CN113728109A

CN113728109A - 纯化细菌多糖的方法

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Publication number: CN113728109A
Application number: CN202080030584.0A
Authority: CN
Inventors: L·朱; S·A·库克; N·麦钱特; J·K·莫兰
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2021-11-30
Also published as: CA3130879A1; IL285770A; MX2021009891A; EP3927836A1; AU2020225578A1; KR20210133239A; AU2023206219A1; JP7239509B2; BR112021014686A2; AU2020225578B2; JP2020146032A; US20220136020A1; AU2020225578C1; JP7239509B6; WO2020170190A1

Abstract

本发明涉及纯化细菌多糖的方法，尤其是去除来自产生多糖的细菌细胞裂解物的杂质。

Description

纯化细菌多糖的方法

技术领域

本发明涉及纯化细菌多糖的方法，特别是去除来自产生多糖的细菌细胞裂解物的杂质。

发明背景

细菌多糖尤其是荚膜多糖，是参与多种细菌疾病的细菌表面上发现的重要免疫原。这使得其成为疫苗设计的重要组分。它们被证明对引发免疫应答有用，特别是连接载体蛋白时。

细菌多糖通常由细菌发酵产生(如链球菌(Streptococci)(例如肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)或C&G群链球菌)、葡萄球菌(Staphylococci)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、嗜血杆菌(Haemophilus)(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、奈瑟氏菌(Neisseria)(例如脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis))和埃希氏杆菌(Escherichia)(例如大肠杆菌(Escherichia coli))。

通常，细菌多糖用复合培养基中的分批培养、补料分批培养或连续培养产生。

需要稳健和有效的纯化工艺，其能用于发酵后大规模产生细菌多糖。

大部分过程包括沉淀荚膜多糖的步骤(如醇沉淀或阳离子洗涤剂处理)。后续从上清分离沉淀物(如通过离心)和再溶解是费力的，其可能引起多糖损失，从而降低收率。

此外，大部分纯化工艺需要数个步骤，涉及许多昂贵、劳动密集型且有技术要求的操作，如层析和多个膜分离。这些工艺中的杂质去除在许多劳动密集型且昂贵的步骤中展开。由于可溶性蛋白的物理和化学性质，蛋白水平是遇到的最大问题。

因此，需要简化的纯化工艺以减少细菌裂解物中的可溶性蛋白水平并消除目前纯化工艺的低效以产生适合纳入疫苗的大大纯化的细菌多糖。

附图简要说明

图1是多糖纯化的流程图。

图2是2％w/v明矾(alum)，在多个时间点，pH对蛋白去除和肺炎链球菌血清型8发酵液净度的影响。在1小时(左柱)、4小时(中间柱)、24小时(右柱)之后。

图3是pH 3.5，在多个时间点，％明矾对蛋白去除和肺炎链球菌血清型8发酵液净度的影响。1.0％明矾(左柱)、2.0％明矾(中间柱)、3.0％明矾(右柱)。

图4是肺炎链球菌血清型33F发酵液的酸滴定。

图5是肺炎链球菌血清型33F在pH 3.5的明矾絮凝。

图6是加热对肺炎链球菌血清型22F絮凝的发酵液粒径的影响。对于该实验，絮凝温度保持在室温(RT)(较小粒径分布曲线(峰值(peack)在9.8μm))和或45℃(较大粒径分布曲线(峰值在65μm))。

1.细菌多糖的纯化工艺

1.1起始材料

本发明方法能用于从溶液纯化细菌多糖，所述溶液包含所述多糖及污染物。

1.1.1细菌细胞

根据本发明待纯化的细菌多糖来源是细菌细胞，尤其是致病菌。

根据本发明使用的革兰氏阳性菌的非限制性示例是链球菌(例如肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌或C&G群链球菌)、葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)、肠球菌(Enterococci)、芽孢杆菌(Bacillus)、棒状杆菌(Corynebacterium)、李斯特菌(Listeria)、丹毒丝菌(Erysipelothrix)和梭菌(Clostridium)。根据本发明使用的革兰氏阴性菌的非限制性示例包括嗜血杆菌(例如流感嗜血杆菌)、奈瑟氏菌(例如脑膜炎奈瑟氏菌)和埃希氏杆菌(例如大肠杆菌)。

在一个实施方案中，所述根据本发明使用的细菌多糖来源选自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和其他物种(spp.)；炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)；梭菌(Clostridium)的产生肉毒菌(Botulinum)神经毒素的物种；流产布鲁氏菌(Brucella abortus)；羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)；猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)；鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(之前名为鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei))；类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)(之前名为伪鼻疽假单胞菌(Pseudomonas pseudomallei))；空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)；鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)；沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis),肉毒杆菌(Clostridium botulinum)；难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium dificile)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；粗球孢子菌(Coccidioides immitis)；波萨达斯球孢子菌(Coccidioides posadasii)；考德里氏体(Cowdria ruminantium)(心水病)；伯纳特氏立克次氏体(Coxiella burnetii)；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；致泻性大肠杆菌(Enterovirulent Escherichia coli)群(EEC群)如大肠杆菌-肠毒素性(ETEC),大肠杆菌-肠致病性(EPEC),大肠杆菌-O157:H肠出血性(EHEC)和大肠杆菌-肠侵袭性(EIEC)；埃立克体(Ehrlichia spp.)如查菲埃立克体(Ehrlichia chajfeensis)；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)；柑橘黄龙病菌非洲种(Liberobacter africanus)；柑桔黄龙病菌亚洲种(Liberobacter asiaticus)；单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；miscellaneous enterics如克雷伯氏杆菌(Klebsiella)、肠杆菌(Enterobacter)、变形杆菌(Proteus)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、气杆菌(Aerobacter)、普罗维登斯菌(Providencia)和沙雷氏菌(Serratia)；牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)；结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；山羊支原体(Mycoplasma capricolum)；丝状支原体丝状亚种(Mycoplasmamycoides ssp mycoides)；菲律宾指霜霉病菌(Peronosclerospora philippinensis)；大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi)；类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)；青枯雷尔氏菌小种3,生化变种2(Ralstonia solanacearum race 3,biovar 2)；普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)；立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)；沙门氏菌(Salmonella spp.)；疫霉玉米变种(Schlerophthora rayssiae var zeae)；志贺氏菌(Shigella spp.)；金黄色葡萄球菌；链球菌；马铃薯癌肿病菌(Synchytriumendobioticum)；霍乱弧菌非01(Vibrio cholerae non-01)；霍乱弧菌01(Vibrio cholerae01)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemoIy ticus)和其他弧菌(Vibrios)；创伤弧菌(Vibriovulnificus)；水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)；叶缘焦枯病菌(Xylellafastidiosa)(柑橘杂色褪绿病菌株(citrus variegated chlorosis strain))；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)；和鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)。

想要纯化的多糖可与细胞组分相关，如细胞壁。与细胞壁相关意味着多糖是细胞壁自身组分和/或直接或间接经中间分子附于细胞壁，或是细胞壁的暂时包被(例如，某些菌株渗出荚膜多糖，本领域也称为‘胞外多糖’)。

在一些实施方案中，提取自细菌的多糖是荚膜多糖、荚膜下多糖或脂多糖。

在优选的实施方案中，所述多糖是荚膜多糖。

在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是金黄色葡萄球菌。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是5型金黄色葡萄球菌或8型金黄色葡萄球菌。

在另一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是粪肠球菌。在另外一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是b型流感嗜血杆菌。

在另一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是脑膜炎奈瑟氏菌。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是A血清群脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)(MenA)、W135血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenW135)、Y血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenY)、X血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenX)或C血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenC)。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是A血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenA)。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是W135血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenW135)。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是Y血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenY)。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是C血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenC)。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是X血清群脑膜炎奈瑟氏菌(MenX)。

在另一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是大肠杆菌。在另一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是粪肠球菌。

在另一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是无乳链球菌(B族链球菌(GBS))。在一些实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源选自Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII型GBS。在一些实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源选自Ia、Ib、II、III和V型GBS。

在另一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是大肠杆菌。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是大肠杆菌，部分是致泻性大肠杆菌群(EEC群)如大肠杆菌-肠毒素性(ETEC)、大肠杆菌-肠致病性(EPEC)、大肠杆菌-O157:H肠出血性(EHEC)或大肠杆菌-肠侵袭性(EIEC)。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)。

在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是选自以下血清型的大肠杆菌血清型：O157:H7、O26:H11、O111:H-和O103:H2。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是选自以下血清型的大肠杆菌血清型：O6:K2:H1和O18:K1:H7。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是选自以下血清型的大肠杆菌血清型：O45:K1、O17:K52:H18、O19:H34和O7:K1。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是大肠杆菌血清型O104:H4。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是大肠杆菌血清型O1:K12:H7。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是大肠杆菌血清型O127:H6。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是大肠杆菌血清型O139:H28。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是大肠杆菌血清型O128:H2。

在一个优选的实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌(Steptococcuspneumoniae)。细菌荚膜多糖来源优选是选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23B、23F、24B、24F、29、31、33F、34、35B、35F、38、72和73的肺炎链球菌血清型。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是选自以下血清型的肺炎链球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23B、23F、24F、29、31、33F、35B、35F、38、72和73。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是选自以下血清型的肺炎链球菌血清型：8、10A、11A、12F、15B、22F和33F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型1。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型2。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型3。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型4。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型5。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型6A。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型6B。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型6C。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型7F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型8。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型9V。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型9N。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型10A。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型11A。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型12F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型14。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型15A。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型15B。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型15C。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型16F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型17F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型18C。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型19A。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型19F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型20。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型20A。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型20B。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型22F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型23A。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型23B。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型23F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型24B。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型24F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型29。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型31。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型33F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型34。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型35B。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型35F。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型38。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型72。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是肺炎链球菌血清型73。

用于纯化本发明所用各多糖的菌株可获自已建立的培养收集物或临床样本。

1.1.2细菌细胞生长

通常，多糖通过细菌在培养基(如固体或优选液体培养基)中生长而产生。

因此，在一个实施方案中，用于本发明的起始材料是细菌培养物且优选液体细菌培养物(如发酵液)。

细菌培养物通常经分批培养、补料分批培养或连续培养获得(参见例如WO2007/052168或WO 2009/081276)。连续培养期间，新鲜培养基以固定速度加入培养物，细胞和培养基以维持恒定培养体积的速度移出。

生物体群体通常从种子小瓶到种子瓶放大规模，并通过一个或多个体积增加的种子发酵罐继代，直至达到生产规模发酵体积。

1.1.3预处理细菌细胞以获得起始材料

一般，少量多糖在细菌生长期间释放入培养基，因此起始材料可以是来自离心的细菌培养物的上清。

然而，起始材料通常由处理细菌自身制备，从而释放多糖。

任选地，在细胞生长后，使细菌细胞灭活。当使用致病菌时，尤其如此。例如，用于灭活的合适方法是苯酚:乙醇处理，例如，如Fattom等(1990)Infect lmmun.58(7):2367-74所述。在下面的实施方案中，所述细菌细胞可先灭活或不灭活。

能通过多种方法从细菌释放多糖，包括化学、物理或酶处理(参见例如WO2010151544,WO 2011/051917或WO2007084856)。

在一个实施方案中，处理其初始培养基的悬液中的细菌细胞(灭活或未灭活)。因此，该工艺可以用其初始培养基的悬液中的细胞起始。

在另一个实施方案中，所述细菌细胞在荚膜多糖释放前离心。因此，该工艺可用湿细胞糊体形式的细胞起始。或者，以干燥形式处理细胞。然而，通常，细菌细胞在离心后重悬于适合工艺中下一步骤的水性介质，如缓冲液或蒸馏水。细胞可在重悬前用此介质洗涤。

