CN104263353A - 一种用于硫化氢检测的比率型荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于硫化氢检测的比率型荧光探针及其制备方法。该探针的化合物为2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯。制备时，将4-溴-1,8-萘二甲酸酐与2-氨基乙醇反应得到固体6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮，产物与叠氮化钠反应得到固体6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮；再经过系列反应，得到固体探针化合物。该探针化合物由疏水的四苯基乙烯基和亲水的含叠氮基的识别基团构成，可用于化学、生物、环境等样品中硫化氢的定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光探针化合物，特别是涉及一种用于硫化氢检测的荧光探针及其制备方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
硫化氢是一种易燃的酸性气体、易溶于水，浓度低时带恶臭，气味如臭蛋；浓度高时反而没有气味，因为高浓度的硫化氢可以麻痹嗅觉神经；它是一种急性剧毒物质，吸入少量高浓度硫化氢可于短时间内致命，长期暴露于硫化氢气体会使人的嗅觉神经系统麻醉。硫化氢在自然界中存在于原油、天然气、火山气体和温泉之中，它也可以在细菌分解有机物的过程中产生。硫化氢还存在于多种生产过程中，例如采矿和有色金属冶炼，煤的低温焦化，含硫石油开采、提炼，橡胶、制革、染料、制糖、药物生产等工业中都有硫化氢产生，开挖和整治沼泽地、沟渠、印染、下水道、隧道以及清除垃圾、粪便等作业常伴有硫化氢存在，由于硫化氢易溶于水，所以它广泛地存在于废水中。近年来的研究表明，硫化氢还存在于哺乳动物体内，是一种重要的气体信号分子，具有舒张血管、调节血压等多种生理功能；然而当硫化氢在体内的含量过高时，它会诱发多种疾病，并可使细胞中毒死亡。因此，灵敏、可靠的硫化氢的检测具有重要意义。
迄今为止，国内外研究人员对硫化氢的检测进行了大量的研究。常用的硫化氢的检测方法主要有电化学方法、比色法、荧光法等。电化学方法用于测定硫化氢(例如美国专利US20090184005A1)，主要是利用硫化氢还原电解质中的亚铁氰化钾，从而导致流经两电极的电流的变化，并以电流变化值来评价硫化氢的量；但是电化学方法的易受样品中存在的其他还原性和/或氧化性物质的干扰，因此检测的准确性难以保证。比色法(例如发表论文Analyst,2012,137,5576)，制备了含有三腈基乙烯的化合物，利用了亲核的SH-基团与三腈基乙烯基团中供电子的双键发生加成反应，使得其与H2S反应后在527nm处的吸收强度发生了明显下降，同时溶液的颜色由红色逐渐变为无色，从而实现了对硫化氢的比色法检测。荧光法在分析检测上具有识别响应快、专一性好、选择性高、使用方便等特点；荧光探针在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测样品的需要；非常适合硫化氢的分析检测。然而，目前常规的检测硫化氢的荧光法主要是荧光增强型或荧光淬灭型，这些方法易受干扰(例如激发光强、样品浓度、样品中存在的荧光增强杂质或淬灭剂等)，因此难以保障检测的准确性。例如，荧光增强型检测硫化氢的方法(例如发表论文Chem.Commun.,2012,48,4767–4769)，合成了一种在4号位上含有叠氮基团的萘酰亚胺的荧光探针，该探针分子在435nm处基本没有吸收，当叠氮基团与H2S反应后，即萘酰亚胺的4号位由叠氮基团变为氨基，435nm处吸收大幅增加，从而在435nm的激发光照射下，荧光强度明显增加，实现了对硫化氢的荧光增强型检测。中国专利CN201010300714.6制备了PbO/Si2O结构的铅硅氧化物，该氧化物在290nm的激发光照射下，可在500nm–650nm波长范围发射荧光，而硫化氢和铅硅氧化物反应可使荧光淬灭，从而实现了对硫化氢的荧光淬灭型检测。由上可见，本领域急需发展抗干扰能力强、准确度高的简便的硫化氢检测方法。
发明内容
本发明所要解决技术问题就是提供一种以聚集的四苯基乙烯基为能量供体，通过能量转移方式对硫化氢实现比率型荧光检测的荧光探针。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种用于硫化氢检测的比率型荧光探针，该探针的化合物为2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯，具有如下结构式：
本发明探针化合物的合成路线图如图1所示，具体而言，所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，包含以下步骤：
1)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于乙醇，搅拌条件下，在氮气保护下滴加2-氨基乙醇；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与2-氨基乙醇的摩尔比为1:1.1-1.2；将混合溶液加热至回流，控制温度为80℃-85℃；冷却至室温后，过滤并收集析出物，将析出物用乙醇重结晶，得到固体6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮；
将所述固体6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮与叠氮化钠溶于N,N-二甲基甲酰胺中，溶液在加热条件下搅拌反应，加热温度为100℃-110℃，反应(8-10)小时；冷却至室温，加入去离子水，然后用乙酸乙酯进行萃取；收集有机相，将有机相用盐水洗涤，干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化，得到固体6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮；所述6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮与叠氮化钠的摩尔比1:10-1：12；
2)将二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮溶于四氢呋喃中，冰浴条件下加入锌粉，滴加将四氯化钛，撤去冰浴，先室温下反应(0.5-1)小时，而后加热回流(10-15)小时，控制温度为67℃-70℃；冷却至室温后，加入碳酸钾水溶液洗涤，用乙酸乙酯萃取，有机相再用盐水洗涤，干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化，得到固体4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚；所述4-羟基二苯甲酮与二苯甲酮的用量摩尔比为(1.1-1.2):1；锌粉与4-羟基二苯甲酮用量的摩尔比为(2-2.5):1；四氯化钛与锌粉摩尔比为(0.5-0.6):1；
