),7.70(s,1H),7.65 (d,J＝7.2Hz,2H),7.59(s,1H),7.34(d,J＝6.2Hz,4H),7.12(t,J＝13.2Hz,2H), 7.08(d,J＝7.1Hz,4H),6.95(d,J＝7.7Hz,2H).13CNMR(600MHz,DMSO-d6) δ194.9,169.4,152.0,148.5,146.9,137.9,135.9,130.1,127.4,126.3,125.2,125.0, 124.5,122.4,122.3.MS calcdfor C26H18N2OS3[M-H]-,469.0581；found 469.0509.
实施例7
探针DPAR的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，将对二苯氨基苯甲醛(1.0mmol，273.34mg)，罗丹宁(1mmol，134mg)和尿素(1.5mmol，90 mg)溶于12mL无水乙醇中并持续搅拌(750rpm)加热回流12h。通过TLC确认反应完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到红色固体化合物，即所述探针DPAR(316mg,81.5％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.53(s,1H),7.47(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(t,J ＝7.8Hz,4H),7.20(t,J＝7.3Hz,2H),7.16(d,J＝7.9Hz,4H),6.92(d,J＝8.7Hz, 2H).13CNMR(600MHz,DMSO-d6)δ195.7,169.9,150.0,145.8,132.9,132.2, 130.4,126.4,125.6,125.4,119.8.MS calcd for C22H16N2OS2[M-H]-387.0626,found 387.0625.
实施例8
探针DPAR的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，将对二苯氨基苯甲醛(1.1mmol，300mg)，罗丹宁(1mmol，134mg)和尿素(1.4mmol，84mg) 溶于12mL无水乙醇中并持续搅拌(650rpm)加热回流13h。通过TLC确认反应完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到红色固体化合物，即所述探针DPAR(294mg,75.8％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.53(s,1H),7.47(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(t,J ＝7.8Hz,4H),7.20(t,J＝7.3Hz,2H),7.16(d,J＝7.9Hz,4H),6.92(d,J＝8.7Hz, 2H).13CNMR(600MHz,DMSO-d6)δ195.7,169.9,150.0,145.8,132.9,132.2, 130.4,126.4,125.6,125.4,119.8.MS calcd for C22H16N2OS2[M-H]-387.0626,found 387.0625.
实施例9
探针DPAR的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，将对二苯氨基苯甲醛(0.8mmol，219mg)，罗丹宁(1mmol，134mg)和尿素(1.3mmol，78mg) 溶于12mL无水乙醇中并持续搅拌(700rpm)加热回流14h。通过TLC确认反应完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到红色固体化合物，即所述探针DPAR(211mg,68.1％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.53(s,1H),7.47(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(t,J ＝7.8Hz,4H),7.20(t,J＝7.3Hz,2H),7.16(d,J＝7.9Hz,4H),6.92(d,J＝8.7Hz, 2H).13CNMR(600MHz,DMSO-d6)δ195.7,169.9,150.0,145.8,132.9,132.2, 130.4,126.4,125.6,125.4,119.8.MS calcd for C22H16N2OS2[M-H]-387.0626,found 387.0625.
实施例10
探针DPAR的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，将对二苯氨基苯甲醛(0.9mmol，246mg)，罗丹宁(1mmol，134mg)和尿素(1.5mmol，90mg) 溶于12mL无水乙醇中并持续搅拌(750rpm)加热回流15h。通过TLC确认反应完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到加热红色固体化合物，即所述探针DPAR(252mg,72.3％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.53(s,1H),7.47(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(t,J ＝7.8Hz,4H),7.20(t,J＝7.3Hz,2H),7.16(d,J＝7.9Hz,4H),6.92(d,J＝8.7Hz, 2H).13CNMR(600MHz,DMSO-d6)δ195.7,169.9,150.0,145.8,132.9,132.2, 130.4,126.4,125.6,125.4,119.8.MS calcd for C22H16N2OS2[M-H]-387.0626,found 387.0625.
实施例11
探针DPAR的合成：在装有磁力搅拌器的25mL三口瓶中，将对二苯氨基苯甲醛(0.9mmol，246mg)，罗丹宁(1mmol，134mg)和尿素(1.3mmol，78mg) 溶于12mL无水乙醇中并持续搅拌(600rpm)加热回流16h。通过TLC确认反应完成后，将冷却的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到红色固体化合物，即所述探针DPAR(247mg,70.6％)。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.53(s,1H),7.47(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(t,J ＝7.8Hz,4H),7.20(t,J＝7.3Hz,2H),7.16(d,J＝7.9Hz,4H),6.92(d,J＝8.7Hz, 2H).13CNMR(600MHz,DMSO-d6)δ195.7,169.9,150.0,145.8,132.9,132.2, 130.4,126.4,125.6,125.4,119.8.MS calcd for C22H16N2OS2[M-H]-387.0626,found 387.0625.