在一个实施方案中，用溶解剂处理所述细菌细胞(如其初始培养基的悬液中，湿细胞糊体形式、干燥形式或在离心后重悬于水性介质)。

“溶解剂”是有助于细胞壁降解的任何物质(agent)。

在一个实施方案中，所述溶解剂是洗涤剂。如本文所用，术语“洗涤剂”指能够诱导细菌细胞溶解的任何阴离子或阳离子洗涤剂。用于本发明方法的这类洗涤剂代表性示例包括脱氧胆酸钠(DOC)、N-月桂酰肌氨酸(NLS)、鹅脱氧胆酸钠和皂苷类(参见WO2008/118752，第13页第14行到第14页第10行)。在本发明的一个实施方案中，所述用于溶解细菌细胞的溶解剂是DOC。

在一个实施方案中，所述溶解剂是非动物源性溶解剂。在一个实施方案中，所述非动物源性溶解剂选自癸烷磺酸、叔辛苯氧基5聚(氧乙烯)乙醇(如

CA-630,CAS#:9002-93-1,可获自西格玛奥瑞奇(Sigma Aldrich),密苏里州圣路易斯)、辛基酚环氧乙烷缩合物(如

X-100,可获自西格玛奥瑞奇,密苏里州圣路易斯)、N-月桂酰肌氨酸钠(NLS)、月桂亚氨基二丙酸盐、十二烷基硫酸钠、鹅脱氧胆酸盐、猪脱氧胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、牛脱氧胆酸盐、牛磺鹅胆酸盐和胆酸盐。在一个实施方案中，所述非动物源性溶解剂是NLS。

在一个实施方案中，所述细菌细胞(如其初始培养基的悬液，湿细胞糊体形式、干燥形式或在离心后重悬于水性介质)进行酶处理，从而释放多糖。在一个实施方案中，所述细菌细胞通过选自以下的酶处理：溶葡球菌酶、变溶菌素、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶和变溶菌素与β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的组合。这些酶作用于细菌肽聚糖以释放荚膜多糖用于本发明，但也引起群特异性碳水化合物抗原释放。在一个实施方案中，所述细菌细胞由II型磷酸二酯酶(PDE2)处理。

任选地，在多糖释放后，灭活所述酶。用于灭活的合适方法是例如热处理或酸处理。

在一个实施方案中，所述细菌细胞(如其初始培养基悬液在，湿细胞糊体形式、干燥形式或在离心后重悬于水性介质)进行高压灭菌，从而释放多糖。

在另一个实施方案中，所述细菌细胞(如其初始培养基悬液中，湿细胞糊体形式、干燥形式或在离心后重悬于水性介质)进行化学处理，从而释放多糖。在这种实施方案中，所述化学处理可以是例如采用碱或酸的水解(参见例如WO2007084856)。

在一个实施方案中，所述细菌细胞化学处理是碱提取(如使用氢氧化钠)。碱提取能切割荚膜多糖与肽聚糖骨架之间的磷酸二酯键。在一个实施方案中，所述碱选自NaOH、KOH、LiOH、NaHCO₃、Na₂CO₃、K₂CO₃、KCN、Et₃N、NH₃、HzN₂H₂、NaH、NaOMe、NaOEt和KOtBu。碱处理后，可中和反应混合物。这可通过加入酸来实现。在一个实施方案中，在碱处理后通过选自以下的酸中和所述反应混合物：HCl、H₃PO₄、柠檬酸、乙酸、亚硝酸和硫酸。

在一个实施方案中，所述细菌细胞化学处理是酸处理(如硫酸)。在一个实施方案中，所述酸选自HCl、H₃PO₄、柠檬酸、乙酸、亚硝酸和硫酸。酸处理后，反应混合物可中和。这可通过加入碱来实现。在一个实施方案中，所述反应混合物在酸处理后通过选自以下的碱中和：NaOH、KOH、LiOH、NaHCO₃、Na₂CO₃、K₂CO₃、KCN、Et₃N、NH₃、HzN₂H₂、NaH、NaOMe、NaOEt和KOtBu。

1.2絮凝

本发明的方法包括絮凝步骤。发明人发现所述工艺产生低污染的纯化的多糖。

发明人的工艺可以是迅速且简单的。

因此，在本发明的方法中，通过上面章节1.1中任何方法获得的溶液经絮凝处理。

本发明中，术语“絮凝”指一种工艺，其中由于添加絮凝剂胶体以絮状物或薄片形式从悬液出来。

絮凝步骤包括将“絮凝剂”加入包含细菌多糖以及污染物的溶液。在一个实施方案中，所述污染物包括细菌细胞碎片、细菌细胞蛋白和核酸。在一个实施方案中，所述污染物包括细菌细胞蛋白和核酸。

如下面进一步所公开，絮凝步骤还能包括在加入絮凝剂之前或之后调节pH。尤其是所述溶液可酸化。

此外，加入絮凝剂和/或调节pH可在调至想要的水平的温度进行。

这些步骤能以任何顺序实施：

-加入絮凝剂，然后调节pH，接着调节温度或；

-加入絮凝剂，然后调节温度，接着调节pH或；

-调节pH，然后加入絮凝剂，接着调节温度或；

-调节pH，然后调节温度，接着加入絮凝剂或；

-调节温度，然后加入絮凝剂，接着调节pH或；

-调节温度，然后调节pH，接着加入絮凝剂。

此外，加入絮凝剂和/或调节pH后，溶液可维持一些时间以允许絮状物在下游加工前沉淀。

本发明中，“絮凝剂”指能够允许在包含感兴趣多糖以及污染物的溶液中促进絮凝的物质，这是通过引起胶体和其他悬浮颗粒以絮状物或薄片形式聚集进行的，而感兴趣多糖明显保持在溶液中。

在本发明的一个实施方案中，所述絮凝剂包含多价阳离子。在一个实施方案中，所述絮凝剂是多价阳离子。在一个优选的实施方案中，所述多价阳离子选自铝、铁、钙和镁。在一个实施方案中，所述絮凝剂是选自以下的至少2种多价阳离子的混合物：铝、铁、钙和镁。在一个实施方案中，所述絮凝剂是选自以下的至少3种多价阳离子的混合物：铝、铁、钙和镁。在一个实施方案中，所述絮凝剂是选自以下的至少4种多价阳离子的混合物：铝、铁、钙和镁。

在一个实施方案中，所述絮凝剂包含选自以下的物质：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、聚乙烯亚胺(PEI)、铝酸钠和硅酸钠。在一个实施方案中，所述絮凝剂选自明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、铝酸钠和硅酸钠。在一个实施方案中，所述絮凝剂是聚乙烯亚胺(PEI)。在一个实施方案中，所述絮凝剂包含明矾。在一个实施方案中，所述絮凝剂是明矾。在一个实施方案中，所述絮凝剂包含钾明矾。在一个实施方案中，所述絮凝剂是钾明矾。在一个实施方案中，所述絮凝剂包含钠明矾。在一个实施方案中，所述絮凝剂是钠明矾。在一个实施方案中，所述絮凝剂包含铵明矾。在一个实施方案中，所述絮凝剂是铵明矾。

在一个实施方案中，所述絮凝剂是选自以下的物质(如2、3或4种物质)的混合物：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、聚乙烯亚胺(PEI)、铝酸钠和硅酸钠。在一个实施方案中，所述絮凝剂选自明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、铝酸钠和硅酸钠。

在一个实施方案中，所述絮凝剂是选自以下的2种物质的混合物：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、铝酸钠和硅酸钠。在一个实施方案中，所述絮凝剂是选自以下的至少3种物质的混合物：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、铝酸钠和硅酸钠。

在一个实施方案中，所述絮凝剂包含选自以下的物质：壳聚糖、鱼胶、辣木(moringa oleifera)种子(辣木)、明胶、马钱子(strychnos potatorum)种子(Nirmali坚果树)、瓜尔豆胶和藻酸盐(如棕色海藻提取物)。在一个实施方案中，所述絮凝剂选自壳聚糖、鱼胶、辣木种子(辣木)、明胶、马钱子种子(Nirmali坚果树)、瓜尔豆胶和藻酸盐(如棕色海藻提取物)。

絮凝剂浓度可取决于所用物质、感兴趣多糖和絮凝步骤参数(如温度等)。

在絮凝剂包含或是明矾的实施方案中，能使用浓度约0.1-20％(w/v)的絮凝剂。优选使用浓度约0.5-10％(w/v)的絮凝剂。甚至更优选使用浓度约1-5％(w/v)的絮凝剂。

上述范围内的任意数被视作本公开的实施方案。

在一个实施方案中，所述使用的絮凝剂浓度是约0.1、约0.25、约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10％(w/v)。在一个实施方案中，所述使用的絮凝剂浓度是约10.5、约11.0、约11.5、约12.0、约12.5、约13.0、约13.5、约14.0、约14.5、约15.0、约15.5、约16.0、约16.5、约17.0、约17.5、约18.0、约18.5、约19.0、约19.5或约20.0％(w/v)。在一个实施方案中，所述使用的絮凝剂浓度是约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5或约5.0％(w/v)。在一个实施方案中，所述使用的絮凝剂浓度是约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5或约4.0％(w/v)。

在本发明的一些实施方案中，所述絮凝剂在某一时间段中加入。在本发明的一些实施方案中，所述絮凝剂在数秒(如1-10秒)-约1个月的时间段中加入。在一些实施方案中，所述絮凝剂在约2秒-约2周的时间段中加入。在本发明的一些实施方案中，所述絮凝剂在约1分钟-约1周的时间段中加入。在一些实施方案中，所述絮凝剂在约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟,约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时,约23小时或约24小时到约2天的时间段中加入。

因此，在某些实施方案中，所述絮凝剂在约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时到约1天的时间段中加入。

优选地，絮凝剂在约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时到约1天的时间段中加入。

在某些实施方案中，所述絮凝剂在约15分钟-约3小时的时间段中加入。在某些实施方案中，所述絮凝剂在约30分钟-约120分钟的时间段中加入。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

絮凝剂可在约2秒、约10秒、约30秒、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天的时间段中加入。

在一个实施方案中，所述絮凝剂在没有搅拌的情况下加入。在另一个实施方案中，所述絮凝剂在搅拌下加入。在另一个实施方案中，所述絮凝剂在温和搅拌下加入。在另一个实施方案中，所述絮凝剂在剧烈搅拌下加入。

本发明还意外发现絮凝在酸性pH进行时得到改善。

因此，在本发明的一个实施方案中，所述絮凝步骤在低于7.0、6.0、5.0或4.0的pH进行。在本发明的一个特定实施方案中，所述絮凝步骤在7.0-1.0的pH进行。在一个实施方案中，所述絮凝步骤在5.5-2.5、5.0-2.5、4.5-2.5、4.0-2.5、5.5-3.0、5.0-3.0、4.5-3.0、4.0-3.0、5.5-3.5、5.0-3.5、4.5-3.5或4.0-3.5的pH进行。在一个实施方案中，所述絮凝步骤在约5.5、约5.0、约4.5、约4.0、约3.5、约3.0、约2.5、约2.0、约1.5或约1.0的pH进行。在一个实施方案中，所述絮凝步骤在约4.0、约3.5、约3.0或约2.5的pH进行。在一个实施方案中，所述絮凝步骤在约3.5的pH进行。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述酸性pH通过酸化溶液获得，所述溶液由上面章节1.1中的任何方法获得或如章节1.2所公开用酸进一步澄清。在一个实施方案中，所述酸选自HCl、H₃PO₄、柠檬酸,乙酸、亚硝酸和硫酸。在一个实施方案中，所述酸是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸。在一个实施方案中，所述酸是HCl(盐酸)。在一个实施方案中，所述酸是硫酸。

在一个实施方案中，所述酸在没有搅拌的情况下加入。优选地，所述酸在搅拌下加入。在一个实施方案中，所述酸在温和搅拌下加入。在一个实施方案中，所述酸在剧烈搅拌下加入。

在本发明的一些实施方案中，所述溶液在加入絮凝剂(和任选地酸化)后维持一些时间，以允许絮状物在下游加工前沉淀。

在本发明的一些实施方案中，所述絮凝步骤的沉淀时间是数秒(如2-10秒)-约1分钟。优选地，沉淀时间是至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约115、至少约120、至少约125、至少约130、至少约135、至少约140、至少约145、至少约150、至少约155或至少约160分钟。优选地，沉淀时间小于1周，然而，沉淀时间可以更长。