将4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚和3-溴-1-丙炔溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入碳酸钠，然后加热反应过夜，加热温度为60℃-80℃；冷却至室温后，旋转蒸发除去有机溶剂，用二氯甲烷/去离子水萃取，水层用二氯甲烷洗涤，收集有机相，干燥，过滤；旋转蒸发除去滤液中的溶剂，得到褐色油状物经硅胶层析柱纯化，得到浅褐色固体2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯；所述3-溴-1-丙炔与4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚的摩尔比为(1.1-1.2):1；碳酸钠与3-溴-1-丙炔的摩尔比为(1-1.05):1；
将2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯和2-叠氮基乙醇溶于四氢呋喃中，加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠，然后加热反应，加热温度为35℃-45℃，反应时间为20-24小时；冷却至室温，旋转蒸发除去四氢呋喃后，用二氯甲烷/去离子水萃取，收集有机相，干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化，得到固体2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇；所述2-叠氮基乙醇、五水硫酸铜和抗坏血酸钠与2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯用量的摩尔比分别为(2.5-3):1、(0.1-0.15):1和(0.2-0.3):1；
将2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇和丁二酸酐溶于二氯甲烷中，加入4-二甲胺基吡啶，室温下反应；旋转蒸发除去溶剂，得到固体4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸；丁二酸酐和4-二甲胺基吡啶与2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基-1,2,3-三氮唑-乙醇的摩尔比分别为(1-1.05):1和(0.05-0.06):1；
3)将4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸和6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮溶于四氢呋喃中，加入4-二甲胺基吡啶和N,N’-二异丙基碳二亚胺，加热反应过夜，加热温度为30℃-35℃；反应时间为(16-20)小时；冷却至室温，旋转蒸发除去有机溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用去离子水萃取两次，盐水萃取，收集有机相干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化，得到固体探针化合物2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯；所述6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮、N,N'-二异丙基碳二亚胺与4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸的摩尔比分别为(1-1.2):1和(1.2-1.5):1；所述4-二甲胺基吡啶与N,N'-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为(0.05-0.06):1。
为进一步实现本发明目的，优选地，将固体探针化合物2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯溶于四氢呋喃中，然后在搅拌条件下将溶液滴加入水中，旋转蒸发除去四氢呋喃；然后用透析袋对产品透析，透析时间为48-60小时，每隔4-6小时换一次水，制得TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针分散液。所述透析袋截止分子量优选为500Da。
步骤1)、步骤2)和步骤3)所述的干燥为用无水硫酸镁进行干燥。
每mmol的4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入乙醇20mL-23mL。
每mmol 6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮加入N,N-二甲基甲酰胺10mL-12mL；每mmol 4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚加入N,N-二甲基甲酰胺的用量范围是5-6mL。
所述步骤1)、步骤2)和步骤3)所述的盐水为质量百分浓度5％-10％的氯化钠溶液；所述碳酸钾溶液的质量浓度为5％-10％。
每mmol二苯甲酮加入四氢呋喃10-12mL；每mmol的2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯加入四氢呋喃5-6mL；每mmol 4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸加入四氢呋喃20-25mL。
每mmol 2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基-1,2,3-三氮唑-乙醇加入二氯甲烷15-20mL。
本发明所得产物探针化合物2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯(TPE-NAP-N3)，分子式为C49H39N7O7，相对分子质量为837.88。TPE-NAP-N3为浅黄色无味固体粉末，溶于水，易溶于乙醇，氯仿等溶剂。该化合物光稳定性好，无毒，也具有良好的生物相容性。由于四苯基乙烯具有聚集诱导发光的特性，四苯基乙烯(TPE)在聚集状态时，在340nm的激发光照射下，在470nm左右发射蓝色荧光。而识别基团在可见光区无吸收、也不发射荧光。当识别基团与硫化氢反应后，其叠氮基转变为氨基，由此其可吸收470nm左右的光，且在540nm左右发射绿色荧光。本发明荧光探针可用于生物样品、环境样品、化学样品中硫化氢的定量分析。
相对于现有技术，本发明提供的探针，突出优点是：
(1)本发明的探针化合物由疏水的四苯基乙烯基部分和亲水的含叠氮基的萘酰亚胺识别基团构成。该探针化合物在水中时，疏水的四苯基乙烯基部分由于疏水作用和π-π相互作用，易于聚集，由此聚集的四苯基乙烯基构成纳米粒子的核，亲水的含叠氮基的萘酰亚胺识别基团构成纳米粒子的外围。
