CN112715278B

CN112715278B - 一种中药云芝菌及其栽培方法

Info

Publication number: CN112715278B
Application number: CN202110124510.XA
Authority: CN
Inventors: 谢玲; 夏志兰
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112715278A

Abstract

一种中药云芝菌及其栽培方法，该云芝菌为彩绒革盖菌PS(Coriolus versicolor PS)，于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2021010。本发明还包括所云芝菌彩绒革盖菌PS的栽培方法。利用本发明所得中药云芝子实体，云芝多糖含量达6.0‑7.0%，单位重量子实体中云芝多糖含量为药典标准的1.8‑2.2倍；水溶浸出物的含量达到23.5‑25.0%，为药典标准的1.3‑1.4倍，是目前中药云芝中多糖和浸出物含量最高数据记录。

Description

一种中药云芝菌及其栽培方法

技术领域

本发明涉及一种中药云芝菌及其栽培方法，特别是涉及一种云芝多糖和浸出物含量高的云芝菌及其栽培方法。

背景技术

云芝菌隶属于真菌门，担子菌纲(Basidiomycota)，多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），革盖菌属(Coriolus)。

《中国药典》2020版一部记载，中药云芝为多孔菌科真菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor（L. ex Fr.）Quel的干燥子实体。

据报道，中药云芝与免疫调节、抗氧化、抗癌、抑菌等多种药理作用相关，尤其在肝病、白血病、肺癌、食管癌等抗癌方面表现出良好的应用前景。其中云芝多糖（Coriolusversicolor polysaccharides, GVPs）及相关的糖肽具有很高的药用价值，是中药云芝的关键药效活性成分。云芝多糖在中国被广泛应用于食品、药品和保健品等，如云芝肝泰颗粒、云芝菌胶囊、云芝多糖滴丸、云芝多糖颗粒冲剂，以及各种包含云芝多糖的功能型饮料、配方食品等，市场需求量与日俱增，其产业发展前景非常广阔。在国外，云芝糖肽（polysaccharopeptide，PSP）和云芝胞内多糖肽（polysaccharopeptide Krestin,PSK）一直被当做癌症化疗放疗的治疗补充剂。美国的云芝活性菌丝产品现已完成动物安全评估，亦有进一步开发成膳食补充剂的可能。一方面云芝系列产品的不断涌现，国内国际需求进一步增大；另一方面，目前国内云芝多用野生，人工栽培品种不明确，可供人工栽培的、达到药典质量要求的云芝菌种资源匮乏，云芝人工栽培推进缓慢，云芝药材质量不稳定，尤其是，云芝多糖和浸出物含量常低于药典水平（《中国药典》2020版一部限定云芝多糖的含量不得少于3.2 %，水溶浸出物含量不得少于18%），给云芝的发展带来了巨大的阻力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种云芝多糖和浸出物含量高的中药云芝菌及其栽培方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种中药云芝菌，为彩绒革盖菌PS(Coriolus versicolor PS)，于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2021010。

本发明中药云芝菌即彩绒革盖菌PS系将野生云芝菌（采集地点为湖南长沙高桥镇）进行筛选，并经菌盖平皿组织分离，3次重复传代获得，命名为彩绒革盖菌PS(Coriolus versicolor PS)。

本发明中药云芝菌彩绒革盖菌PS的栽培方法，包括以下步骤：

（1）取所述云芝菌即彩绒革盖菌PS菌株作为母种并获得平皿一级菌种；

（2）二级液体种子培养：二级液体种子培养基配方与制备：配方为，以1000 mL为计算基准，土豆150-250 g（优选180-220 g；更优选190-210 g；进一步优选200 g）、葡萄糖15-25g（优选18-22 g；更优选19-21 g；进一步优选20 g）、蛋白胨1.5-2.5 g（优选1.8-2.2 g；更优选1.9-2.1 g；进一步优选2.0 g）、KH₂PO₄1.5-2.5 g（优选1.8-2.2 g；更优选1.9-2.1g；进一步优选2.0 g）、 MgSO₄1.5-2.5 g（优选1.8-2.2 g；更优选1.9-2.1 g；进一步优选2.0 g），余为水；制备方法是，将土豆切片，加适量水加热处理，过滤，得滤液，再将葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、 MgSO₄加入所述滤液中，混合、溶解，再加适量水，配制成1000 mL液体种子培养基，分装入锥形瓶，高压灭菌，备用；无菌状态下，将平皿一级菌种菌块转接到种子液体培养基里，摇匀，摇床振荡培养8-10 d，获得栽培种液体菌种；