因此，在某实施方案中，所述沉淀时间是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380、约1440分钟、约2天、约3天、约4天、约5天或约6天到1周。

在本发明的一些实施方案中，所述沉淀时间是数秒(如1-10秒)-约1个月。在一些实施方案中，所述沉淀时间是约2秒-约2周。在本发明的一些实施方案中，所述沉淀时间是约1分钟-约1周。在一些实施方案中，所述沉淀时间是约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时到约2天。

因此，在某实施方案中，所述沉淀时间是约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时到约1天。

优选地，所述沉淀时间是约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时到约1天。

在某实施方案中，所述沉淀时间是约15分钟-约3小时。在某实施方案中，所述沉淀时间是约30分钟-约120分钟。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在某实施方案中，所述沉淀时间是约2秒、约10秒、约30秒、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天。

优选地，沉淀时间是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约60、约90、约120、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380或约1440分钟到2天。在某些实施方案中，所述沉淀时间是约5分钟-约1天。在某些实施方案中，所述沉淀时间是约5分钟-约120分钟。

沉淀时间可以是约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟或约160分钟。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述任选存在的沉淀步骤在没有搅拌的情况下进行。在一个实施方案中，所述任选存在的沉淀步骤在搅拌下进行。在另一个实施方案中，所述任选存在的沉淀步骤在温和搅拌下加入。在另一个实施方案中，所述任选存在的沉淀步骤在剧烈搅拌下加入。

在本发明的一个实施方案中，所述加入絮凝剂、溶液沉淀和/或pH调节在约4℃-约30℃的温度进行。在一个实施方案中，所述加入絮凝剂、溶液沉淀和/或pH调节在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度进行。在一个实施方案中，所述加入絮凝剂、溶液沉淀和/或pH调节在约20℃的温度进行。发明者意外发现絮凝在高温进行时能进一步改善。因此，在本发明的一个特定实施方案中，所述加入絮凝剂、溶液沉淀和/或pH调节在约30℃-约95℃的温度进行。在一个实施方案中，所述加入絮凝剂、溶液沉淀和/或pH调节在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。在一个实施方案中，所述加入絮凝剂、溶液沉淀和/或pH调节在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。在一个实施方案中，所述加入絮凝剂、溶液沉淀和/或pH调节在约50℃的温度进行。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述加入絮凝剂在任何上述温度进行。

在一个实施方案中，所述加入絮凝剂后的溶液沉淀在任何上述温度进行。

在一个实施方案中，所述pH调节在任何上述温度进行。

在一个实施方案中，所述加入絮凝剂和加入絮凝剂后的溶液沉淀在任何上述温度进行。

在一个实施方案中，所述加入絮凝剂和pH调节在任何上述温度进行。

在一个实施方案中，所述加入絮凝剂、加入絮凝剂后的溶液沉淀和pH调节在任何上述温度进行。

在一个实施方案中，所述絮凝步骤包括加入絮凝剂(如上所公开)，而没有pH调节。

在一个实施方案中，所述絮凝步骤包括加入絮凝剂和溶液沉淀(如上所公开)，而没有pH调节。

在一个实施方案中，所述絮凝步骤包括加入絮凝剂，调节pH和溶液沉淀(如上所公开)。在一个实施方案中，所述絮凝剂在调节pH前加入。在另一个实施方案中，所述pH在加入絮凝剂前调节。

在一个实施方案中，所述絮凝步骤包括加入絮凝剂，溶液沉淀和调节pH(如上所公开)。在一个实施方案中，所述加入絮凝剂和溶液沉淀在调节pH前进行。在另一个实施方案中，所述pH在加入絮凝剂和溶液沉淀前调节。在一个实施方案中，所述加入絮凝剂和调节pH在溶液沉淀前进行。在另一个实施方案中，所述pH在加入絮凝剂和溶液沉淀前调节。

在一个实施方案中，所述絮凝步骤包括加入絮凝剂，调节pH和调节温度(如上所公开)。

这些步骤能以任何顺序实施：

-加入絮凝剂，然后调节pH，接着调节温度或；

-加入絮凝剂，然后调节温度，接着调节pH或；

-调节pH，然后加入絮凝剂，接着调节温度或；

-调节pH，然后调节温度，接着加入絮凝剂或；

-调节温度，然后加入絮凝剂，接着调节pH或；

-调节温度，然后调节pH，接着加入絮凝剂。

1.3固体/液体分离

经絮凝的材料能通过任何适当固体/液体分离方法与感兴趣多糖分离。

因此，在本发明的一个实施方案中，絮凝后，通过倾析、沉积(sediment)、过滤或离心使悬液(如上面章节1.2所得)澄清。在一个实施方案中，所述含多糖溶液随后收集用于存储和/或额外加工。

在本发明的一个实施方案中，絮凝后，通过倾析使悬液(如上面章节1.2所得)澄清。滗析器用于分离液体，其中液体之间有显著密度差异以使絮状物沉淀。在操作滗析器时，有3个不同区域：澄清的重液，分开的分散液体(分散区)和澄清的轻液。为产生澄清溶液，一般必须在容器内留少量溶液。滗析器能设计用于连续操作。

在本发明的一个实施方案中，絮凝后，通过沉淀使悬液(如上面章节1.2所得)澄清。沉淀是悬浮的固体颗粒与液体混合物分开，这是通过重力沉降成澄清液体和更高固体含量的浆体进行的。沉淀能在浓缩机、澄清器或分类器中完成。由于浓缩和澄清在用于处理大体积液体时是相对低廉的工艺，其能用于预浓缩待过滤的进料。

在本发明的一个实施方案中，所述絮凝后的悬液(如上面章节1.2所得)通过离心澄清。在一个实施方案中，所述离心是连续离心。在一个实施方案中，所述离心是斗式离心。在一个实施方案中，随后收集所述含多糖上清用于存储和/或额外加工。

在一些实施方案中，所述悬液在约1,000g、约2,000g、约3,000g、约4,000g、约5,000g、约6,000g、约8,000g,约9,000g、约10,000g、约11,000g,约12,000g、约13,000g、约14,000g、约15,000g、约16,000g,约17,000g、约18,000g、约19,000g、约20,000g、约25,000g、约30,000g、约35,000g,约40,000g、约50,000g、约60,000g、约70,000g、约80,000g、约90,000g、约100,000g、约120,000g、约140,000g、约160,000g或约180,000g离心。在一些实施方案中，所述悬液在约8,000g,约9,000g,约10,000g,约11,000g、约12,000g、约13,000g、约14,000g、约15,000g、约16,000g、约17,000g、约18,000g、约19,000g、约20,000g或约25,000g离心。

在一些实施方案中，所述悬液在约5,000g-约25,000g离心。在一些实施方案中，所述悬液在约8,000g-约20,000g离心。在一些实施方案中，所述悬液在约10,000g-约15,000g离心。在一些实施方案中，所述悬液在约10,000g-约12,000g离心。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一些实施方案中，所述悬液在至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155或至少160分钟期间离心。离心时间优选小于24小时。

因此，在某些实施方案中，所述悬液在约5、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320或约1380分钟到1440分钟期间离心。

优选地，悬液在约5、约10、约15、约20、约25、约30、约60、约90、约120、约180、约240、约300、约360、约420、约480或约540分钟到约600分钟期间离心。在某些实施方案中，所述悬液在约5分钟-约3小时期间离心。在某些实施方案中，所述悬液在约5分钟-约120分钟期间离心。

悬液可在约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟或约155分钟到约160分钟期间离心。

悬液可在约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟或约55分钟到约60分钟期间离心。

悬液可在约5、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380分钟或约1440分钟期间离心。

悬液可在约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟或约160分钟期间离心。

悬液可在约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟或约60分钟期间离心。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在本发明的一个实施方案中，所述离心是连续离心。在所述实施方案中，所述进料速度可以是50-5000ml/min、100-4000ml/min、150-3000ml/min、200-2500ml/min、250-2000ml/min、300-1500ml/min、300-1000ml/min、200-1000ml/min、200-1500ml/min、400-1500ml/min、500-1500ml/min、500-1000ml/min、500-2000ml/min、500-2500ml/min或1000-2500ml/min。

在一个实施方案中，所述进料速度可以是约10、约25、约50、约75、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约1400、约1450、约1500、约1650约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3250、约3500、约3750约4000、约4250、约4500或约5000ml/min。

在本发明的一个实施方案中，絮凝后通过过滤使悬液(如上面章节1.2所得)澄清。在过滤中，溶液中悬浮的固体颗粒如下去除：使混合物通过多孔介质，所述介质保留颗粒并令澄清滤液通过。过滤通过重力在筛上或者通过真空、压力或离心在滤器上进行。固体能保留在滤器介质表面上，这是饼过滤，或在滤器介质内捕获，这是深层过滤。在一个实施方案中，絮凝后，通过微滤使悬液(如上面章节1.2所得)澄清。在一个实施方案中，所述微滤是切向微滤。在另一个实施方案中，所述微滤是死端过滤(垂直过滤)。在一个实施方案中，所述微滤是死端过滤，其中硅藻土(DE)也称为DE硅藻土，用作助滤剂以促进和提高固体/液体分离效率。因此，在一个实施方案中，絮凝后，通过包含硅藻土(DE)的死端过滤使悬液(如上面章节1.2所得)澄清。DE能浸渍(或纳入)到死端过滤器内，作为深层滤芯的主要部分。

另一形式中，DE能以粉末形式加入经絮凝的溶液(如章节1.2后所得)。后一种情况中，DE处理的经絮凝的溶液可通过深层过滤进一步澄清。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.45-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米或约1.75-2微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的标称的保留等级是约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的标称的保留等级是约0.45微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-5000L/m²、200-5000L/m²、300-5000L/m²、400-5000L/m²、500-5000L/m²、750-5000L/m²、1000-5000L/m²、1500-5000L/m²、2000-5000L/m²、3000-5000L/m²或4000-5000L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-2500L/m²、200-2500L/m²、300-2500L/m²、400-2500L/m²、500-2500L/m²、750-2500L/m²、1000-2500L/m²、1500-2500L/m²或2000-2500L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-1500L/m²、200-1500L/m²、300-1500L/m²、400-1500L/m²、500-1500L/m²、750-1500L/m²或1000-1500L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-1250L/m²、200-1250L/m²、300-1250L/m²、400-1250L/m²、500-1250L/m²、750-1250L/m²或1000-1250L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-1000L/m²、200-1000L/m²、300-1000L/m²、400-1000L/m²、500-1000L/m²或750-1000L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-750L/m²、200-750L/m²、300-750L/m²、400-750L/m²或500-750L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-600L/m²、200-600L/m²、300-600L/m²、400-600L/m²或400-600L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-500L/m²、200-500L/m²、300-500L/m²或400-500L/m²。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约1400、约1450、约1500、约1550、约1600、约1650、约1700、约1750、约1800,约1850、约1900、约1950、约2000、约2050、约2100、约2150、约2200、约2250、约2300、约2350、约2400、约2450或约2500L/m²。

上述固体/液体分离方法能以独立形式或者任意顺序的2个的组合或任意顺序的3个的组合使用。

1.4过滤(如深层过滤)

溶液通过上面章节1.2的絮凝步骤和/或上面章节1.3的固体/液体分离步骤处理后，含有多糖的溶液(如上清)可以任选地进一步澄清。

在一个实施方案中，过滤所述溶液，从而产生进一步澄清的溶液。在一个实施方案中，所述过滤直接应用于通过上面章节1.2中任何方法获得的溶液。在一个实施方案中，所述过滤应用于通过上面章节1.3所述固体/液体分离步骤进一步澄清的溶液。