(2)四苯基乙烯基在非聚集状态时，不发射荧光；在聚集状态时，在340nm的激发光照射下，在470nm左右发射蓝色荧光。而识别基团在可见光区无吸收、也不发射荧光。当识别基团与硫化氢反应后，其叠氮基转变为氨基，由此其可吸收470nm左右的光、且在540nm左右发射绿色荧光。由此聚集的四苯基乙烯构成了能量转移的供体，而识别基团与硫化氢反应后形成的基团构成了能量转移的受体；随着硫化氢的量的增大，蓝色荧光逐渐降低，绿色荧光逐渐增强，绿色荧光和蓝色荧光的比值可作为检测信号，因此可实现对硫化氢的比率型荧光检测。由于这种荧光共振能量转移过程中，两种荧光团并非独立地发射各自的荧光，因此能量转移过程中可观察到相互关联的双发射波长，从而满足双信息通道的要求；而且，与检测识别事件无关的外部因素对两者的荧光信号强度的影响是一致的，所以，外部因素是很难影响FRET体系中两种荧光强度的比率，这种模式可极大地降低外部因素的影响，提高检测精度和准确性。
(3)以纳米粒子荧光探针对硫化氢进行检测，由于纳米粒子的比表面积较大，因此每个纳米粒子可有多个识别基团位于纳米粒子的球形外围，有利于识别基团与被检测物充分接触，进而提高检测灵敏度。四苯基乙烯基的疏水性质和π-π相互作用使其易于形成聚集体，利用这种特性制备纳米粒子的工艺简单、方便，运用该方法构建了一种新的灵敏度高、准确性高的检测硫化氢的方法。本发明的检测体系使用方便，便于推广应用。
附图说明
图1为本发明探针化合物的合成路线图。
图2为实施例1中6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮的核磁共振氢谱图。
图3为实施例1中6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮核磁共振氢谱图。
图4为实施例1中6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮的质谱图。
图5为实施例1中4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚的核磁共振氢谱图。
图6为实施例1中4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚的质谱图。
图7为实施例1中2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯的核磁共振氢谱图。
图8为实施例1中2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇的核磁共振氢谱图。
图9为实施例1中4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸的核磁共振氢谱图。
图10为实施例1中2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯的核磁共振氢谱图。
图11为实施例1中2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯的质谱图。
图12为荧光探针在HEPES缓冲液中在有无硫化氢存在时的荧光光谱图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1：探针化合物TPE-NAP-N3的制备工艺流程1
1)将1305mg的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(4.71mmol)溶于108mL乙醇中，在氮气保护下缓慢滴加317mg的2-氨基乙醇(5.19mmol)，搅拌条件下，将混合溶液加热回流；冷却至室温后，过滤并收集析出物，将析出物用乙醇重结晶，得到白色固体6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮1254mg(产率为83.2％)。通过核磁共振氢谱(图2)对该产物进行表征，1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):8.48-8.50(d,1H),8.44-8.46(d,1H),8.24-8.26(d,1H),8.13-8.15(d,1H),7.92-7.96(t,1H),4.80-4.83(t,1H),4.11-4.13(t,2H),3.62-3.65(t,2H)。其中，8.48ppm、8.44ppm、8.24ppm、8.13ppm以及7.92ppm对应的是萘环上质子的特征峰，4.81ppm处对应的是羟基质子特征峰,而4.11ppm、3.62ppm则分别对应了两个亚甲基质子的特征峰，通过分析可以确定所合成的产物为目标中间体。
将320mg上述白色固体(1.0mmol)与650mg叠氮化钠(12mmol)溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌条件下，溶液加热至105℃，并保持10小时；冷却至室温，加入40mL去离子水，然后用100mL乙酸乙酯进行萃取。收集有机相，将有机相用盐水洗涤，用200mg无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为甲醇/二氯甲烷，V/V＝20:1)，得到浅黄色固体6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮233mg(产率为82.6％)。通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):8.46-8.48(d,1H),8.38-8.40(d,1H),8.33-8.35(d,1H),7.79-7.83(t,1H),7.67-7.69(d,1H),4.79-4.82(t,1H),4.11-4.12(t,2H),3.61-3.64(t,2H)。其中，8.46ppm、8.38ppm,8.33ppm、7.79ppm,以及7.67ppm分别对应萘环上质子的特征峰，4.79ppm对应羟基质子的特征峰,而4.11ppm和3.61ppm分别对应两个亚甲基质子的特征峰。另外，通过质谱进行了辅助证明，MS(ESI):m/z 305.2[M+Na]+。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。核磁共振氢谱图以及质谱图如图3和图4所示。
2)将1820mg的二苯甲酮(10mmol)和2376mg的4-羟基二苯甲酮(12mmol)溶于120mL四氢呋喃中，将溶液降温至0℃，加入1950mg锌粉(30mmol)，而后将2.1mL四氯化钛(18mmol)缓慢滴加进去，加入完毕后撤去冰浴，室温下反应0.5小时，然后再回流加热12小时；冷却至室温后，加入10％的碳酸钾的水溶液，用乙酸乙酯萃取三次，有机相再用盐水洗涤两次，用无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/60-90℃馏分石油醚，V/V＝4:1)，得到浅黄色固体产物4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚1440mg(产率为41.4％)。通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):9.34(s,1H),7.06-7.14(m,9H),6.93-6.98(m,6H),6.73-6.75(d,2H),6.47-6.52(d,2H)。其中，9.34ppm为酚羟基质子的特征峰,7.14ppm-6.47ppm为四苯基乙烯上质子的特征峰。另外，也通过质谱进行了辅助证明，MS(ESI):m/z 346.8[M-H]-。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。核磁共振氢谱图以及质谱图如图5和图6所示。
