CN113817612B - 一种春生田头菇菌株以及栽培方法 - Google Patents

一种春生田头菇菌株以及栽培方法 Download PDF

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Abstract

一种春生田头菇菌株以及栽培方法，所述春生田头菇菌株的分类命名为Agrocybe sp.NDG，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学；保藏时间为：2019年11月20日；保藏编号为CCTCC NO：M 2019955。本发明还包括春生田头菇菌株培育得到的孢子和/或菌丝体和/或子实体，以及春生田头菇子实体的栽培方法。本发明春生田头菇子实体，多糖含量达6.0‑7.0%，单位重量子实体中多糖含量为药典标准的1.8‑2.2倍；水溶浸出物的含量达到23.5‑25.0%，为药典标准的1.3‑1.4倍，是目前春生田头菇中多糖和浸出物含量最高数据记录。

Description

一种春生田头菇菌株以及栽培方法
技术领域
本发明涉及一种菌株以及栽培方法，具体涉及一种田头菇菌株以及栽培方法。
背景技术
春生田头菇性甘、淡，味平，具有利尿渗湿，健脾止泻，清肺热，平肝明目的功能，可作为药材；但现有春生田头菇品种具有出菇不整齐，难以实现工厂化生产的缺陷，同时还存在菌丝体和子实体中功能性成分偏低，水溶性浸出物含量不达标的问题。
CN101637100A公开了一种春生田头菇的人工驯化方法，包括如下步骤：a、培养菌种；b、培养原种；c、培养栽培种。利用很普通的栽培技术资源，将一种纯野生的田头菇改良以后，改变了菇体子实体一般较小、菌盖菌肉比较薄、菌柄较细散生等缺点，达到了比较满意的驯化效果。并且通过改良使得一年一次的生长周期更改为一年两次；该方法只是对春生田头菇进行基本的驯化，使野生春生田头菇便于栽培，所得春生田头菇的品质没有明显提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种春生田头菇菌株以及栽培方法，所述春生田头菇菌株培养得到的菌丝体和子实体具有多糖含量和水溶性浸出物含量高的优点。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种春生田头菇菌株，其分类命名为Agrocybe sp.NDG，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学；保藏时间为：2019年11月20日；保藏编号为CCTCC NO：M 2019955。
本发明菌株系将野生春生田头菇(采集地点为湖南沅江市漉湖农场)进行筛选，并经菌盖平皿组织分离，3次重复传代获得。
本发明还包括所述的春生田头菇菌株培育得到的孢子和/或菌丝体和/或子实体。
野生春生田头菇子实体中等大小，连生或丛生。菇盖半球形至扁平，中部稍突出，表面光滑，幼时暗红褐色，后渐变为褐色或浅土黄褐色，边缘淡褐色，有浅皱纹。菌肉污白色，中部较厚，边缘较薄。菌褶白色，后变咖啡色，密集，直生，不等长。而本发明春生田头菇菌株相对于野生春生田头菇而言子实体偏大，连生，长势整齐。
本发明春生田头菇子实体的栽培方法，包括以下步骤：
(1)取权利要求1所述的春生田头菇菌株接种到培养基中，培养得一级菌种；
(2)无菌状态下，将所述一级菌种接种到种子液体培养基里，摇匀，摇床振荡培养8-10d，获得二级液体菌种；
(3)将栽培料混匀，装入栽培菌袋，高压灭菌；菌袋冷却后，无菌条件下，接入所述二级液体菌种，避光培养30～40d；
(4)待菌丝满袋后，在温度25±2℃、湿度80％-90％条件下培养；先连续2.5-3.5d对菌丝进行Led蓝光照射处理；光周期10-14h/d，处理完成后原基长成，然后在LED白光条件下培养25-35d，此时子实体成熟，即获得春生田头菇子实体。
优选地，步骤(1)中，培养基的配方为：每1000mL中，土豆150-250g、葡萄糖15-25g、琼脂15-25g、蛋白胨1.5-2.5g、KH2PO4 1.5-2.5g、MgSO4 1.5-2.5g，其余为水。
优选地，步骤(1)中，培养的方法为：将培养基经过高压灭菌后倒入无菌培养皿中，冷却凝固备用。然后取一小块春生田头菇菌株转接至培养皿中心位置，置于24-26℃下培养5-7天得一级菌种。