在一个实施方案中，所述溶液由选自以下的过滤步骤处理：深层过滤、通过活性炭过滤、尺寸过滤、透析过滤和超滤。在一个实施方案中，所述溶液通过透析过滤步骤处理，尤其是切向流过滤。在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理。

深层滤器使用多孔过滤介质以保留颗粒遍布介质，而不是仅在介质表面。不像在表面上，由于过滤介质的弯曲和通道样性质，颗粒保留在介质结构内。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器设计选自盒(cassette)、筒(cartridge)、深床(如砂滤器)和透镜状滤器。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-100微米、约0.05-100微米、约0.1-100微米、约0.2-100微米、约0.3-100微米、约0.4-100微米、约0.5-100微米、约0.6-100微米、约0.7-100微米、约0.8-100微米、约0.9-100微米、约1-100微米、约1.25-100微米、约1.5-100微米、约1.75-100微米、约2-100微米、约3-100微米、约4-100微米、约5-100微米、约6-100微米、约7-100微米、约8-100微米、约9-100微米、约10-100微米、约15-100微米、约20-100微米、约25-100微米、约30-100微米、约40-100微米、约50-100微米或约75-100微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-75微米、约0.05-75微米、约0.1-75微米、约0.2-75微米、约0.3-75微米、约0.4-75微米、约0.5-75微米、约0.6-75微米、约0.7-75微米、约0.8-75微米、约0.9-75微米、约1-75微米、约1.25-75微米、约1.5-75微米、约1.75-75微米、约2-75微米、约3-75微米、约4-75微米、约5-75微米、约6-75微米、约7-75微米、约8-75微米、约9-75微米、约10-75微米、约15-75微米、约20-75微米、约25-75微米、约30-75微米、约40-75微米或约50-75微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-50微米、约0.05-50微米、约0.1-50微米、约0.2-50微米、约0.3-50微米、约0.4-50微米、约0.5-50微米、约0.6-50微米、约0.7-50微米、约0.8-50微米、约0.9-50微米、约1-50微米、约1.25-50微米、约1.5-50微米、约1.75-50微米、约2-50微米、约3-50微米、约4-50微米、约5-50微米、约6-50微米、约7-50微米、约8-50微米、约9-50微米、约10-50微米、约15-50微米、约20-50微米、约25-50微米、约30-50微米、约40-50微米或约50-50微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-25微米、约0.05-25微米、约0.1-25微米、约0.2-25微米、约0.3-25微米、约0.4-25微米、约0.5-25微米、约0.6-25微米、约0.7-25微米、约0.8-25微米、约0.9-25微米、约1-25微米、约1.25-25微米、约1.5-25微米、约1.75-25微米、约2-25微米、约3-25微米、约4-25微米、约5-25微米、约6-25微米、约7-25微米、约8-25微米、约9-25微米、约10-25微米、约15-25微米或约20-25微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-10微米、约0.05-10微米、约0.1-10微米、约0.2-10微米、约0.3-10微米、约0.4-10微米、约0.5-10微米、约0.6-10微米、约0.7-10微米、约0.8-10微米、约0.9-10微米、约1-10微米、约1.25-10微米、约1.5-10微米、约1.75-10微米、约2-10微米、约3-10微米、约4-10微米、约5-10微米、约6-10微米、约7-10微米、约8-10微米或约9-10微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-8微米、约0.05-8微米、约0.1-8微米、约0.2-8微米、约0.3-8微米、约0.4-8微米、约0.5-8微米、约0.6-8微米、约0.7-8微米、约0.8-8微米、约0.9-8微米、约1-8微米、约1.25-8微米、约1.5-8微米、约1.75-8微米、约2-8微米、约3-8微米、约4-8微米、约5-8微米、约6-8微米或约7-8微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-5微米、约0.05-5微米、约0.1-5微米、约0.2-5微米、约0.3-5微米、约0.4-5微米、约0.5-5微米、约0.6-5微米、约0.7-5微米、约0.8-5微米、约0.9-5微米、约1-5微米、约1.25-5微米、约1.5-5微米、约1.75-5微米、约2-5微米、约3-5微米或约4-5微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米、约1.75-2微米、约2-2微米、约3-2微米或约4-2微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的标称的保留范围是约0.05-50微米、0.1-25微米0.2-10、微米0.1-10微米、0.2-5微米或0.25-1微米。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-2500L/m²、5-2500L/m²、10-2500L/m²、25-2500L/m²、50-2500L/m²、75-2500L/m²、100-2500L/m²、150-2500L/m²、200-2500L/m²、300-2500L/m²、400-2500L/m²、500-2500L/m²、750-2500L/m²、1000-2500L/m²、1500-2500L/m²或2000-2500L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-1000L/m²、5-1000L/m²、10-1000L/m²、25-1000L/m²、50-1000L/m²、75-1000L/m²、100-1000L/m²、150-1000L/m²、200-1000L/m²、300-1000L/m²、400-1000L/m²、500-1000L/m²或750-1000L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-750L/m²、5-750L/m²、10-750L/m²、25-750L/m²、50-750L/m²、75-750L/m²、100-750L/m²、150-750L/m²、200-750L/m²、300-750L/m²、400-750L/m²或500-750L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-500L/m²、5-500L/m²、10-500L/m²、25-500L/m²、50-500L/m²、75-500L/m²、100-500L/m²、150-500L/m²、200-500L/m²、300-500L/m²或400-500L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-400L/m²、5-400L/m²、10-400L/m²、25-400L/m²、50-400L/m²、75-400L/m²、100-400L/m²、150-400L/m²、200-400L/m²或300-400L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-300L/m²、5-300L/m²、10-300L/m²、25-300L/m²、50-300L/m²、75-300L/m²、100-300L/m²、150-300L/m²或200-300L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-200L/m²、5-200L/m²、10-200L/m²、25-200L/m²、50-200L/m²、75-200L/m²、100-200L/m²或150-200L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-100L/m²、5-100L/m²、10-100L/m²、25-100L/m²、50-100L/m²或75-100L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中深层过滤器的过滤容积是1-50L/m²、5-50L/m²、10-50L/m²或25-50L/m²。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中进料速度是1-1000LMH(升/m²/小时)、10-1000LMH、25-1000LMH、50-1000LMH、100-1000LMH、125-1000LMH、150-1000LMH、200-1000LMH、250-1000LMH、300-1000LMH、400-1000LMH、500-1000LMH、600-1000LMH、700-1000LMH、800-1000LMH或900-1000LMH。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中进料速度是1-500LMH、10-500LMH、25-500LMH、50-500LMH、100-500LMH、125-500LMH、150-500LMH、200-500LMH、250-500LMH、300-500LMH或400-500LMH。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中进料速度是1-400LMH、10-400LMH、25-400LMH、50-400LMH、100-400LMH、125-400LMH、150-400LMH、200-400LMH、250-400LMH或300-400LMH。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中进料速度是1-250LMH、10-250LMH、25-250LMH、50-250LMH、100-250LMH、125-250LMH、150-250LMH或200-250LMH。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中进料速度是约1、约2、约5、约10、约25、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240约250、约260、约270、约280、约290、约300、约310、约320、约330、约340、约350、约360、约370、约380、约390、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000LMH。

1.5任选存在的进一步过滤

溶液通过上面章节1.4的过滤步骤处理后，所得溶液(即滤液)可任选地进一步澄清。

在一个实施方案中，所述溶液经历微滤。在一个实施方案中，所述微滤是死端过滤(垂直过滤)。在一个实施方案中，所述微滤是切向微滤。

在一个实施方案中，所述溶液通过深层过滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2微米。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约1400、约1450、约1500、约1550、约1600、约1650、约1700、约1750、约1800、约1850、约1900、约1950、约2000、约2050、约2100、约2150、约2200、约2250、约2300、约2350、约2400、约2450或约2500L/m²。

1.6超滤和/或透析过滤

溶液通过上面章节1.4中的任何方法和/或上面章节1.5的过滤步骤过滤后，所得溶液(即滤液)可任选地进一步通过超滤和/或透析过滤澄清。

超滤(UF)是浓缩稀释产物流的工艺。UF基于膜孔径或分子量截取值(MWCO)分离溶液中的分子。在本发明的一个实施方案中，所述溶液(如上面章节1.5或1.6所得滤液)通过超滤处理。

在一个实施方案中，所述溶液通过超滤处理且膜的分子量截取值范围是约5kDa-1000kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约10kDa-750kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约10kDa-500kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约10kDa-300kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约10kDa-100kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约10kDa-50kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约10kDa-30kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约5kDa-1000kDa、约10kDa-1000kDa、约20kDa-1000kDa、约30kDa-1000kDa、约40kDa-1000kDa、约50kDa-1000kDa、约75kDa-1000kDa、约100kDa-1000kDa、约150kDa-1000kDa、约200kDa-1000kDa、约300kDa-1000kDa、约400kDa-1000kDa、约500kDa-1000kDa或约750kDa-1000kDa。

在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约5kDa-500kDa、约10kDa-500kDa、约20kDa-500kDa、约30kDa-500kDa、约40kDa-500kDa、约50kDa-500kDa、约75kDa-500kDa、约100kDa-500kDa、约150kDa-500kDa、约200kDa-500kDa、约300kDa-500kDa或约400kDa-500kDa。

在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约5kDa-300kDa、约10kDa-300kDa、约20kDa-300kDa、约30kDa-300kDa、约40kDa-300kDa、约50kDa-300kDa、约75kDa-300kDa、约100kDa-300kDa、约150kDa-300kDa或约200kDa-300kDa。

在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约5kDa-100kDa、约10kDa-100kDa、约20kDa-100kDa、约30kDa-100kDa、约40kDa-100kDa、约50kDa-100kDa或约75kDa-100kDa。

在一个实施方案中，所述膜的分子量截取值范围是约5kDa、约10kDa、约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50kDa、约60kDa、约70kDa、约80kDa、约90kDa、约100kDa、约110kDa、约120kDa、约130kDa、约140kDa、约150kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约400kDa、约500kDa、约750kDa或约1000kDa。

在一个实施方案中，所述超滤步骤的浓缩因数是约1.5-10。在一个实施方案中，所述浓缩因数是约2-8。在一个实施方案中，所述浓缩因数是约2-5。

在一个实施方案中，所述浓缩因数是约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。在一个实施方案中，所述浓缩因数是约2、约3、约4、约5或约6。

在本发明的一个实施方案中，所述溶液(如上面章节1.4或1.5所得滤液)通过透析过滤处理。

在本发明的一个实施方案中，所述如本章节所公开超滤(UF)后获得的溶液通过透析过滤(UF/DF处理)进一步处理。

透析过滤(DF)用于将产物交换到所需缓冲溶液(或仅水)。在一个实施方案中，所述透析过滤用于在恒定体积下改变所保留溶液的化学性质。不需要的颗粒穿过膜，而进料流的构成通过加入替代溶液(缓冲溶液、盐水溶液、缓冲盐水溶液或水)变成更想要的状态。

在一个实施方案中，所述替代溶液是水。

在一个实施方案中，所述替代溶液是溶于水的盐水。在一些实施方案中，所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。在一个特定实施方案中，所述盐是氯化钠。在一个实施方案中，所述替代溶液是氯化钠，其为约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM,约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM。在一个特定实施方案中，所述替代溶液是氯化钠，其为约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM,约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约250mM或约300mM。