将1000mg的4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚(2.87mmol)和409mg的3-溴-1-丙炔(3.44mmol)溶于17.2mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入383mg的碳酸钠(3.61mmol)，然后加热至65℃，反应过夜；冷却至室温后，旋转蒸发除去有机溶剂，用二氯甲烷/去离子水萃取，水层用二氯甲烷洗涤三次，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去滤液中的溶剂，得到褐色油状物经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/石油醚，V/V＝1:1)，得到浅褐色固体2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯934mg(产率为84.2％)。通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.08-7.18(m,9H),6.94-6.99(m,6H),6.83-6.85(d,2H),6.66-6.68(d,2H),4.51-4.65(d,2H),2.47-2.53(t,1H)。其中，7.18ppm-6.66ppm为四苯基乙烯上质子的特征峰,4.61ppm对应的是亚甲基上质子的特征峰,2.49ppm对应的是炔基上质子的特征峰。通过核磁的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。核磁共振氢谱图如图7所示。
将772mg的2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯(2mmol)和522mg的2-叠氮基乙醇(6.0mmol)溶于12mL四氢呋喃中，加入75mg五水硫酸铜(0.3mmol)，119mg抗坏血酸钠(0.6mmol)，然后加热至40℃；反应24小时，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，用二氯甲烷/去离子水萃取，二氯甲烷相用水萃取三次，收集有机相加入无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/甲醇，V/V＝40:1)，得到浅褐色固体2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇687mg(产率为72.5％)。通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):7.63-7.73(s,1H),7.29-7.34(m,9H),7.08–7.15(m,6H),6.83-6.85(d,2H),6.56-6.68(d,2H),5.06-5.12(s,2H),4.44-4.51(t,2H),4.03-4.10(t,2H)。其中，7.69ppm处对应的是三氮唑基团上质子的特征峰，7.34ppm-6.56ppm对应的是四苯基乙烯上质子的特征峰，5.10ppm、4.47ppm以及4.06ppm分别对应的是三个亚甲基上质子的特征峰。通过核磁的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。核磁共振氢谱图如图8所示。
将473mg的2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇(1mmol)和105mg的丁二酸酐(1.05mmol)溶于20mL二氯甲烷中，加入7.3mg的4-二甲胺基吡啶(0.06mmol)，室温下反应24小时；旋转蒸发除去溶剂，得到浅褐色固体4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸484mg(产率为84.4％)。通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.27-8.33(s,1H),7.15-7.28(m,9H),7.01-7.10(m,6H),6.94-7.00(d,2H),6.87-6.92(d,2H),5.09-5.15(s,2H),4.68-4.76(t,2H),4.47-4.54(t,2H),2.53-2.60(m,4H)。其中，8.31ppm对应的是三氮唑基团上质子的特征峰，7.28ppm-6.87ppm对应的是四苯基乙烯上质子的特征峰，5.13ppm 4.71ppm、4.49ppm以及2.55ppm分别对应不同亚甲基上质子的特征峰。通过核磁的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。核磁共振氢谱图如图9所示。
3)将287mg的4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸(0.5mmol)和141mg的6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮(0.5mmol)溶于10mL四氢呋喃中，加入3.6mg的4-二甲胺基吡啶(0.03mmol)和75.6mg的N,N'-二异丙基碳二亚胺(0.6mmol)，加热至35℃，反应16小时，冷却至室温，旋转蒸发除去有机溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用去离子水萃取两次，盐水萃取一次，收集有机相加入无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/乙酸乙酯，V/V＝2:1)，得到浅黄色固体探针化合物为2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯(TPE-NAP-N3)273mg(产率为65.2％)。通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，1H NMR(400MHz,CDCl3,δppm):8.59-8.63(d,1H),8.53-8.57(d,1H),8.41-8.46(d,1H),7.69-7.75(t,1H),7.41-7.47(d,1H),7.24-7.26(s,1H)7.05-7.12(m,9H),6.97-7.04(m,6H),6.90-6.96(d,2H),6.69-6.75(d,2H),5.09-5.13(s,2H),4.53-4.59(m,4H),4.41-4.47(t,2H),2.55-2.59(m,4H)。其中，此外，还通过质谱进行了辅助证明，MS(ESI):m/z 860.9[M+Na]+。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物目标探针分子TPE-NAP-N3。核磁共振氢谱图以及质谱图如图10和图11所示。