（3）养菌房培养：栽培料配方为，木屑45-55%（优选48-52%；更优选49-51%，进一步优选50%），杜仲树枝叶提取液7-13%（优选8-12%；更优选9-11%，进一步优选10%），棉籽壳15-25%（优选18-22%；更优选19-21%，进一步优选20%），麦麸14-22%（优选16-20%；更优选17-19%，进一步优选18%），石灰0.8-1.2%（优选0.9-1.1%；更优选1.0%），石膏0.8-1.2%（优选0.9-1.1%；更优选1.0%）；所述百分比为质量百分比；将各原料混合搅拌均匀，装入栽培菌袋，每袋装料量1.0-2.0 kg（优选1.4-1.8 kg；更优选1.5 kg）；121℃下高压灭菌3-4 h，备用；待菌袋冷却后，无菌条件下每袋接入栽培种液体菌种15-25mL（优选18-22mL；更优选20mL），转移到养菌房，温度25±1 ℃下避光培养30～40 d；

所述杜仲树枝叶提取液的制备方法：取杜仲树叶和枝条，切断，粉碎，加7-10倍（优选8-9倍）量水进行常压提取，并浓缩至原料与水的质量比为1:3.5-4.5（优选1:3.8-4.2；更优选1:4）的浓缩液，即得到所述杜仲树枝叶提取液；

（4）出菇房继续培养：待菌丝满袋后，挪至出菇房，在温度25 ±2℃、相对湿度80%-90%条件下继续培养，同时对菌丝进行Led蓝光照射处理，光周期每天为10-14h,（优选11-13h，更优选12 h），处理时长为连续2.5-3.5 d，至原基长成；继续培养25-35 d，直至子实体成熟，获得中药云芝子实体。

研究表明，在栽培料中加入杜仲树枝叶提取液，不仅能补充提供云芝子实体生长所需的木质素和木纤维，同时可以促进云芝子实体中云芝多糖的生成。

本发明所得中药云芝子实体，云芝多糖含量达6.0-7.0%，单位重量子实体中云芝多糖含量为药典标准的1.8-2.2倍；水溶浸出物的含量达到23.5-25.0%，为药典标准的1.3-1.4倍，是目前中药云芝中多糖和浸出物含量最高数据记录。可解决目前市场需求量大和人工栽培接近空白之间的尖锐矛盾，推动云芝产业发展及后续云芝功能性产品的开发应用。

菌种保藏情况说明

本发明中药云芝菌彩绒革盖菌PS(Coriolus versicolor PS)菌种，于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2021010。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明云芝即彩绒革盖菌PS系将野生云芝菌（采集于湖南长沙高桥镇）进行筛选，并经菌盖平皿组织分离，3次重复传代获得，命名为彩绒革盖菌PS(Coriolus versicolor PS)。

所述中药云芝菌即彩绒革盖菌PS的栽培方法实施例

本实施例包括以下步骤：

（1）取所述云芝菌即彩绒革盖菌PS菌株（保藏编号为CCTCC M 2021010）作为母种并获得平皿一级菌种；

（2）二级液体种子培养：二级液体种子培养基配方，以1000 mL为基准，土豆200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、 KH₂PO₄2 g、 MgSO₄2 g，余为水；制备方法是，将土豆切片，加水煎煮，过滤，得滤液，再将葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、 MgSO₄加入所述滤液中，混合、溶解，加适量水，配制成1000 mL液体种子培养基，分装到250 mL锥形瓶中，每瓶装入150 mL（超过这个量将不利于振荡培养），121℃下高压灭菌30 min，备用；无菌状态下，取四块0.5mm的平皿一级菌种菌块转接到150 mL种子液体培养基里，摇匀，25℃和140 r/min摇床振荡培养9d，获得栽培种液体菌种；