在一个实施方案中，所述替代溶液是缓冲溶液。在一个实施方案中，所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自N-(2-乙酰胺基)-氨基乙磺酸(ACES)、乙酸的盐(乙酸盐)、N-(2-乙酰胺基)-亚氨基二乙酸(ADA)、2-氨基乙磺酸(AES、牛磺酸)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇AMPD、ammediol、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、碳酸氢钠(碳酸氢盐)、N,N’-双(2-羟乙基)-甘氨酸(二甘氨酸)、[双(2-羟乙基)-亚氨基]-三(羟甲基甲烷)(BIS-Tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(BIS-Tris-丙烷)、硼酸、二甲胂酸(甲次砷酸盐)、3-(环己胺)-丙磺酸(CAPS)、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、碳酸钠(碳酸盐)、环己胺乙磺酸(CHES)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、甲酸的盐(甲酸盐),甘氨酸、双甘氨肽、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-乙磺酸(HEPES)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-3-丙磺酸(HEPPS、EPPS)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、咪唑、苹果酸的盐(苹果酸盐)、马来酸的盐(马来酸盐)、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、磷酸的盐(磷酸盐)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、吡啶、琥珀酸的盐(琥珀酸盐)、3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(TAPS)、3-[N-三(羟甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、三乙醇胺(TEA)、2-[三(羟甲基)-甲氨基]-乙磺酸(TES)、N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(Tricine)和三(羟甲基)-甲胺(Tris)。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液选自乙酸的盐(乙酸盐)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、甲酸的盐(甲酸盐)、苹果酸的盐(苹果酸盐)、马来酸的盐(马来酸盐)、磷酸的盐(磷酸盐)和琥珀酸的盐(琥珀酸盐)。在一个实施方案中，所述透析缓冲液是柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。在一个实施方案中，所述透析缓冲液是琥珀酸的盐(琥珀酸盐)。在一个实施方案中，所述盐是钠盐。在一个实施方案中，所述盐是钾盐。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的pH是约4.0-11.0、约5.0-10.0、约5.5-9.0、约6.0-8.0、约6.0-7.0、约6.5-7.5、约6.5-7.0或约6.0-7.5。上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的pH是约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5或约11.0。在一个实施方案中，所述透析缓冲液的pH是约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0。在一个实施方案中，所述透析缓冲液的pH是约6.5、约7.0或约7.5。在一个实施方案中，所述透析缓冲液的pH是约7.0。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-100mM、约0.1mM-100mM、约0.5mM-100mM、约1mM-100mM、约2mM-100mM、约3mM-100mM、约4mM-100mM、约5mM-100mM、约6mM-100mM、约7mM-100mM、约8mM-100mM、约9mM-100mM、约10mM-100mM、约11mM-100mM、约12mM-100mM、约13mM-100mM、约14mM-100mM、约15mM-100mM、约16mM-100mM、约17mM-100mM、约18mM-100mM、约19mM-100mM、约20mM-100mM、约25mM-100mM、约30mM-100mM、约35mM-100mM、约40mM-100mM、约45mM-100mM、约50mM-100mM、约55mM-100mM、约60mM-100mM、约65mM-100mM、约70mM-100mM、约75mM-100mM、约80mM-100mM、约85mM-100mM、约90mM-100mM或约95mM-100mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-50mM、约0.1mM-50mM、约0.5mM-50mM、约1mM-50mM、约2mM-50mM、约3mM-50mM、约4mM-50mM、约5mM-50mM、约6mM-50mM、约7mM-50mM、约8mM-50mM、约9mM-50mM、约10mM-50mM、约11mM-50mM、约12mM-50mM、约13mM-50mM、约14mM-50mM、约15mM-50mM、约16mM-50mM、约17mM-50mM、约18mM-50mM、约19mM-50mM、约20mM-50mM、约25mM-50mM、约30mM-50mM、约35mM-50mM、约40mM-50mM或约45mM-50mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-25mM、约0.1mM-25mM、约0.5mM-25mM、约1mM-25mM、约2mM-25mM、约3mM-25mM、约4mM-25mM、约5mM-25mM、约6mM-25mM、约7mM-25mM、约8mM-25mM、约9mM-25mM、约10mM-25mM、约11mM-25mM、约12mM-25mM、约13mM-25mM、约14mM-25mM、约15mM-25mM、约16mM-25mM、约17mM-25mM、约18mM-25mM、约19mM-25mM或约20mM-25mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-15mM、约0.1mM-15mM、约0.5mM-15mM、约1mM-15mM、约2mM-15mM、约3mM-15mM、约4mM-15mM、约5mM-15mM、约6mM-15mM、约7mM-15mM、约8mM-15mM、约9mM-15mM、约10mM-15mM、约11mM-15mM、约12mM-15mM、约13mM-15mM或约14mM-15mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-10mM、约0.1mM-10mM、约0.5mM-10mM、约1mM-10mM、约2mM-10mM、约3mM-10mM、约4mM-10mM、约5mM-10mM、约6mM-10mM、约7mM-10mM、约8mM-10mM或约9mM-10mM。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓过滤冲液的浓度是约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95或约100mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.1mM、约0.2mM、约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约30mM、约40mM或约50mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约10mM。

在一个实施方案中，所述替代溶液包含螯合剂。在一个实施方案中，所述替代溶液包含明矾螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸盐(EDTA)、N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸(EDTA-OH)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、1,2-环己二胺-N,N,N',N'-四乙酸(CyDTA)、二亚乙基三胺-N,N,N',N",N"-五乙酸(DTPA)、1,3-二氨基丙-2-醇-N,N,N',N'-四乙酸(DPTA-OH)、乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯乙酸)(EDDHA)、乙二胺-N,N'-二丙酸二盐酸盐(EDDP)、乙二胺-四(亚甲基磺酸)(EDTPO)、次氮基三(亚甲基膦酸)(NTPO)、亚氨基二乙酸(IDA)、异亚硝基-二乙酸(HIDA)、次氮基三乙酸(NTP)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、二巯基丁二酸(DMSA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)、α硫辛酸(ALA)、次氮基三乙酸(NTA)、呋喃硫胺(TTFD)、二巯基丙醇、青霉胺、去铁胺(DFOA)、地拉罗司、膦酸盐、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。

在一些实施方案中，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸盐(EDTA)、N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸(EDTA-OH)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、1,2-环己二胺-N,N,N',N'-四乙酸(CyDTA)、二亚乙基三胺-N,N,N',N",N"-五乙酸(DTPA)、1,3-二氨基丙-2-醇-N,N,N',N'-四乙酸(DPTA-OH)、乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯乙酸)(EDDHA),柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。

在一些实施方案中，所述螯合剂是乙二胺四乙酸盐(EDTA)。

在一些实施方案中，所述螯合剂是柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。在一些实施方案中，所述螯合剂是柠檬酸钠。

一般，螯合剂以1-500mM浓度使用。在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是2-400mM。在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-400mM。在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-200mM。在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-100mM。在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-50mM。在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-30mM。

在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM,约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约45mM、约50mM,约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95或约100mM。

在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM或约100mM。

在一个实施方案中，所述替代溶液中的螯合剂浓度是约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲溶液包含盐。在一些实施方案中，所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。在一个特定实施方案中，所述盐是氯化钠。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲溶液包含氯化钠，其是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100,约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500mM。在一个特定实施方案中，所述透析缓冲溶液包含氯化钠，其是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mM。

在本发明的一个实施方案中，所述透析体积数是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50。在本发明的一个实施方案中，所述透析体积数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85,约90、约95或约100。在本发明的一个实施方案中，所述透析体积数是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。

在本发明的一个实施方案中，所述超滤和透析过滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。在一个实施方案中，所述超滤和透析过滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述超滤和透析过滤步骤在以下温度进行：约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃。在一个实施方案中，所述超滤和透析过滤步骤在约50℃的温度进行。

在本发明的一个实施方案中，所述透析过滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。在一个实施方案中，所述透析过滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述透析过滤步骤在以下温度进行：约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃。在一个实施方案中，所述透析过滤步骤在约50℃的温度进行。

在本发明的一个实施方案中，所述超滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。在一个实施方案中，所述超滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述超滤步骤在以下温度进行：约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃。在一个实施方案中，所述超滤步骤在约50℃的温度进行。

1.7活性炭过滤

溶液通过上面章节1.2的絮凝步骤处理后，含有多糖的溶液(如上清)可任选地通过活性炭过滤步骤进一步澄清。

在一个实施方案中，所述通过章节1.3中固体/液体分离步骤进一步处理的章节1.3的溶液(如上清)经活性炭过滤步骤进一步澄清。在一个实施方案中，所述溶液通过上面章节1.4中的任何方法和/或上面章节1.5的过滤步骤进一步过滤，其经活性炭过滤步骤进一步澄清。在一个实施方案中，所述通过上面章节1.6中超滤和/或透析过滤步骤进一步澄清的溶液经活性炭过滤步骤进一步澄清。

活性炭过滤步骤允许进一步去除宿主细胞杂质如蛋白和核酸以及有色杂质(参见WO2008/118752)。

在一个实施方案中，所述活性炭(activated carbon)(也称为活性碳(activecharcoal))加入溶液的量足以吸附大部分蛋白和核酸污染物，随后污染物吸附到活性炭上后去除。在一个实施方案中，所述活性炭以粉末形式，以颗粒状炭滤床，以压制炭块或挤压炭块(参见例如Norit活性炭)加入。在一个实施方案中，所述活性炭加入的量是约0.1-20％(重量体积)、1-15％(重量体积)、1-10％(重量体积)、2-10％(重量体积)、3-10％(重量体积)、4-10％(重量体积)、5-10％(重量体积)、1-5％(重量体积)或2-5％(重量体积)。混合物随后搅拌并保持静置。在一个实施方案中，所述混合物静置约5、10、15、20、30、45、60、90、120、180、240分钟或更长。然后，去除活性炭。活性炭能通过例如离心或过滤去除。

在一个优选的实施方案中，所述溶液经固定于基质中的活性炭过滤。基质可以是溶液可渗透的任何多孔过滤介质。基质能包括支撑材料和/或粘合材料。支撑材料可以是合成聚合物或天然来源的聚合物。适当的合成聚合物能包括聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酸甲酯，而天然来源的聚合物能包括纤维素、多糖和葡聚糖、琼脂糖。通常，聚合物支撑材料采用纤维网络形式以提供机械刚性。粘合材料可以是树脂。基质可具有膜片形式。在一个实施方案中，所述固定于基质中的活性炭采用流通式碳筒形式。筒是自包含实体，含有固定于基质中的粉末状活性炭，并以膜片形式制备。膜片可捕获于塑料可渗透支撑物以形成盘。

或者，膜片可以是卷绕式(spirally wound)。为增加滤器表面积，数个盘能彼此堆叠。彼此堆叠的盘特定具有中央核心管以从滤器中收集和移出炭处理的样品。堆叠盘的构型可以是透镜状。