实施例2：探针化合物TPE-NAP-N3的制备工艺流程2
1)将2610mg的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(9.42mmol)溶于188mL乙醇中，在氮气保护下缓慢滴加692mg的2-氨基乙醇(11.34mmol)，搅拌条件下，将混合溶液加热回流；冷却至室温后，过滤并收集析出物，将析出物用乙醇重结晶，得到白色固体6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮2500mg(产率为82.9％)。
将480mg上述白色固体(1.5mmol)与975mg叠氮化钠(15mmol)溶于18mL N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌条件下，溶液加热至110℃，并保持9小时；冷却至室温，加入60mL去离子水，然后用300mL乙酸乙酯进行萃取。收集有机相，将有机相用盐水洗涤，用150mg无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为甲醇/二氯甲烷，V/V＝20:1)，得到浅黄色固体6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮344mg(产率为81.3％)。
2)将2730mg的二苯甲酮(15mmol)和3326mg的4-羟基二苯甲酮(16.8mmol)溶于165mL四氢呋喃中，将溶液降温至0℃，加入2340mg锌粉(36mmol)，而后将2.3mL四氯化钛(20mmol)缓慢滴加进去，加入完毕后撤去冰浴，室温下反应1小时，然后再回流加热15小时；冷却至室温后，加入10％的碳酸钾的水溶液，用乙酸乙酯萃取三次，有机相再用盐水洗涤两次，用无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/60-90℃馏分石油醚，V/V＝4:1)，得到浅黄色固体产物4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚2077mg(产率为39.8％)。
将2000mg的4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚(5.74mmol)和751mg的3-溴-1-丙炔(6.31mmol)溶于28.7mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入669mg的碳酸钠(6.31mmol)，然后加热至80℃，反应过夜；冷却至室温后，旋转蒸发除去有机溶剂，用二氯甲烷/去离子水萃取，水层用二氯甲烷洗涤三次，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去滤液中的溶剂，得到褐色油状物经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/石油醚，V/V＝1:1)，得到浅褐色固体2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯1834mg(产率为82.7％)。
将1544mg的2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯(4mmol)和870mg的2-叠氮基乙醇(10mmol)溶于20mL四氢呋喃中，加入100mg五水硫酸铜(0.4mmol)，158.4mg抗坏血酸钠(0.8mmol)，然后加热至45℃；反应20小时，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，用二氯甲烷/去离子水萃取，二氯甲烷相用水萃取三次，收集有机相加入无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/甲醇，V/V＝40:1)，得到浅褐色固体2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇1337mg(产率为70.6％)。
将946mg的2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇(2mmol)和200mg的丁二酸酐(2.0mmol)溶于30.0mL二氯甲烷中，加入12.2mg的4-二甲胺基吡啶(0.1mmol)，室温下反应24小时；旋转蒸发除去溶剂，得到浅褐色固体4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸950mg(产率为82.9％)。
3)将860mg的4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸(1.5mmol)和507mg的6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮(1.8mmol)溶于37.5mL四氢呋喃中，加入16.5mg的4-二甲胺基吡啶(0.135mmol)和283.5mg的N,N'-二异丙基碳二亚胺(2.25mmol)，加热至30℃，反应20小时，冷却至室温，旋转蒸发除去有机溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用去离子水萃取两次，盐水萃取一次，收集有机相加入无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/乙酸乙酯，V/V＝2:1)，得到浅黄色固体探针化合物为2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯(TPE-NAP-N3)770mg(产率为61.6％)。
探针化合物TPE-NAP-N3的中间体以及最终的探针化合物表征与实施例1中的结果是相同的。
实施例3：探针化合物TPE-NAP-N3的制备工艺流程3
1)将870mg的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(3.14mmol)溶于67mL乙醇中，在氮气保护下缓慢滴加220mg的2-氨基乙醇(3.61mmol)，搅拌条件下，将混合溶液加热回流；冷却至室温后，过滤并收集析出物，将析出物用乙醇重结晶，得到白色固体6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮839mg(产率为83.5％)。
将160mg上述白色固体(0.5mmol)与325mg叠氮化钠(5.5mmol)溶于5.5mL N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌条件下，溶液加热至100℃，并保持8小时；冷却至室温，加入30mL去离子水，然后用200mL乙酸乙酯进行萃取。收集有机相，将有机相用盐水洗涤，用100mg无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为甲醇/二氯甲烷，V/V＝20:1)，得到浅黄色固体6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮113mg(产率为80.4％)。