优选地，步骤(2)中，所述种子液体培养基的配方为：每1000mL中，土豆150-250g、葡萄糖15-25g、蛋白胨1.5-2.5g、KH2PO4 1.5-2.5g、MgSO4 1.5-2.5g，其余为水。
更优选地，步骤(2)中，所述种子液体培养基的配方为：每1000mL中，土豆180-220g，葡萄糖18-22g，蛋白胨1.8-2.2g，KH2PO4 1.8-2.2g、MgSO4 1.8-2.2g，其余为水。
进一步优选地，步骤(2)中，所述种子液体培养基的配方为：每1000mL中，土豆190-210g，葡萄糖19-21g，蛋白胨1.9-2.1g，KH2PO4 1.9-2.1g、MgSO4 1.9-2.1g，其余为水。
最优选地，步骤(2)中，所述种子液体培养基的配方为：每1000mL中，土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨2.0g，KH2PO4 2.0g、MgSO4 2.0g，其余为水。
优选地，步骤(2)中，所述种子液体培养基的制备方法为，将土豆切片，在水中煮烂，过滤，得滤液；再将葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4加入所述滤液中，混合、溶解，补加水至总体积为1000mL，分装入锥形瓶，高压灭菌，备用。
优选地，步骤(3)中，所述栽培料的质量百分比配方为：木屑45-55％，南荻枝叶提取液7-13％，棉籽壳15-25％，麦麸14-22％，石灰0.8-1.2％，石膏0.8-1.2％。
更优选地，步骤(3)中，所述栽培料的质量百分比配方为：木屑48-52％，南荻枝叶提取液8-12％，棉籽壳18-22％，麦麸16-20％，石灰0.9-1.1％，石膏0.9-1.1％。
进一步优选地，步骤(3)中，所述栽培料的质量百分比配方为：木屑49-51％，南荻枝叶提取液9-11％，棉籽壳19-21％，麦麸17-19％，石灰0.9-1.1％，石膏0.9-1.1％。
最优选地，步骤(3)中，所述栽培料的质量百分比配方为：木屑50％，南荻枝叶提取液10％，棉籽壳20％，麦麸18％，石灰1.0％，石膏1.0％。
发明人经研究发现，在栽培料中加入南荻枝叶提取液，不仅能补充提供春生田头菇子实体生长所需的木质素和木纤维，对促进春生田头菇子实体中多糖的生成也有一定帮助。
优选地，步骤(3)中，所述南荻枝叶提取液的制备方法为：取南荻树叶和枝条，切断、粉碎，加体积为7-10倍的水进行常压提取，浓缩至南荻提取物为18％～23％，即成。
更优选地，步骤(3)中，所述所述南荻枝叶提取液的制备方法为：取南荻树叶和枝条，切断、粉碎，加体积为8-9倍的水进行常压提取，浓缩至南荻提取物为19％～21％，即成。
优选地，步骤(3)中，每个栽培菌袋的装料量为1.4-1.8kg；每个栽培菌袋接入二级液体菌种18-22mL。
优选地，步骤(4)中，所述光周期为11-13h/d。
最优选地，步骤(4)中，所述光周期为12h/d。
本发明有益效果：
本发明所得春生田头菇子实体，多糖含量达6.0-7.0％，单位重量子实体中多糖含量为药典标准的1.8-2.2倍；水溶浸出物的含量达到23.5-25.0％，为药典标准的1.3-1.4倍，是目前春生田头菇中多糖和浸出物含量最高数据记录。可推动春生田头菇产业发展及后续春生田头菇功能性产品的开发应用。
菌种保藏情况说明
本发明春生田头菇菌株，分类命名为Agrocybe sp.NDG，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学；保藏时间为：2019年11月20日；保藏编号为CCTCC NO：M 2019955。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所使用的原料，均通过常规商业途径获得。
以下实施例中的春生田头菇菌株，系将野生春生田头菇(采集于湖南沅江市漉湖农场)进行筛选，并经菌盖平皿组织分离，3次重复传代获得，命名为Agrocybe sp.NDG。
实施例1
本实施例春生田头菇子实体的栽培方法为：
(1)取权利要求1所述的春生田头菇菌株接种到培养基中，培养得一级菌种；
培养基的配方为：每1000mL中，土豆200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蛋白胨2g、KH2PO42g、MgSO4 2g，其余为水；培养的方法为：将培养基经过高压灭菌后倒入无菌培养皿中，冷却凝固备用。然后取一小块春生田头菇菌株转接至培养皿中心位置，置于24℃下培养5天得一级菌种。