实施例12
探针分子对微环境敏感性的研究：为测试探针分子对微环境的敏感性，对不同极性、粘度体系中探针的光谱性质进行了研究。
研究结果表明：
探针TPA-TRDN：1)在不同极性的溶剂(从甲苯到二氯甲烷)中，随着极性增加，荧光最大发射波长从575nm变化到641nm，发生红移，如图1中 (a)； 2)在1，4-二氧六环和水的混合体系中，随着极性增加(水比例的增加)，荧光强度降低(纯的1，4-二氧六环中，荧光量子产率约为10.1％，而纯水中几乎没有荧光发射)，最大发射波长从100％1，4-二氧六环到100％水红移了大约54nm，如图1中 (b)；3)在甘油和甲醇的混合体系中，随着粘度的增加(甘油比例的增加)，荧光最大发射波长轻微蓝移并荧光强度逐渐增强，如图1中 (c)；这些结果表明探针TPA-TRDN中存在TICT现象，并且在较低极性和较高粘度的环境中具有更强的荧光发射。
探针DPAR：1)在甘油和水的混合体系中，随着粘度的增加(甘油比例的增加)，荧光最大发射波长轻微蓝移且荧光强度逐渐增强(大约增强了7倍)，如图2中 (a)；(2)在1，4-二氧六环和水的混合体系中，随着极性降低(水比例的减少)，荧光最大发射波长从606nm变化到549nm，发生蓝移，且荧光强度也有41倍的增加，如图2中 (b)。上述结果表明探针DPAR中存在TICT现象，并且在较低极性和较高粘度的环境中具有更强的荧光发射。
实施例13
探针分子对HAS传感的研究：
探针TPA-TRDN：
1、在含有10％CH3CN的PBS(pH 7.4,20mM)缓冲溶液中研究了探针分子(10μM)对HSA的响应。由图3中 (a)可知，探针在502nm(ε＝2.78×104L/M-1 cm-1)出现最大吸收，用HSA(0.20mg/mL)处理后，最大吸收蓝移至472nm (ε＝3.20×104L/M-1cm-1)，同时溶液颜色在可见光下由红色变为黄色。当激发波长为497nm时，探针本身发射非常微弱，与0.20mg/mLHSA相互作用后，在610nm处出现强发射信号。说明探针分子能够对HSA响应。
2、紧接着对探针分子对不同浓度HSA条件下荧光强度变化进行了研究，由图3中(b)可知，检测HSA的线性范围为0.00-0.30mg/L，检出限为0.34μg/L，说明本发明荧光探针分子对不同浓度的HSA表现出了较高的灵敏度。
3、探针分子对HSA的选择性研究。为测试探针分子对HSA的选择性，将探针分子与不同的氨基酸和蛋白(Histidine,Glutamic acid,Asparagine,Valine, Phenylalanine,Tyrosine,Alanine,Serine,Leucine,Arginine,Proline,Threonine, Glutamine,Tryptophan,Isoleucine,Lysine,Cysteine,Homocysteine,Glutathione, α-Chymotrypsin,aprotinin,casein,γ-globulin,pepsin,hemoglobin,lysozyme,BSA,HSA)反应前后的荧光强度的变化进行了实验研究，HSA和BSA的浓度为5 μM，其余干扰物的浓度均为100μM。由图3中 (c)可知，探针分子对HSA的检测不受其他分析物的干扰，具有高度的选择性。
4、为了进一步验证探针分子和HSA的结合机理，进行了分子对接模拟，对接模拟图如图3中 (d)所示，详细分析报告表明，探针分子通过疏水相互作用、阳离子-π相互作用、CH-π相互作用和π-π堆积作用结合到HSA的IB亚域中，限制了其TICT过程，从而使其荧光增强。
探针DPAR：
1、在PBS(pH 7.4,20mM)缓冲溶液中研究了探针分子(10μM)对HSA 的响应。由图4中 (a)可知，探针在468nm(ε＝2.26×104L/M·cm)出现最大吸收，用HSA(0.10mg/mL)处理后，最大吸收蓝移至448nm(ε＝2.37×104L/M·cm)，同时溶液颜色在可见光下由粉色变为黄色。当激发波长为485nm时，探针本身由于其TICT特性在610nm处有非常微弱的荧光，荧光量子产率
Figure BDA0003270476640000141
仅为0.71％。与0.10mg/mL HSA相互作用后，在597nm处出现强发射信号，荧光强度大约增加了7倍，
Figure BDA0003270476640000142
也增至5.97％，荧光寿命从1.39ns延长到1.79ns，在365nm紫外灯下溶液颜色从粉红色变为橙色。这一系列实验结果说明探针分子能够对 HSA响应。