2)将910mg的二苯甲酮(5mmol)和1089mg的4-羟基二苯甲酮(5.5mmol)溶于50mL四氢呋喃中，将溶液降温至0℃，加入715mg锌粉(11mmol)，而后将0.63mL四氯化钛(5.5mmol)缓慢滴加进去，加入完毕后撤去冰浴，室温下反应0.7小时，然后再回流加热10小时；冷却至室温后，加入10％的碳酸钾的水溶液，用乙酸乙酯萃取三次，有机相再用盐水洗涤两次，用无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/60-90℃馏分石油醚，V/V＝4:1)，得到浅黄色固体产物4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚736mg(产率为42.3％)。
将500mg的4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚(1.44mmol)和198mg的3-溴-1-丙炔(1.66mmol)溶于7.9mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入179mg的碳酸钠(1.69mmol)，然后加热至60℃，反应过夜；冷却至室温后，旋转蒸发除去有机溶剂，用二氯甲烷/去离子水萃取，水层用二氯甲烷洗涤三次，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤；旋转蒸发除去滤液中的溶剂，得到褐色油状物经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/石油醚，V/V＝1:1)，得到浅褐色固体2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯462mg(产率为83.1％)。
将386mg的2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯(1mmol)和226mg的2-叠氮基乙醇(2.6mmol)溶于5.5mL四氢呋喃中，加入30mg五水硫酸铜(0.12mmol,)，50mg抗坏血酸钠(0.25mmol)，然后加热至35℃；反应22小时，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，用二氯甲烷/去离子水萃取，二氯甲烷相用水萃取三次，收集有机相加入无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/甲醇，V/V＝40:1)，得到浅褐色固体2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇336mg(产率为70.9％)。
将236.5mg的2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇(0.5mmol)和51.0mg的丁二酸酐(0.51mmol)溶于8.8mL二氯甲烷中，加入3.2mg的4-二甲胺基吡啶(0.028mmol)，室温下反应24小时；旋转蒸发除去溶剂，得到浅褐色固体4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸240mg(产率为83.7％)。
3)将172mg的4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸(0.3mmol)和93mg的6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮(0.33mmol)溶于6.6mL四氢呋喃中，加入2.8mg的4-二甲胺基吡啶(0.022mmol)和49mg的N,N'-二异丙基碳二亚胺(0.39mmol)，加热至32℃，反应18小时，冷却至室温，旋转蒸发除去有机溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用去离子水萃取两次，盐水萃取一次，收集有机相加入无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂：二氯甲烷/乙酸乙酯，V/V＝2:1)，得到浅黄色固体探针化合物为2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯(TPE-NAP-N3)156mg(产率为62.3％)。
探针化合物TPE-NAP-N3的中间体以及最终的探针化合物表征与实施例1中的结果是相同的。
实施例4：TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针分散液的制备
将10mg固体探针化合物2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯(TPE-NAP-N3，实施例1制备)溶于1mL四氢呋喃中，然后在搅拌条件下将该溶液滴加入499mL水中，旋转蒸发除去四氢呋喃；然后用截止分子量为500Da的透析袋透析大于48小时，期间每隔4-6小时换一次水，制得TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针分散液。
实施例5：TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针的荧光性质
在纳米粒子荧光探针中，由于四苯基乙烯具有聚集诱导发光的特性，四苯基乙烯(TPE)在聚集状态时，在340nm的激发光照射下，在470nm左右发射蓝色荧光。而识别基团在可见光区无吸收、也不发射荧光。当识别基团与硫化氢反应后，其叠氮基转变为氨基，由此其可吸收470nm左右的光，且在540nm左右发射绿色荧光。聚集的四苯基乙烯构成了能量转移的供体，而识别基团与硫化氢反应后的基团构成了能量转移的受体；供体和受体之间可以发生能量转移；随着硫化氢的量的增大，蓝色荧光降低，绿色荧光增强，绿色荧光和蓝色荧光的比值可作为检测信号，因此可实现对硫化氢的比率型荧光检测。
在不存在硫化氢的情况下，纳米粒子荧光探针，在340nm的激发光照射下，在470nm左右发射蓝色荧光(聚集状态的四苯基乙烯---即供体的荧光)；而在硫化氢存在下，由于识别基团与硫化氢反应生成了受体基团；供体和受体之间发生能量转移过程，蓝色荧光减弱，受体发射的绿色荧光增强。读取蓝色荧光和绿色荧光的强度，计算绿色荧光和蓝色荧光的比值，即可作为检测信号。
在15W 365nm和254nm的紫外光持续照射10小时，TPE-NAP-N3纳米粒子探针在470nm的蓝色荧光强度降低了0.5％，表明，该纳米粒子荧光探针具有足够好的光稳定性，可以经受较长时间的光照射。
实施例6：TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针对水中和牛血清中的硫化氢的荧光检测
以TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针(实施例1制备)对HEPES缓冲液体系(50mM，pH 7.4)和血清体系中的硫化氢进行检测分析。探针用磷酸盐缓冲液配置成母液浓度为1mM，硫氢化钠用磷酸盐缓冲液配置成母液浓度为1mM(硫氢化钠作为硫化氢的供体)，测试时探针稀释至浓度为25μM，硫氢化钠稀释至浓度为100μM，通过加入不同量的硫氢化钠的磷酸盐缓冲液，记录470nm处和530nm处荧光强度，计算出I530/I470，如下表1所示。取其中加入100μM硫化氢和未加入硫化氢这两个体系的荧光光谱归一化作图得到图12。从图12可以看出，在不存在硫化氢的情况下，纳米粒子荧光探针，在340nm的激发光照射下，在470nm左右发射蓝色荧光(聚集状态的四苯基乙烯---即供体的荧光)；而在硫化氢存在下，由于识别基团与硫化氢反应生成了受体基团；供体和受体之间发生能量转移过程，蓝色荧光减弱，受体发射的540nm左右的绿色荧光。以绿色荧光和蓝色荧光的比值可作为检测信号，因此可实现对硫化氢的比率型荧光检测。
表1 TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针在缓冲液中对H2S的响应
同样地，在对血清体系中的硫化氢进行检测分析时，探针用磷酸盐缓冲液配置成母液浓度为1mM，硫氢化钠用磷酸盐缓冲液配置成母液浓度为1mM(硫氢化钠作为硫化氢的供体)，测试时探针稀释至浓度为25μM，硫氢化钠稀释至浓度为100μM。氯化锌用磷酸盐缓冲液配置成0.1M，使用时每100μL血清中加入1μL的硫化锌溶液，用以排除血清中内源性硫化氢的干扰(参见Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9672-9675)。所选用的胎牛血清用HEPES缓冲液稀释10倍后使用。通过加入不同量的硫氢化钠的磷酸盐缓冲液，记录血清中470nm处和530nm处荧光强度，计算出I530/I470，得到表2。从表2中数据可以看出，合成该荧光探针对硫化氢有较好的检测效果，也即I530/I470的值随着硫化氢的加入量不同而有着明显的变化。而且对比在HEPES缓冲液和血清中对硫化氢的响应，当加入的硫化氢的量相同时，I530/I470的值变化不大，可以说明探针可适用于水相和生物样品中。该方法具有制备简便、准确度高等优点，可有效消除环境因素的干扰，在水相和生物样品分析中显示了极大的潜力。
由上述实施例可见，本发明制备的TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针可以用于生物样品(如血清等)，环境样品(如工业废水等)以及化学样品中硫化氢的检测分析。将样品用缓冲液稀释，并加入本发明中制备的探针分散液，可以对样品进行定性定量检测分析。
表2 TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针在血清中对H2S的响应
由上述实施例可见，本发明制备的TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针可以用于生物样品(如血清等)，环境样品(如工业废水等)以及化学样品中硫化氢的检测分析。将样品用缓冲液稀释，并加入本发明中制备的探针分散液，可以对样品进行定性定量检测分析。
本发明的探针化合物由疏水的四苯基乙烯基部分和亲水的含叠氮基的萘酰亚胺识别基团构成。该探针化合物在水中时，疏水的四苯基乙烯基部分由于疏水作用和π-π相互作用，易于聚集，由此聚集的四苯基乙烯基构成纳米粒子的核，亲水的含叠氮基的萘酰亚胺识别基团构成纳米粒子的外围。
四苯基乙烯基在非聚集状态时，不发射荧光；在聚集状态时，在340nm的激发光照射下，在470nm左右发射蓝色荧光。而识别基团在可见光区无吸收、也不发射荧光。当识别基团与硫化氢反应后，其叠氮基转变为氨基，由此其可吸收470nm左右的光、且在540nm左右发射绿色荧光。由此聚集的四苯基乙烯构成了能量转移的供体，而识别基团与硫化氢反应后的基团构成了能量转移的受体；随着硫化氢的量的增大，蓝色荧光逐渐降低，绿色荧光逐渐增强，绿色荧光和蓝色荧光的比值可作为检测信号，因此可实现对硫化氢的比率型荧光检测。由于这种荧光共振能量转移过程中，两种荧光团并非独立地发射各自的荧光，因此能量转移过程中可观察到相互关联的双发射波长，从而满足双信息通道的要求；而且，与检测识别事件无关的外部因素对两者的荧光信号强度的影响是一致的，所以，外部因素是很难影响FRET体系中两种荧光强度的比率，这种模式可极大地降低外部因素的影响，提高检测精度和准确性。
本发明以纳米粒子荧光探针对硫化氢进行检测，由于纳米粒子的比表面积较大，因此每个纳米粒子可有多个识别基团位于纳米粒子的球形外围，有利于识别基团与被检测物充分接触，进而提高检测灵敏度。四苯基乙烯基的疏水性质和π-π相互作用使其易于形成聚集体，利用这种特性制备纳米粒子的工艺简单、方便，运用该方法构建了一种新的灵敏度高、准确性高的检测硫化氢的方法。本发明的检测体系使用方便，便于推广应用。
Claims (10)
1.一种用于硫化氢检测的比率型荧光探针，其特征在于，该探针的化合物为2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯，具有如下结构式：
2.权利要求1所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
1)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于乙醇，搅拌条件下，在氮气保护下滴加2-氨基乙醇；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与2-氨基乙醇的摩尔比为1:1.1-1.2；将混合溶液加热至回流，控制温度为80℃-85℃；冷却至室温后，过滤并收集析出物，将析出物用乙醇重结晶，得到固体6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮；
将所述固体6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮与叠氮化钠溶于N,N-二甲基甲酰胺中，溶液在加热条件下搅拌反应，加热温度为100℃-110℃，反应(8-10)小时；冷却至室温，加入去离子水，然后用乙酸乙酯进行萃取；收集有机相，将有机相用盐水洗涤，干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化，得到固体6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮；所述6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮与叠氮化钠的摩尔比1:10-1：12；
2)将二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮溶于四氢呋喃中，冰浴条件下加入锌粉，滴加将四氯化钛，撤去冰浴，先室温下反应(0.5-1)小时，而后加热回流(10-15)小时，控制温度为67℃-70℃；冷却至室温后，加入碳酸钾水溶液洗涤，用乙酸乙酯萃取，有机相再用盐水洗涤，干燥，过滤；旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化，得到固体4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚；所述4-羟基二苯甲酮与二苯甲酮的用量摩尔比为(1.1-1.2):1；锌粉与4-羟基二苯甲酮用量的摩尔比为(2-2.5):1；四氯化钛与锌粉摩尔比为(0.5-0.6):1；