(2)无菌状态下，取四块0.5mm一级菌种菌块转接到150mL种子液体培养基里，摇匀，25℃140r/min摇床振荡培养9d，获得二级液体菌种；
种子液体培养基配方，以1000mL为基准，土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、KH2PO42g、MgSO4 2g，其余为水；
种子液体培养基的制备方法：将土豆切片，在水中煮烂，过滤，得滤液，再将葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4加入所述滤液中，混合、溶解，补加水至总体积为1000mL，分装到250mL锥形瓶中，每瓶装入150mL，121℃下高压灭菌30min，备用；
(3)养菌房培养：将栽培料的原料混合搅拌均匀，装入规格为17cm×33cm×0.045cm的栽培菌袋，每袋装料量1.5kg；121℃下高压灭菌3.5h，备用；待菌袋冷却后，无菌条件下每袋接入二级液体菌种20mL，转移到养菌房，温度25℃下避光培养35d；
栽培料的配方为，木屑50％，南荻枝叶提取液10％，棉籽壳20％，麦麸18％，石灰1％，石膏1％；所述百分比为质量百分比；
所述南荻枝叶提取液的制备方法：取南荻树叶和枝条，切断、粉碎，加体积为南荻枝叶8.5倍的水进行常压提取3.5h，浓缩至南荻提取物为20％，即得到南荻枝叶提取液；
(4)出菇房继续培养：待菌丝满袋后，挪至出菇房，在温度25℃、相对湿度85％-90％条件下继续培养，先连续3d对菌丝进行Led蓝光照射处理，光周期12h/d，处理后原基长成；LED白光条件下继续培养30d，此时子实体成熟，获得菇柄粗壮、菇体完整、色黄、肉厚品质佳的春生田头菇子实体。
实施例2
本实施例春生田头菇子实体的栽培方法为：
(1)取权利要求1所述的春生田头菇菌株接种到培养基中，培养得一级菌种；
培养基的配方为：每1000mL中，土豆250g、葡萄糖18g、琼脂25g、蛋白胨2.2g、KH2PO41.5g、MgSO4 2.2g，其余为水；培养的方法为：将培养基经过高压灭菌后倒入无菌培养皿中，冷却凝固备用。然后取一小块春生田头菇菌株转接至培养皿中心位置，置于25℃下培养7天得一级菌种。
(2)无菌状态下，取四块0.5mm一级菌种菌块转接到150mL种子液体培养基里，摇匀，25℃140r/min摇床振荡培养8d，获得二级液体菌种；
种子液体培养基配方，以1000mL为基准，土豆250g、葡萄糖18g、蛋白胨2.2g、KH2PO41.5g、MgSO4 2.2g，其余为水；
种子液体培养基的制备方法：同实施例1
(3)养菌房培养：将栽培料的原料混合搅拌均匀，装入规格为17cm×33cm×0.045cm的栽培菌袋，每袋装料量1.4kg；121℃下高压灭菌3.5h，备用；待菌袋冷却后，无菌条件下每袋接入二级液体菌种20mL，转移到养菌房，温度25℃下避光培养32d；
栽培料的配方为，木屑46％，南荻枝叶提取液11％，棉籽壳25％，麦麸16％，石灰0.8％，石膏1.2％；所述百分比为质量百分比；
所述南荻枝叶提取液的制备方法：取南荻树叶和枝条，切断、粉碎，加体积为南荻枝叶9倍的水进行常压提取3.5h，浓缩至南荻提取物为21％，即得到南荻枝叶提取液；
(4)出菇房继续培养：待菌丝满袋后，挪至出菇房，在温度25℃、相对湿度85％-90％条件下继续培养，先连续3d对菌丝进行Led蓝光照射处理，光周期13h/d，处理后原基长成；LED白光条件下继续培养32d，此时子实体成熟，获得菇柄粗壮、菇体完整、色黄、肉厚品质佳的春生田头菇子实体。
实施例3
本实施例春生田头菇子实体的栽培方法为：
(1)取权利要求1所述的春生田头菇菌株接种到培养基中，培养得一级菌种；
培养基的配方为：每1000mL中，土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨2g、KH2PO42g、MgSO4 2g，其余为水；培养的方法为：将培养基经过高压灭菌后倒入无菌培养皿中，冷却凝固备用。然后取一小块春生田头菇菌株转接至培养皿中心位置，置于25℃下培养5天得一级菌种。
(2)无菌状态下，取四块0.5mm一级菌种菌块转接到150mL种子液体培养基里，摇匀，25℃140r/min摇床振荡培养10d，获得二级液体菌种；
种子液体培养基配方，以1000mL为基准，土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、KH2PO42g、MgSO4 2g，其余为水；