炭过滤器中的活性炭可获自不同原料，如泥炭、褐煤、木材或椰子壳。

本领域已知的任何工艺如蒸汽或化学处理可用于活化炭(如木基磷酸活性炭)。

本发明中，固定于基质中的活性炭可放置于壳体以形成独立滤器单元。各滤器单元有其自身进口和出口用于待纯化的溶液。用于本发明的滤器单元示例是来自坤诺公司(Cuno Inc.，美国梅里登)或颇尔公司(Pall Corporation，美国东山)的碳筒。CUNOzetacarbon过滤器适用于本发明。这些炭过滤器包含纤维素基质，其中适当地保留有活性炭粉末且结合树脂。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-100微米、约0.05-100微米、约0.1-100微米、约0.2-100微米、约0.3-100微米、约0.4-100微米、约0.5-100微米、约0.6-100微米、约0.7-100微米、约0.8-100微米、约0.9-100微米、约1-100微米、约1.25-100微米、约1.5-100微米、约1.75-100微米、约2-100微米、约3-100微米、约4-100微米、约5-100微米、约6-100微米、约7-100微米、约8-100微米、约9-100微米、约10-100微米、约15-100微米、约20-100微米、约25-100微米、约30-100微米、约40-100微米、约50-100微米或约75-100微米。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-50微米、约0.05-50微米、约0.1-50微米、约0.2-50微米、约0.3-50微米、约0.4-50微米、约0.5-50微米、约0.6-50微米、约0.7-50微米、约0.8-50微米、约0.9-50微米、约1-50微米、约1.25-50微米、约1.5-50微米、约1.75-50微米、约2-50微米、约3-50微米、约4-50微米、约5-50微米、约6-50微米、约7-50微米、约8-50微米、约9-50微米、约10-50微米、约15-50微米、约20-50微米、约25-50微米、约30-50微米、约40-50微米或约50-50微米。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-25微米、约0.05-25微米、约0.1-25微米、约0.2-25微米、约0.3-25微米、约0.4-25微米、约0.5-25微米、约0.6-25微米、约0.7-25微米、约0.8-25微米、约0.9-25微米、约1-25微米、约1.25-25微米、约1.5-25微米、约1.75-25微米、约2-25微米、约3-25微米、约4-25微米、约5-25微米、约6-25微米、约7-25微米、约8-25微米、约9-25微米、约10-25微米、约15-25微米或约20-25微米。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-10微米、约0.05-10微米、约0.1-10微米、约0.2-10微米、约0.3-10微米、约0.4-10微米、约0.5-10微米、约0.6-10微米、约0.7-10微米、约0.8-10微米、约0.9-10微米、约1-10微米、约1.25-10微米、约1.5-10微米、约1.75-10微米、约2-10微米、约3-10微米、约4-10微米、约5-10微米、约6-10微米、约7-10微米、约8-10微米或约9-10微米。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-8微米、约0.05-8微米、约0.1-8微米、约0.2-8微米、约0.3-8微米、约0.4-8微米、约0.5-8微米、约0.6-8微米、约0.7-8微米、约0.8-8微米、约0.9-8微米、约1-8微米、约1.25-8微米、约1.5-8微米、约1.75-8微米、约2-8微米、约3-8微米、约4-8微米、约5-8微米、约6-8微米或约7-8微米。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-5微米、约0.05-5微米、约0.1-5微米、约0.2-5微米、约0.3-5微米、约0.4-5微米、约0.5-5微米、约0.6-5微米、约0.7-5微米、约0.8-5微米、约0.9-5微米、约1-5微米、约1.25-5微米、约1.5-5微米、约1.75-5微米、约2-5微米、约3-5微米或约4-5微米。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米、约1.75-2微米、约2-2微米、约3-2微米或约4-2微米。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米。

在一个实施方案中，所述上文公开的活性炭滤器的标称的微米等级是约0.05-50微米、0.1-25微米0.2-10、微米0.1-10微米、0.2-5微米或0.25-1微米。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述活性炭过滤步骤实施的进料速度为1-500LMH、10-500LMH、15-500LMH、20-500LMH、25-500LMH、30-500LMH、40-500LMH、50-500LMH、100-500LMH、125-500LMH、150-500LMH、200-500LMH、250-500LMH、300-500LMH或400-500LMH。

在一个实施方案中，所述活性炭过滤步骤实施的进料速度为1-200LMH、10-200LMH、15-200LMH、20-200LMH、25-200LMH、30-200LMH、40-200LMH、50-200LMH、100-200LMH、125-200LMH或150-200LMH。

在一个实施方案中，所述活性炭过滤步骤实施的进料速度为1-150LMH、10-150LMH、15-150LMH、20-150LMH、25-150LMH、30-150LMH、40-150LMH、50-150LMH、100-150LMH或125-150LMH。

在一个实施方案中，所述活性炭过滤步骤实施的进料速度为1-100LMH、10-100LMH、15-100LMH、20-100LMH、25-100LMH、30-100LMH、40-100LMH或50-100LMH。

在一个实施方案中，所述活性炭过滤步骤实施的进料速度为1-75LMH、5-75LMH、10-75LMH、15-75LMH、20-75LMH、25-75LMH、30-75LMH、35-75LMH、40-75LMH、45-75LMH、50-75LMH、55-75LMH、60-75LMH、65-75LMH或70-75LMH。

在一个实施方案中，所述活性炭过滤步骤实施的进料速度为1-50LMH、5-50LMH、7-50LMH、10-50LMH、15-50LMH、20-50LMH、25-50LMH、30-50LMH、35-50LMH、40-50LMH或45-50LMH。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述活性炭过滤步骤实施的进料速度为约1、约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约225、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约700、约800、约900、约950或约1000LMH。

在一个实施方案中，所述溶液通过活性炭滤器处理，其中所述滤器的过滤容积是5-1000L/m²、10-750L/m²、15-500L/m²、20-400L/m²、25-300L/m²、30-250L/m²、40-200L/m²或30-100L/m²。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过活性炭滤器处理，其中所述滤器的过滤容积是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000L/m²。

如果污染物含量在首次活性炭过滤步骤后高于固定阈值，重复所述步骤。在本发明的一个实施方案中，实施1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个活性炭过滤步骤。在本发明的一个实施方案中，实施1、2或3个活性炭过滤步骤。在本发明的一个实施方案中，实施1或2个活性炭过滤步骤。

在一个实施方案中，所述溶液通过串联的活性炭滤器处理。在一个实施方案中，所述溶液通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个串联的活性炭滤器处理。在一个实施方案中，所述溶液通过2、3、4或5个串联的活性炭滤器处理。在一个实施方案中，所述溶液通过2个串联的活性炭滤器处理。一个实施方案中，所述溶液通过3个串联的活性炭滤器处理。一个实施方案中，所述溶液通过4个串联的活性炭滤器处理。一个实施方案中，所述溶液通过5个串联的活性炭滤器处理。

在一个实施方案中，所述活性炭过滤步骤以单次通过模式进行。

在另一实施方案中，所述活性炭过滤步骤以再循环模式进行。在所述实施方案(再循环模式)中，实施2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个活性炭过滤循环。在另一实施方案中，实施2、3、4、5、6、7、8、9或10个活性炭过滤循环。在一个实施方案中，实施2或3个活性炭过滤循环。在一个实施方案中，实施2个活性炭过滤循环。

1.8任选存在的进一步过滤

一旦溶液通过上面章节1.7的活性炭步骤处理，所得溶液(即滤液)可任选地进一步过滤。

在一个实施方案中，所述溶液经受微滤。在一个实施方案中，所述微滤是死端过滤(垂直过滤)。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.2微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-6000L/m²、200-6000L/m²、300-6000L/m²、400-6000L/m²、500-6000L/m²、750-6000L/m²、1000-6000L/m²、1500-6000L/m²、2000-6000L/m²、3000-6000L/m²或4000-6000L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-4000L/m²、200-4000L/m²、300-4000L/m²、400-4000L/m²、500-4000L/m²、750-4000L/m²、1000-4000L/m²、1500-4000L/m²、2000-4000L/m²、2500-4000L/m²、3000-4000L/m²、3000-4000L/m²或3500-4000L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是100-3750L/m²、200-3750L/m²、300-3750L/m²、400-3750L/m²、500-3750L/m²、750-3750L/m²、1000-3750L/m²、1500-3750L/m²、2000-3750L/m²、2500-3750L/m²、3000-3750L/m²、3000-3750L/m²或3500-3750L/m²。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过微滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是约100、约200、约300、约400、约550、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900,约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3100、约3200、约3300、约3400、约3500、约3600、约3700、约3800、约3900、约4000、约4100、约4200、约4300、约4400、约4500、约4600、约4700、约4800、约4900、约5000、约5250、约5500、约5750或约6000L/m²。

1.9超滤/透析过滤

溶液通过上面章节1.7的活性炭过滤步骤和/或上面章节1.8的进一步过滤步骤处理后，所得溶液(即滤液)任选通过超滤和/或透析过滤进一步澄清。

在本发明的一个实施方案中，所述溶液(如在上面章节1.7或1.8中获得)通过超滤处理。

在一个实施方案中，所述溶液经超滤处理且膜的分子量截留范围是约5kDa-1000kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约10kDa-750kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约10kDa-500kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约10kDa-300kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约10kDa-100kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约10kDa-50kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约10kDa-30kDa。在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约5kDa-1000kDa、约10kDa-1000kDa约20kDa-1000kDa、约30kDa-1000kDa、约40kDa-1000kDa、约50kDa-1000kDa、约75kDa-1000kDa、约100kDa-1000kDa、约150kDa-1000kDa、约200kDa-1000kDa、约300kDa-1000kDa、约400kDa-1000kDa、约500kDa-1000kDa或约750kDa-1000kDa。

在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约5kDa-500kDa、约10kDa-500kDa、约20kDa-500kDa、约30kDa-500kDa、约40kDa-500kDa、约50kDa-500kDa、约75kDa-500kDa、约100kDa-500kDa、约150kDa-500kDa、约200kDa-500kDa、约300kDa-500kDa或约400kDa-500kDa。

在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约5kDa-300kDa、约10kDa-300kDa、约20kDa-300kDa、约30kDa-300kDa、约40kDa-300kDa、约50kDa-300kDa、约75kDa-300kDa、约100kDa-300kDa、约150kDa-300kDa或约200kDa-300kDa。

在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约5kDa-100kDa、约10kDa-100kDa、约20kDa-100kDa、约30kDa-100kDa、约40kDa-100kDa、约50kDa-100kDa或约75kDa-100kDa。

在一个实施方案中，所述膜的分子量截留范围是约5kDa、约10kDa、约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50kDa、约60kDa、约70kDa、约80kDa、约90kDa、约100kDa、约110kDa、约120kDa、约130kDa、约140kDa、约150kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约400kDa、约500kDa、约750kDa或约1000kDa。

在一个实施方案中，所述超滤步骤的浓缩因数是约1.5-约10.0。在一个实施方案中，所述浓缩因数是约2.0-约8.0。在一个实施方案中，所述浓缩因数是约2.0-约5.0。

在一个实施方案中，所述浓缩因数是约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。在一个实施方案中，所述浓缩因数是约2.0、约3.0、约4.0、约5.0或约6.0。

在本发明的一个实施方案中，所述溶液(如在上面章节1.7或1.8中获得)通过透析过滤处理。

在本发明的一个实施方案中，所述如上面本章节公开的超滤(UF)后所得溶液通过透析过滤进一步处理(UF/DF处理)。

透析过滤(DF)用于交换产物到所需缓冲溶液(或仅为水)。在一个实施方案中，所述透析过滤用于在恒定体积下改变所保留溶液的化学性质。不需要的颗粒通过膜，而进料流的构成通过加入替代溶液(缓冲溶液、盐水溶液、缓冲盐水溶液或水)变成更需要的状态。

在一个实施方案中，所述替代溶液是水。

在一个实施方案中，所述替代溶液是溶于水的盐水。在一些实施方案中，所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。在一个特定实施方案中，所述盐是氯化钠。在一个实施方案中，所述替代溶液是氯化钠，其是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500mM。在一个特定实施方案中，所述替代溶液是氯化钠，其是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mM。在一个特定实施方案中，所述替代溶液是氯化钠，其是约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90或约100mM。