将4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚和3-溴-1-丙炔溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入碳酸钠，然后加热反应过夜，加热温度为60℃-80℃；冷却至室温后，旋转蒸发除去有机溶剂，用二氯甲烷/去离子水萃取，水层用二氯甲烷洗涤，收集有机相，干燥，过滤；旋转蒸发除去滤液中的溶剂，得到褐色油状物经硅胶层析柱纯化，得到浅褐色固体2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯；所述3-溴-1-丙炔与4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚的摩尔比为(1.1-1.2):1；碳酸钠与3-溴-1-丙炔的摩尔比为(1-1.05):1；
将2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯和2-叠氮基乙醇溶于四氢呋喃中，加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠，然后加热反应，加热温度为35℃-45℃，反应时间为20-24小时；冷却至室温，旋转蒸发除去四氢呋喃后，用二氯甲烷/去离子水萃取，收集有机相，干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化，得到固体2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇；所述2-叠氮基乙醇、五水硫酸铜和抗坏血酸钠与2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯用量的摩尔比分别为(2.5-3):1、(0.1-0.15):1和(0.2-0.3):1；
将2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑-乙醇和丁二酸酐溶于二氯甲烷中，加入4-二甲胺基吡啶，室温下反应；旋转蒸发除去溶剂，得到固体4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸；丁二酸酐和4-二甲胺基吡啶与2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基-1,2,3-三氮唑-乙醇的摩尔比分别为(1-1.05):1和(0.05-0.06):1；
3)将4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸和6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮溶于四氢呋喃中，加入4-二甲胺基吡啶和N,N’-二异丙基碳二亚胺，加热反应过夜，加热温度为30℃-35℃；反应时间为(16-20)小时；冷却至室温，旋转蒸发除去有机溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用去离子水萃取两次，盐水萃取，收集有机相干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化，得到固体探针化合物2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯；所述6-叠氮基-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮、N,N'-二异丙基碳二亚胺与4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸的摩尔比分别为(1-1.2):1和(1.2-1.5):1；所述4-二甲胺基吡啶与N,N'-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为(0.05-0.06):1。
3.根据权利要求2所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，将固体探针化合物2-(6-叠氮基-1,3-二氧-苯并异喹啉基)乙基2-(4-((4–(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3–三氮唑基)乙基)丁二酸酯溶于四氢呋喃中，然后在搅拌条件下将溶液滴加入水中，旋转蒸发除去四氢呋喃；然后用透析袋对产品透析，透析时间为48-60小时，每隔4-6小时换一次水，制得TPE-NAP-N3纳米粒子荧光探针分散液。
4.根据权利要求3所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述透析袋截止分子量为500Da。
5.根据权利要求2所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)、步骤2)和步骤3)所述的干燥为用无水硫酸镁进行干燥。
6.根据权利要求2所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，每mmol的4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入乙醇20mL-23mL。
7.根据权利要求2所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，每mmol 6-溴-2-(2-羟乙基)-苯并异喹啉-二酮加入N,N-二甲基甲酰胺10mL-12mL；每mmol4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯酚加入N,N-二甲基甲酰胺的用量范围是5-6mL。
8.根据权利要求2所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1)、步骤2)和步骤3)所述的盐水为质量百分浓度5％-10％的氯化钠溶液；所述碳酸钾溶液的质量浓度为5％-10％。
9.根据权利要求2所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，每mmol二苯甲酮加入四氢呋喃10-12mL；每mmol的2-(4-(丙炔氧基苯基)乙烯基-1,1,2三苯加入四氢呋喃5-6mL；每mmol 4-氧代-4-(2-(4-((4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基)-1,2,3-三氮唑)乙氧基)丁酸加入四氢呋喃20-25mL。
10.根据权利要求2所述的用于硫化氢检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，每mmol 2-(4-((1,2,2-三苯基乙烯基)苯氧基)甲基-1,2,3-三氮唑-乙醇加入二氯甲烷15-20mL。
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