2、接着对探针分子对不同浓度HSA条件下荧光强度变化进行了研究，由图4中 (b)可知，检测HSA的线性范围为0.00-0.09mg/L，检出限为0.98μg/L，说明本发明荧光探针分子对不同浓度的HSA表现出了较高的灵敏度。
3、探针分子对HSA的选择性研究，为测试探针分子对HSA的选择性，将探针分子与不同的干扰离子(Ag+,Zn2+,Mn2+,Ba2+,Fe3+,Hg2+,ClO4-,HSO3-,S2O3 2-, CH3COO-,S2O7 2-,SCN-)氨基酸(Histidine,Glutamate,Asparagine,Cysteine, Homocysteine,Glutathione)和蛋白(α-Chymotrypsin,Aprotinin,Casein,γ-globulin, Pepsin,Hemoglobin,Lysozyme,BSA)反应前后的荧光强度的变化进行了实验研究，HSA和BSA的浓度为5μM，其余干扰物的浓度均为100μM。由图4中 (c) 可知，探针分子对HSA的检测不受其他分析物的干扰，具有高度的选择性。
4、为了验证探针分子和HSA的结合机理，进行了分子对接模拟，对接模拟图如图4中 (d)所示，详细分析报告表明，探针分子通过疏水相互作用、氢键和阳离子-π相互作用结合到HSA的IB亚域中，限制了其TICT过程，从而使其荧光增强。
实施例14
探针分子在实际样尿液样本中对HSA的检测研究：由于探针对HSA的快速响应，其可以用于实际样中对HSA的检测，收集尿液样本将其稀释100倍以去除背景干扰，然后将已知不同浓度的HSA标准溶液分别加入到尿液样本中，根据荧光滴定的线性拟合方程，获得其回收率。表1为探针TPA-TRDN对HSA 在实际尿液样本中的检测的回收率结果；表2为探针DPAR对HSA在实际尿液样本中的检测的回收率结果。
表1探针TPA-TRDN的回收率结果
Figure BDA0003270476640000151
表2探针DPAR的回收率结果
Figure BDA0003270476640000161
由表1可得，在实际样尿液样本中添加不同浓度的HSA，探针TPA-TRDN 检测的的回收率为99.3％-103.2％；由表2可得，在实际样尿液样本中添加不同浓度的HAS，探针DPAR检测的的回收率91.38％-103.5％。说明了本发明探针分子TPA-TRDN和DPAR均可以应用于实际样中对HSA的检测。
实施例15
探针DPAR对HSA在HeLa细胞中的成像研究：为测试探针分子对HSA在 HeLa细胞中的成像，分别对探针分子本身及加入HSA(5μM)孵育20min后在共聚焦显微镜下进行了细胞成像研究，激发波长设定为514nm，收光范围为 550-650nm。如图5，由此可知，探针分子DPAR可以在橙色荧光通道对HSA 进行细胞成像。
实施例16
探针分子对细胞中脂滴的共定位成像研究：为测试探针分子对脂滴的特异性，对于探针TPA-TRDN：使用探针分子(λex＝514nm，550-650nm)先对HeLa 细胞孵育30分钟，随后加入商用脂滴染料BODIPY 493/503(λex＝488nm，500-540 nm)继续在HeLa细胞中染色15min；对于探针DPAR：使用探针分子(λex＝488 nm，500-600)先对HeLa细胞孵育30min，随后加入商用脂滴染料尼罗红(λex＝514 nm，600-670nm)继续在HeLa细胞中染色10min。
探针TPA-TRDN的染色结果如图6所示，可以看到有许多荧光强度较强的孤立点，表明LDs的特征结构，此外，商业染料BODIPY 493/503的绿色荧光可以与探针分子的红色荧光重叠变成黄色荧光，Pearson共定位系数R达到0.94，验证了探针分子TPA-TRDN具有良好的靶向LDs的能力。
探针DPAR的染色结果如图7所示，可以看到有许多荧光强度较强的孤立点，表明LDs的特征结构，此外，商业染料尼罗红的红色荧光可以与探针分子的绿色荧光重叠变成黄色荧光，Pearson共定位系数R达到0.89，验证了探针分子DPAR具有良好的靶向LDs的能力。
实施例17
探针分子在癌细胞和正常细胞中脂滴的特异性成像研究：将探针 TPA-TRDN的激发波长设定为514nm,收光范围为550-650nm；探针DPAR的激发波长设定为488nm,收光范围为500-600nm来研究探针分子TPA-TRDN 和DPAR在癌细胞和正常细胞中脂滴的特异性成像情况。