在一个实施方案中，所述替代溶液是缓冲溶液。在一个实施方案中，所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自N-(2-乙酰胺基)-氨基乙磺酸(ACES)、乙酸的盐(乙酸盐)、N-(2-乙酰胺基)-亚氨基二乙酸(ADA)、2-氨基乙磺酸(AES、牛磺酸)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇AMPD、ammediol、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、碳酸氢钠(碳酸氢盐)、N,N’-双(2-羟乙基)-甘氨酸(二甘氨酸)、[双(2-羟乙基)-亚氨基]-三(羟甲基甲烷)(BIS-Tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(BIS-Tris-丙烷)、硼酸、二甲胂酸(甲次砷酸盐)、3-(环己胺)-丙磺酸(CAPS)、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、碳酸钠(碳酸盐)、环己胺乙磺酸(CHES)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、甲酸的盐(甲酸盐)、甘氨酸、双甘氨肽、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-乙磺酸(HEPES)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-3-丙磺酸(HEPPS、EPPS)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、咪唑、苹果酸的盐(苹果酸盐)、马来酸的盐(马来酸盐)、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、磷酸的盐(磷酸盐)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、吡啶、琥珀酸的盐(琥珀酸盐)、3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(TAPS)、3-[N-三(羟甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、三乙醇胺(TEA)、2-[三(羟甲基)-甲氨基]-乙磺酸(TES)、N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(Tricine)和三(羟甲基)-甲胺(Tris)。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液选自乙酸的盐(乙酸盐)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、甲酸的盐(甲酸盐)、苹果酸的盐(苹果酸盐)、马来酸的盐(马来酸盐),磷酸的盐(磷酸盐)和琥珀酸的盐(琥珀酸盐)。在一个实施方案中，所述透析缓冲液是柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。在一个实施方案中，所述透析缓冲液是琥珀酸的盐(琥珀酸盐)在一个实施方案中，所述透析缓冲液是磷酸的盐(磷酸盐)。在一个实施方案中，所述盐是钠盐。在一个实施方案中，所述盐是钾盐。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的pH是约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5或约11.0。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的pH是约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的pH是约6.5、约7.0或约7.5。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的pH是约6.0。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的pH是约6.5。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的pH是约7.0。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-50mM、约0.1mM-50mM、约0.5mM-50mM、约1mM-50mM、约2mM-50mM、约3mM-50mM、约4mM-50mM、约5mM-50mM、约6mM-50mM、约7mM-50mM、between约8mM-50mM、约9mM-50mM、约10mM-50mM、约11mM-50mM、约12mM-50mM、约13mM-50mM、约14mM-50mM、约15mM-50mM、约16mM-50mM、约17mM-50mM、约18mM-50mM、约19mM-50mM、约20mM-50mM、约25mM-50mM、约30mM-50mM、约35mM-50mM、约40mM-50mM或约45mM-50mM。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95或约100mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.1mM、约0.2mM、约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约40mM或约50mM。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约30mM。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约25mM。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约20mM。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约15mM。在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液的浓度是约10mM。

在一个实施方案中，所述透析过滤缓冲液包含盐。在一些实施方案中，所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。在一个特定实施方案中，所述盐是氯化钠。在一个特定实施方案中，所述透析过滤缓冲溶液包含氯化钠，其是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mM。

在本发明的一个实施方案中，所述透析体积数是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50。在本发明的一个实施方案中，所述透析体积数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100。在本发明的一个实施方案中，所述透析体积数是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。

在本发明的一个实施方案中，所述超滤和透析过滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。在一个实施方案中，所述超滤和透析过滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在本发明的一个实施方案中，所述透析过滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。在一个实施方案中，所述透析过滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

1.10均一化/调整大小(sizing)

多糖在纯化过程中尺寸能略有减小。

在一个实施方案中，本发明的多糖的纯化溶液(如通过章节1.9的超滤和/或透析过滤获得)没有调整大小(sized)。

在一个实施方案中，所述多糖能通过调整大小技术均一化。可采用机械或化学调整大小。化学水解可用例如乙酸进行。机械调整大小可用高压均质剪切进行。

因此，在一个实施方案中，所述通过章节1.9的超滤和/或透析过滤获得的多糖纯化溶液调整大小到靶分子量。

如本文所用，术语多糖的“分子量”指例如通过尺寸排阻层析(SEC)联合多角度激光光散射探测器(MALLS)计算的分子量。

在一些实施方案中，所述纯化多糖调整大小到约5kDa-约4,000kDa的分子量。在其他这类实施方案中，所述纯化多糖调整大小到约10kDa-约4,000kDa的分子量。在其他这类实施方案中，所述纯化多糖调整大小到约50kDa-约4,000kDa的分子量。在进一步的这类实施方案中，所述纯化多糖调整大小到分子量约50kDa-约3,500kDa；约50kDa-约3,000kDa；约50kDa-约2,500kDa；约50kDa-约2,000kDa；约50kDa-约1,750kDa；约50kDa-约1,500kDa；约50kDa-约1,250kDa；约50kDa-约1,000kDa；约50kDa-约750kDa；约50kDa-约500kDa；约100kDa-约4,000kDa；约100kDa-约3,500kDa；约100kDa-约3,000kDa；约100kDa-约2,500kDa；约100kDa-约2,250kDa；约100kDa-约2,000kDa；约100kDa-约1,750kDa；约100kDa-约1,500kDa；约100kDa-约1,250kDa；约100kDa-约1,000kDa；约100kDa-约750kDa；约100kDa-约500kDa；约200kDa-约4,000kDa；约200kDa-约3,500kDa；约200kDa-约3,000kDa；约200kDa-约2,500kDa；约200kDa-约2,250kDa；约200kDa-约2,000kDa；约200kDa-约1,750kDa；约200kDa-约1,500kDa；约200kDa-约1,250kDa；约200kDa-约1,000kDa；约200kDa-约750kDa；或约200kDa-约500kDa.在进一步的这类实施方案中，所述纯化多糖调整大小到分子量约250kDa-约3,500kDa；约250kDa-约3,000kDa；约250kDa-约2,500kDa；约250kDa-约2,000kDa；约250kDa-约1,750kDa；约250kDa-约1,500kDa；约250kDa-约1,250kDa；约250kDa-约1,000kDa；约250kDa-约750kDa；约250kDa-约500kDa；约300kDa-约4,000kDa；约300kDa-约3,500kDa；约300kDa-约3,000kDa；约300kDa-约2,500kDa；约300kDa-约2,250kDa；约300kDa-约2,000kDa；约300kDa-约1,750kDa；约300kDa-约1,500kDa；约300kDa-约1,250kDa；约300kDa-约1,000kDa；约300kDa-约750kDa；约300kDa-约500kDa；约500kDa-约4,000kDa；约500kDa-约3,500kDa；约500kDa-约3,000kDa；约500kDa-约2,500kDa；约500kDa-约2,250kDa；约500kDa-约2,000kDa；约500kDa-约1,750kDa；约500kDa-约1,500kDa；约500kDa-约1,250kDa；约500kDa-约1,000kDa；约500kDa-约750kDa；或约500kDa-约600kDa。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一些实施方案中，所述纯化多糖调整大小到分子量约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa、约35kDa、约40kDa、约45kDa、约50kDa、约75kDa、约90kDa、约100kDa、约150kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约350kDa、约400kDa、约450kDa、约500kDa、约550kDa、约600kDa、约650kDa、约700kDa、约750kDa、约800kDa、约850kDa、约900kDa、约950kDa、约1000kDa、约1250kDa、约1500kDa、约1750kDa、约2000kDa、约2250kDa、约2500kDa、约2750kDa、约3000kDa、约3250kDa、约3500kDa、约3750kDa或约4,000kDa。在一个优选的实施方案中，所述纯化多糖是荚膜多糖，来自肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F，其中荚膜多糖的分子量落在所述范围之一内或具有大致上述尺寸。

1.11无菌过滤

在一个实施方案中，所述本发明的多糖纯化溶液进行无菌过滤。

因此，在一个实施方案中，所述章节1.9的超滤和/或透析过滤步骤可任选地之后是无菌过滤步骤。

在一个实施方案中，所述章节1.10的均一化/调整大小步骤若实施，则任选之后是无菌过滤步骤。

在一个实施方案中，所述章节1.2-1.8的任何步骤可任选地之后是无菌过滤步骤。

在一个实施方案中，所述无菌过滤是死端过滤(垂直过滤)。在一个实施方案中，所述无菌过滤是切向过滤。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.01-0.2微米、约0.05-0.2微米、约0.1-0.2微米或约0.15-0.2微米。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.05、约0.1、约0.15或约0.2微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的标称的保留范围是约0.2微米。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是约25-1500L/m²、50-1500L/m²、75-1500L/m²、100-1500L/m²、150-1500L/m²、200-1500L/m²、250-1500L/m²、300-1500L/m²、350-1500L/m²、400-1500L/m²、500-1500L/m²、750-1500L/m²、1000-1500L/m²或1250-1500L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是约25-1000L/m²、50-1000L/m²、75-1000L/m²、100-1000L/m²、150-1000L/m²、200-1000L/m²、250-1000L/m²、300-1000L/m²、350-1000L/m²、400-1000L/m²、500-1000L/m²或750-1000L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是25-500L/m²、50-500L/m²、75-500L/m²、100-500L/m²、150-500L/m²、200-500L/m²、250-500L/m²、300-500L/m²、350-500L/m²或400-500L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是25-300L/m²、50-300L/m²、75-300L/m²、100-300L/m²、150-300L/m²、200-300L/m²或250-300L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是25-250L/m²、50-250L/m²、75-250L/m²、100-250L/m²或150-250L/m²、200-250L/m²。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是25-100L/m²、50-100L/m²或75-100L/m²。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一个实施方案中，所述溶液通过无菌过滤步骤处理，其中滤器的过滤容积是约25、约50、约75、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400或约1500L/m²。

1.12最终材料

多糖能最终制备为液体溶液。

多糖能进一步加工(如冻干为干粉，参见WO2006/110381)。因此，在一个实施方案中，所述多糖是干粉。在一个实施方案中，所述多糖是冷冻干燥的饼

2纯化多糖的应用

通过本发明方法纯化的多糖可用作抗原。纯多糖用作疫苗中的抗原(参见23价未缀合的肺炎球菌多糖疫苗Pneumovax)。

通过本发明方法纯化的多糖还可缀合载体蛋白以获得糖缀合物。

2.1糖缀合物

通过本发明方法纯化的多糖可缀合载体蛋白以获得糖缀合物。

出于本发明目的，术语‘糖缀合物’指示共价连接载体蛋白的糖。在一个实施方案中，所述糖直接连接载体蛋白。在第二实施方案中，所述糖经间隔子/接头连接载体蛋白。

一般，糖与载体的共价缀合可提高糖的免疫原性，因为这使其从非T依赖性抗原转变成T依赖性抗原，从而允许引发免疫记忆。缀合特定用于儿科疫苗。

如本文进一步所述，通过本发明方法纯化的多糖可激活(如化学激活)以使其能够反应(如与接头或直接与载体蛋白)且随后纳入糖缀合物。

纯化多糖可在缀合前调整大小成靶分子量，如通过上面章节1.11公开的方法。因此，在一个实施方案中，所述纯化多糖在缀合前调整大小。在一个实施方案中，所述本文公开的纯化多糖可在缀合前调整大小以获得寡糖。寡糖具有少量重复单元(通常5-15个重复单元)，且通常经多糖调整大小(如水解)获得。

优选地，待用于缀合的糖是多糖。由于抗原表面存在的表位，高分子量多糖能够诱导某些抗体免疫应答。高分子量多糖的分离和纯化优选考虑用于本发明的缀合物。

因此，在一个实施方案中，所述多糖进行调整大小且仍为多糖。

在一个实施方案中，所述多糖没有进行调整大小。

在一些实施方案中，所述缀合前(调整大小后或未调整大小)的纯化多糖具有5kDa-4,000kDa的分子量。在其他这类实施方案中，所述纯化多糖具有50kDa-4,000kDa的分子量。在进一步的这类实施方案中，所述纯化多糖的分子量是50kDa-3,500kDa；50kDa-3,000kDa；50kDa-2,500kDa；50kDa-2,000kDa；50kDa-1,750kDa；50kDa-1,500kDa；50kDa-1,250kDa；50kDa-1,000kDa；50kDa-750kDa；50kDa-500kDa；100kDa-4,000kDa；100kDa-3,500kDa；100kDa-3,000kDa；100kDa-2,500kDa；100kDa-2,250kDa；100kDa-2,000kDa；100kDa-1,750kDa；100kDa-1,500kDa；100kDa-1,250kDa；100kDa-1,000kDa；100kDa-750kDa；100kDa-500kDa；200kDa-4,000kDa；200kDa-3,500kDa；200kDa-3,000kDa；200kDa-2,500kDa；200kDa-2,250kDa；200kDa-2,000kDa；200kDa-1,750kDa；200kDa-1,500kDa；200kDa-1,250kDa；200kDa-1,000kDa；200kDa-750kDa；或200kDa-500kDa。在进一步的这类实施方案中，所述纯化多糖的分子量是250kDa-3,500kDa；250kDa-3,000kDa；250kDa-2,500kDa；250kDa-2,000kDa；250kDa-1,750kDa；250kDa-1,500kDa；250kDa-1,250kDa；250kDa-1,000kDa；250kDa-750kDa；250kDa-500kDa；300kDa-4,000kDa；300kDa-3,500kDa；300kDa-3,000kDa；300kDa-2,500kDa；300kDa-2,250kDa；300kDa-2,000kDa；300kDa-1,750kDa；300kDa-1,500kDa；300kDa-1,250kDa；300kDa-1,000kDa；300kDa-750kDa；300kDa-500kDa；500kDa-4,000kDa；500kDa-3,500kDa；500kDa-3,000kDa；500kDa-2,500kDa；500kDa-2,250kDa；500kDa-2,000kDa；500kDa-1,750kDa；500kDa-1,500kDa；500kDa-1,250kDa；500kDa-1,000kDa；500kDa-750kDa；或500kDa-600kDa。