种子液体培养基的制备方法：同实施例1
(3)养菌房培养：将栽培料的原料混合搅拌均匀，装入规格为17cm×33cm×0.045cm的栽培菌袋，每袋装料量1.8kg；121℃下高压灭菌3.5h，备用；待菌袋冷却后，无菌条件下每袋接入二级液体菌种20mL，转移到养菌房，温度25℃下避光培养40d；
栽培料的配方为，木屑53％，南荻枝叶提取液8％，棉籽壳18％，麦麸19％，石灰1.1％，石膏0.9％；所述百分比为质量百分比；
所述南荻枝叶提取液的制备方法：取南荻树叶和枝条，切断、粉碎，加体积为南荻枝叶8倍的水进行常压提取3.5h，浓缩至南荻提取物为19％，即得到南荻枝叶提取液；
(4)出菇房继续培养：待菌丝满袋后，挪至出菇房，在温度25℃、相对湿度85％-90％条件下继续培养，先连续3d对菌丝进行Led蓝光照射处理，光周期11h/d，处理后原基长成；LED白光条件下继续培养29d，此时子实体成熟，获得菇柄粗壮、菇体完整、色黄、肉厚品质佳的春生田头菇子实体。
检测与分析
对实施例1～3所得二级液体菌种中的胞内多糖、春生田头菇子实体中的多糖、以及春生田头菇子实体的水溶性浸出物进行测定。
1.多糖含量测定：参照《中国药典》2020版一部中关于春生田头菇多糖含量检测方法，分别检测本发明实施例1二级液体菌种中胞内多糖和春生田头菇子实体中多糖：
(1)总糖：取本品粗粉约5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水120ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用脱脂棉滤过，精密量取滤液40mL，加酚酞指示液1-2滴，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，加稀硫酸25mL，加热回流4h，放冷，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，精密加入碘滴定液(0.1mol/L)25mL，逐滴加氢氧化钠试液4mL，边加边剧烈振摇，密塞，置暗处放置10min，加稀硫酸4mL，立即用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液2mL，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正，即得；每1mL碘滴定液(0.1mol/L)相当于9.008mg的无水葡萄糖(C6H12O6)；
(2)单糖：精密量取总糖项下的滤液40mL，加酚酞指示液1-2滴，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，按总糖项下方法，自“精密加入碘滴定液(0.1mol/L)25mL”起，同法操作。每1mL碘滴定液(0.1mol/L)相当于9.008mg的无水葡萄糖(C6H12O6)。总糖的含量减去单糖的含量，即为多糖的含量；按照药典标准，干燥品计算，含多糖以无水葡萄糖(C6H12O6)计，不得少于3.2％。
检测结果显示，本发明实施例1二级液体菌种中胞内多糖含量为3.8±0.2％(n＝3)，高于药典标准，表明分离驯化的春生田头菇菌株多糖含量较高，为较理想的春生田头菇人工栽培品种；而采用本发明春生田头菇栽培方法获得的春生田头菇子实体，其中春生田头菇多糖含量达到6.5±0.1％(n＝3)，单位重量春生田头菇子实体中春生田头菇多糖含量为药典标准规定的2.03倍。
本发明实施例2二级液体菌种中胞内多糖含量为3.7±0.1％(n＝3)，春生田头菇子实体中的春生田头菇多糖含量达到6.3±0.2％(n＝3)；实施例3二级液体菌种中胞内多糖含量为3.8±0.2％(n＝3)，春生田头菇子实体中的春生田头菇多糖含量达到6.4±0.1％(n＝3)。
2.水溶性浸出物测定：参照《中国药典》2020版检测春生田头菇子实体中水溶性浸出物含量方法测定：
(1)样品粉碎，过2号筛，并混合均匀；
(2)热浸法：取供试品约2-4g，精密称定，置100-250mL的锥形瓶中，精密加水50-100mL，密塞，称定重量，静置1h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3h，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(％)。照水溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定，不得少于18.0％。