探针TPA-TRDN的成像结果如图8所示，可得在癌细胞(HeLa和A549) 中，有明显的红色脂滴特征的荧光点，而正常细胞TM3中，几乎没有荧光出现。表明探针分子可以实现癌细胞和正常细胞的区分。
探针DPAR的成像结果如图9所示，可得在癌细胞(HeLa和A549)中，有明显的绿色脂滴特征的荧光点，而正常细胞TM3中，几乎没有荧光出现。表明探针分子可以在绿色荧光通道实现癌细胞和正常细胞的区分。
实施例18
由于油酸可作为一种刺激细胞中脂滴产生的物质，因此本实施例对探针 TPA-TRDN和探针DPAR在癌细胞中随不同浓度的油酸及不同的油酸孵育时间的脂滴成像进行了研究。
探针TPA-TRDN的研究结果如图10所示，探针DPAR的研究结果如图11 所示，表明随着油酸浓度或者时间的增加，探针荧光强度均增强，进一步说明探针分子TPA-TRDN和DPAR可以对脂滴进行特异性成像以及定量监测细胞中的脂滴含量。
实施例19
探针TPA-TRDN对活体斑马鱼中脂滴成像的研究：将三天龄的斑马鱼用探针TPA-TRDN孵育5h后，共聚焦显微镜下成像。如图12所示，斑马鱼全身都有明亮的红色荧光，为进一步验证该探针分子用于活体成像的光稳定性，于514 nm的激发波长下，共聚焦激光在15min内连续扫描斑马鱼30次，由扫描结果可以看出该探针具有非常好的光稳定性，表明探针分子可以用于对斑马鱼中的脂滴特异性成像。

Claims (4)

1.一种微环境敏感型荧光探针，其特征在于：所述探针为D-π-A结构的有机小分子荧光探针，具有TICT特征，其分子式为C26H18N2OS3，结构式为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种微环境敏感型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述分子式为C26H18N2OS3，结构式为
Figure 497128DEST_PATH_IMAGE002
的微环境敏感型荧光探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1，将4-(二苯基氨基)苯基硼酸 ，5-溴噻吩-2-甲醛和四三苯基磷钯溶解在1，4-二氧六环和碳酸钠水溶液组成的混合溶液中，于氮气氛围中持续搅拌加热回流，通过TLC确认反应完成后，将混合物冷却至室温，过滤，收集得到的滤液用二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗涤两次，收集有机相，用无水Na2(SO4)干燥，旋干，柱色谱纯化得到黄色化合物1， 即5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛；
Figure 148689DEST_PATH_IMAGE003
步骤 2，将5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛、罗丹宁和尿素溶于无水乙醇中，将混合物搅拌加热回流，通过TLC确认反应完成后，将冷却至室温的混合物过滤，用冷乙醇洗涤得到绿色固体化合物2：TPA-TRDN ，即为所述微环境敏感型荧光探针，
Figure DEST_PATH_IMAGE004
所述步骤1中1，4-二氧六环和碳酸钠水溶液的体积比为3：1，每1 mmol 5-溴噻吩-2-甲醛使用溶剂16 mL，5-溴噻吩-2-甲醛：4-(二苯基氨基)苯基硼酸：四三苯基磷钯的摩尔比为1：0.9~1.1：0.055，加热回流时间为22~24 h，搅拌转速为600-750 rpm，柱色谱纯化的展开剂为乙酸乙酯：石油醚=1：7，v/v；步骤2中5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛、罗丹宁和尿素的摩尔比为1：0.9~1.1：1~1.5，每1mmol的5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛用无水乙醇12 mL，加热回流时间为15-17 h，搅拌转速为600-750 rpm。
3.一种制备如权利要求1所述微环境敏感型荧光探针的应用，其特征在于：可用于对人血清蛋白检测。
4.一种制备如权利要求1所述微环境敏感型荧光探针的应用，其特征在于：可用于特异性脂滴成像。
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