（3）养菌房培养：栽培料配方为，木屑50%，杜仲树枝叶提取液10%，棉籽壳20%，麦麸18%，石灰1%，石膏1%；所述百分比为质量百分比；将各原料混合搅拌均匀，装入规格为17cm×33cm×0.045cm的栽培菌袋，每袋装料量1.5 kg；121℃下高压灭菌3.5 h，备用；待菌袋冷却后，无菌条件下每袋接入栽培种液体菌种20 mL，转移到养菌房，温度25 ℃下避光培养35d；

所述杜仲树枝叶提取液的制备方法：取杜仲树叶和枝条，切断，粉碎，加8.5倍量水进行常压提取3.5 h，然后浓缩至原料与水的质量比为1:4的浓缩液，即得到杜仲树枝叶提取液；

（4）出菇房继续培养：待菌丝满袋后，挪至出菇房，在温度25 ℃、相对湿度85%-90%条件下继续培养，同时对菌丝进行Led蓝光照射处理，光周期每天为12 h，处理时长为连续3d，至原基长成；继续培养30 d，至子实体成熟，获得中药云芝子实体。

所得中药云芝彩绒革盖菌PS栽培种中胞内多糖、云芝子实体中多糖含量测定及云芝彩绒革盖菌PS子实体中水溶性浸出物测定。

1、云芝多糖含量测定：参照《中国药典》2020版一部中关于云芝多糖含量检测方法，分别检测本发明实施例云芝彩绒革盖菌PS栽培种中胞内多糖、云芝子实体中多糖：

（1）总糖：取本品粗粉约5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水120 ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用脱脂棉滤过，精密量取滤液40 mL，加酚酞指示液1-2滴，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，加稀硫酸25 mL，加热回流4 h，放冷，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，精密加入碘滴定液（0.1mol/L）25 mL，逐滴加氢氧化钠试液4 mL，边加边剧烈振摇，密塞，置暗处放置10 min，加稀硫酸4 mL，立即用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液2 mL，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正，即得；每1 mL碘滴定液（0.1mol/L）相当于9.008 mg的无水葡萄糖（C₆H₁₂O₆）；

（2）单糖：精密量取总糖项下的滤液40 mL，加酚酞指示液1-2滴，用氢氧化钠试液调节pH值至中性，按总糖项下方法，自“精密加入碘滴定液（0.1mol/L）25 mL”起，同法操作。每1 mL碘滴定液（0.1mol/L）相当于9.008 mg的无水葡萄糖（C₆H₁₂O₆）。总糖的含量减去单糖的含量，即为云芝多糖的含量。本品按干燥品计算，含云芝多糖以无水葡萄糖（C₆H₁₂O₆）计，不得少于3.2%。

检测结果显示，本实施例栽培种中胞内云芝多糖含量为3.8±0.2%（n=3），高于药典标准，表明分离驯化的云芝彩绒革盖菌PS菌株多糖含量较高，为较理想的云芝人工栽培品种；而采用本发明云芝菌栽培方法获得的云芝子实体，其中云芝多糖含量达到6.5±0.1%（n=3），单位重量云芝子实体中云芝多糖含量为药典标准规定的2.03倍。

2、水溶性浸出物测定：参照《中国药典》2020版检测云芝子实体中水溶性浸出物含量方法测定：

（1）样品粉碎，过2号筛，并混合均匀；

（2）热浸法：取供试品约2-4 g，精密称定，置100-250 mL的锥形瓶中，精密加水50-100 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量（％）。照水溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，不得少于18.0%。

经检测，本发明实施例所得云芝子实体中，水溶浸出物的含量达到24.2±1.0%（n=3），为药典标准规定的1.34倍，进一步表明此云芝栽培方法能解决云芝药材中水溶性浸出物含量不达标的问题。