经检测，本发明实施例1所得春生田头菇子实体中，水溶浸出物的含量达到24.2±1.0％(n＝3)，为药典标准规定的1.34倍，表明所得春生田头菇子实体能解决春生田头菇药材中水溶性浸出物含量不达标的问题。本发明实施例2所得春生田头菇子实体中，水溶浸出物的含量达到23.7±1.1％(n＝3)；实施例3所得春生田头菇子实体中，水溶浸出物的含量达到23.9±0.8％(n＝3)。

Claims (10)

1. 一种春生田头菇菌株，其特征在于，分类命名为Agrocybe sp. NDG，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学；保藏时间为：2019年11月20日；保藏编号为CCTCC NO：M 2019955。
2.根据权利要求1所述的春生田头菇菌株培育得到的孢子或菌丝体或子实体。
3.一种春生田头菇子实体的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取权利要求1所述的春生田头菇菌株接种到培养基中，培养得一级菌种；
（2）无菌状态下，将所述一级菌种接种到种子液体培养基里，摇匀，摇床振荡培养8-10d，获得二级液体菌种；
（3）将栽培料混匀，装入栽培菌袋，高压灭菌；菌袋冷却后，无菌条件下，接入所述二级液体菌种，避光培养30～40 d；
（4）待菌丝满袋后，在温度25 ±2℃、湿度80%-90%条件下培养；先连续2.5-3.5 d对菌丝进行Led蓝光照射处理；光周期10-14 h/d，然后在LED白光条件下培养25-35 d，即获得春生田头菇子实体。
4. 根据权利要求3所述的春生田头菇子实体的栽培方法，其特征在于，步骤（1）中，培养基的配方为：每1000 mL中，土豆150-250 g、葡萄糖15-25g、琼脂15-25g、蛋白胨1.5-2.5g、KH2PO4 1.5-2.5 g、MgSO4 1.5-2.5 g，其余为水；培养的方法为：将培养基经过高压灭菌后倒入无菌培养皿中，冷却凝固备用，然后取一小块春生田头菇菌株转接至培养皿中心位置，置于24-26℃下培养5-7天得一级菌种。
5. 根据权利要求3或4所述的春生田头菇子实体的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子液体培养基的配方为：每1000 mL中，土豆150-250 g、葡萄糖15-25g、蛋白胨1.5-2.5 g、KH2PO4 1.5-2.5 g、MgSO4 1.5-2.5 g，其余为水。
6. 根据权利要求5所述的春生田头菇子实体的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子液体培养基的制备方法为，将土豆切片，在水中煮烂，过滤，得滤液；再将葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4 、MgSO4 加入所述滤液中，混合、溶解，补加水至总体积为1000 mL，分装入锥形瓶，高压灭菌，备用。
7.根据权利要求3或4所述的春生田头菇子实体的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，所述栽培料的质量百分比配方为：木屑45-55%，南荻枝叶提取液7-13%，棉籽壳15-25%，麦麸14-22%，石灰0.8-1.2%，石膏0.8-1.2%。
8.根据权利要求7所述的春生田头菇子实体的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，所述南荻枝叶提取液的制备方法为：取南荻树叶和枝条，切断、粉碎，加体积为7-10倍的水进行常压提取，浓缩至南荻提取物为18%~23%，即成。
9. 根据权利要求3所述的春生田头菇子实体的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，每个栽培菌袋的装料量为1.4-1.8 kg；每个栽培菌袋接入二级液体菌种18-22mL。
10. 根据权利要求3或9所述的春生田头菇子实体的栽培方法，其特征在于，步骤（4）中，所述光周期为11-13 h/d。
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