Claims

1.一种中药云芝菌的栽培方法，所述云芝菌为彩绒革盖菌PS(Coriolus versicolor PS)，于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2021010，其特征在于，所述栽培方法包括以下步骤：

（2）二级液体种子培养：二级液体种子培养基的配方与制备：配方为，以1000 mL为基准，土豆150-250 g、葡萄糖15-25g、蛋白胨1.5-2.5 g、KH₂PO₄1.5-2.5 g、MgSO₄1.5-2.5 g，余为水；制备方法是，将土豆切片，加适量水加热处理，过滤，得滤液，再将葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄加入所述滤液中，混合、溶解，然后加适量水，配制成1000 mL种子液体培养基，分装入锥形瓶，高压灭菌，备用；无菌状态下，将平皿一级菌种菌块转接到种子液体培养基里，摇匀，摇床振荡培养8-10 d，获得栽培种液体菌种；

（3）养菌房培养：栽培料的配方为，木屑45-55%，杜仲树枝叶提取液7-13%，棉籽壳15-25%，麦麸14-22%，石灰0.8-1.2%，石膏0.8-1.2%，所述百分比为质量百分比；将各原料混合搅拌均匀，装入栽培菌袋，高压灭菌，备用；无菌条件下接入栽培种液体菌种，转移到养菌房，避光培养30～40 d；

所述杜仲树枝叶提取液的制备方法：取杜仲树叶和枝条，切断，粉碎，加7-10倍量水进行常压提取，并浓缩至原料与水的质量比为1:3.5-4.5的浓缩液，即得到杜仲树枝叶提取液；

（4）出菇房继续培养：待菌丝满袋后，转移至出菇房，在温度25 ±2℃、湿度80%-90%条件下继续培养，同时对菌丝进行Led蓝光照射处理，光周期每天为10-14h，处理时长为连续2.5-3.5 d，至原基长成；继续培养25-35 d，直至子实体成熟，即获得中药云芝子实体。

2.根据权利要求1所述中药云芝菌的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，所述土豆的质量为180-220 g，葡萄糖的质量为18-22 g，蛋白胨的质量为1.8-2.2 g，KH₂PO₄的质量为1.8-2.2 g、 MgSO₄的质量为1.8-2.2 g。

3.根据权利要求2所述中药云芝菌的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，所述土豆的质量为190-210 g，葡萄糖的质量为19-21 g，蛋白胨的质量为1.9-2.1 g，KH₂PO₄的质量为1.9-2.1 g、 MgSO₄的质量为1.9-2.1 g。

4.根据权利要求3所述中药云芝菌的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，所述土豆的质量为200 g，葡萄糖的质量为20g，蛋白胨的质量为2.0 g，KH₂PO₄的质量为2.0 g、 MgSO₄的质量为2.0g。

5.根据权利要求1-4之一所述中药云芝菌的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，栽培料的质量百分比配方为，木屑48-52%，杜仲树枝叶提取液8-12%，棉籽壳18-22%，麦麸16-20%，石灰0.9-1.1%，石膏0.9-1.1%；每袋装料量为1.4-1.8kg；无菌条件下每袋接入栽培种液体菌种18-22mL；

所述杜仲树枝叶提取液的制备方法，加8-9倍量水进行常压提取，浓缩至原料与水的质量比为1:3.8-4.2的浓缩液。

6.根据权利要求5所述中药云芝菌的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，栽培料的质量百分比配方为，木屑49-51%，杜仲树枝叶提取液9-11%，棉籽壳19-21%，麦麸17-19%。

7.根据权利要求5所述中药云芝菌的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，栽培料的质量百分比配方为，木屑50%，杜仲树枝叶提取液10%，棉籽壳20%，麦麸18%，石灰1.0%，石膏1.0%。

8.根据权利要求1-4之一所述中药云芝菌的栽培方法，其特征在于，步骤（4）中，光周期每天为11-13h。

9.根据权利要求8所述中药云芝菌的栽培方法，其特征在于，步骤（4）中，光周期每天为12h。