上述范围内的任意数被视作本公开实施方案。

在一些实施方案中，所述纯化多糖的分子量是约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、75kDa、90kDa、100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa、800kDa、850kDa、900kDa、950kDa、1000kDa、1250kDa、1500kDa、1750kDa、2000kDa、2250kDa、2500kDa、2750kDa、3000kDa、3250kDa、3500kDa、3750kDa或4,000kDa。

在一个实施方案中，所述纯化多糖是荚膜糖(多糖或寡糖)。

在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自金黄色葡萄球菌的荚膜多糖。在一个实施方案中，所述纯化多糖是金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖。

在另一个实施方案中，所述纯化多糖是来自粪肠球菌的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖。

在另一个实施方案中，所述纯化多糖是来自脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自A群脑膜炎奈瑟氏菌(MenA)、W135群脑膜炎奈瑟氏菌(MenW135)、Y群脑膜炎奈瑟氏菌(MenY)、X群脑膜炎奈瑟氏菌(MenX)或C群脑膜炎奈瑟氏菌(MenC)的荚膜多糖。

在另一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌的荚膜多糖。在一个实施方案中，所述纯化多糖是荚膜多糖，来自致泻性大肠杆菌群(EEC群)如大肠杆菌-肠毒素性(ETEC),大肠杆菌-肠致病性(EPEC),大肠杆菌-O157:H肠出血性(EHEC)和大肠杆菌-肠侵袭性(EIEC)。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)的荚膜多糖。

在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌的荚膜多糖，所述大肠杆菌的血清型选自O157:H7、O26:H11、O111:H-和O103:H2血清型。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌的荚膜多糖，所述大肠杆菌的血清型选自O6:K2:H1和O18:K1:H7血清型。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌的荚膜多糖，所述大肠杆菌的血清型选自O45:K1、O17:K52:H18、O19:H34和O7:K1血清型。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌血清型O104:H4的荚膜多糖。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌血清型O1:K12:H7的荚膜多糖。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌血清型O127:H6的荚膜多糖。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌血清型O139:H28的荚膜多糖。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自大肠杆菌血清型O128:H2的荚膜多糖。

在另一个实施方案中，所述纯化多糖是来自无乳链球菌(B族链球菌(GBS))的荚膜多糖。在一些实施方案中，所述纯化多糖是荚膜多糖，选自Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII型GBS的荚膜多糖。在一些实施方案中，所述纯化多糖是荚膜多糖，选自Ia、Ib、II、III和V型GBS的荚膜多糖。

在一个优选的实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌的荚膜多糖。在一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型1的荚膜多糖。在另一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型2的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型3的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型4的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型5的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型6A的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型6B的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型6C的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型7F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型8的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型9V的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型9N的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型10A的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型11A的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型12F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型14的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型15A的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型15B的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型15C的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型16F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型17F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型18C的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型19A的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型19F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型20的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型20A的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型20B的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型22F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型23A的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型23B的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型23F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型24B的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型24F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型29的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型31的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型33F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型34的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型35B的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型35F的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型38的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型72的荚膜多糖。在另外一个实施方案中，所述纯化多糖是来自肺炎链球菌血清型73的荚膜多糖。

能使用任何合适的缀合反应，必要时采用任意适当接头。参见例如WO2007116028第17-22页。

本文所述纯化寡糖或多糖进行化学激活以形成能够与载体蛋白反应的糖。

在一个实施方案中，所述糖缀合物用还原胺化制备。

还原胺化涉及2个步骤，(1)纯化糖的氧化(激活)，(2)活化糖和载体蛋白(如CRM₁₉₇、DT、TT或PD)的还原以形成糖缀合物(参见例如WO2015110941,WO2015110940)。

如上所示，在氧化前，多糖能调整大小到靶分子量(MW)范围。可采用机械或化学水解。化学水解可用乙酸进行。在一个实施方案中，所述纯化多糖的尺寸通过机械均一化减小。

在一个实施方案中，所述纯化多糖或寡糖通过包括以下步骤的工艺缀合载体蛋白：

(a)使所述纯化多糖或寡糖与氧化剂反应；

(b)任选地，通过加入淬灭剂来淬灭氧化反应

(c)步骤(a)或(b)的活化多糖或寡糖与载体蛋白化合；和

(d)使化合的活化多糖或寡糖和载体蛋白与还原剂反应以形成糖缀合物。

在氧化步骤(a)后，糖被视作活化且称为“活化多糖或寡糖”。

氧化步骤(a)可涉及与过高碘酸盐的反应。出于本发明目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语还包括偏高碘酸盐(IO₄ ^-)和原高碘酸盐(IO₆ ^5-)以及高碘酸的多种盐(如高碘酸钠和高碘酸钾)。

在一个优选的实施方案中，所述氧化剂是高碘酸钠。在一个实施方案中，所述用于氧化的高碘酸盐是偏高碘酸盐。在一个实施方案中，所述用于氧化的高碘酸盐是偏高碘酸钠。

氧化步骤(a)可涉及与稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物反应，如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物，存在氧化剂以选择性氧化所述多糖或寡糖的伯羟基，从而产生含有醛基的活化糖(参见WO2014097099)。一方面，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物是WO2014097099第3页第14行到第4页第7行公开的任意一种，氧化剂是WO2014097099第4页第8-15行公开的任意一种。一方面，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物是2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)且氧化剂是N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)。

在一个实施方案中，所述淬灭剂如WO2015110941所公开(参见第30页第3-26行)。

在一个实施方案中，所述还原反应(d)在水性溶剂中完成。在一个实施方案中，所述还原反应(d)在非质子溶剂中完成。在一个实施方案中，所述还原反应(d)在DMSO(二甲亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中完成。

在一个实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠，三乙酰氧基硼氢化钠，存在布朗斯台德酸或路易斯酸的硼氢化钠或锌，胺硼烷如吡啶硼烷，2-甲基吡啶硼烷，2,6-二硼烷-甲醇,二甲胺-硼烷，t-BuMeⁱPrN-BH₃，苄胺-BH₃或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一个优选的实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。

还原反应结束时，缀合物中可能有剩余的未反应醛基，这些可用合适加帽剂加帽。在一个实施方案中，所述加帽剂是硼氢化钠(NaBH₄)。

缀合载体蛋白后，糖缀合物能通过技术人员已知的多种技术纯化(关于糖-蛋白缀合物富集)。这些技术包括透析、浓缩/透析过滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或疏水作用层析)和深层过滤。

在一个实施方案中，所述糖缀合物用氰基化化学制备。

在一个实施方案中，所述纯化多糖或寡糖用溴化氰活化。激活对应于多糖或寡糖的羟基氰基化。活化多糖或寡糖随后直接或经间隔子(接头)基团偶联载体蛋白上的胺基。

在一个实施方案中，所述纯化多糖或寡糖用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)活化以形成氰酸酯。活化多糖或寡糖随后直接或经间隔子(接头)基团偶联载体蛋白上的氨基。

在一个实施方案中，所述间隔子可以是胱胺或半胱胺以产生硫醇化多糖或寡糖，其能经硫醚键偶联载体，所述硫醚键在与马来酰亚胺活化载体蛋白(例如用N-[γ-马来酰亚胺丁酰]琥珀酰亚胺酯(GMBS))或卤代乙酰化载体蛋白(例如用碘乙酰胺,溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA；SIB),N-琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SlAB),磺基琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB),碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)或琥珀酰亚胺3-[溴乙酰胺基]丙酸酯(SBAP))反应后获得。优选地，氰酸酯(任选地通过CDAP化学制备)偶联己二胺或己二酸二酰肼(ADH)，氨基衍生糖用碳二亚胺(如EDAC或EDC))化学经蛋白载体上的羧基来缀合载体蛋白(如CRM₁₉₇)。这类缀合物描述于例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094。

在一个实施方案中，所述糖缀合物用双亲电试剂如羰二咪唑(CDI)或羰基二(三唑)(CDT)制备。在这类实施方案中，所述缀合反应优选在非质子溶剂如DMF或DMSO中经直接途径或用属间接头完成(参见例如WO2011041003)。

在一个实施方案中，所述糖缀合物通过WO2014027302所公开制备糖缀合物的方法制备。所得糖缀合物包含通过二价、异双功能间隔子(2-((2-氧乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)共价缀合载体的糖。或者，糖缀合物通过WO2015121783所公开制备糖缀合物的方法制备。

其他合适的缀合技术使用碳二亚胺(如EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐,EDC加磺基NHS,CMC(1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳二亚胺,DCC(N,N’-二环己基碳二亚胺)或DIC(二异丙基碳二亚胺))。

在一个实施方案中，所述多糖或寡糖经接头缀合载体蛋白，例如双功能接头。接头任选地是异双功能或同双功能，具有例如反应性氨基和反应性羧酸基团、2个反应性氨基或2个反应性羧酸基团。接头具有例如4-20,4-12,5-10个碳原子。一个可能的接头是己二酸二酰肼(ADH)。其他接头包括B-丙酰胺基(WO 00/10599)、硝基苯基-乙胺、卤代烷基卤化物)、配糖键(US4673574,US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。

载体蛋白

糖缀合物的一种组分是缀合纯化多糖或寡糖的载体蛋白。术语“蛋白载体”或“载体蛋白”可在本文中交换使用。载体蛋白应适合标准缀合过程。

在一个优选的实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白选自DT(白喉毒素),TT(破伤风类毒素)或TT的片段C,CRM₁₉₇(白喉毒素的无毒但抗原相同的变体),其他DT突变体(如CRM₁₇₆,CRM₂₂₈,CRM₄₅(Uchida等(1973)J.Biol.Chem.218:3838-3844),CRM₉,CRM₁₀₂,CRM₁₀₃或CRM₁₀₇；和其他突变，由Nicholls和Youle描述于《基因工程毒素》(Genetically EngineeredToxins),编:Frankel,Maecel Dekker公司(Maecel Dekker Inc.)(1992)；缺失或Glu-148到Asp,Gln或Ser和/或Ala 158到GIy的突变以及美国专利号4,709,017和4,950,740公开的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516,Lys 526,Phe 530和/或Lys 534突变以及美国专利号5,917,017和6,455,673公开的其他突变；或美国专利号5,843,711公开的片段,肺炎球菌溶血素(ply)(Kuo等(1995)Infect lmmun 63:2706-2713)，包括以一些形式的脱毒的ply例如dPLY-GMBS(WO 2004/081515,WO 2006/032499)或dPLY-formol,PhtX,包括PhtA,PhtB,PhtD,PhtE(PhtA,PhtB,PhtD或PhtE的序列公开于WO 00/37105和WO 00/39299)以及Pht蛋白的融合蛋白,例如PhtDE融合蛋白,PhtBE融合蛋白,Pht A-E(WO 01/98334,WO 03/054007,WO 2009/000826),OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白),其通常提取自B群脑膜炎奈瑟氏菌(EP0372501),PorB(来自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)),PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如EP0594610 B),或其免疫功能等价物,合成肽(EP0378881,EP0427347),热激蛋白(WO93/17712,WO 94/03208),百日咳蛋白(WO 98/58668,EP0471177),细胞因子,淋巴因子,生长因子或激素(WO 91/01146),包含来自多种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等(2001)Eur J Immunol 31:3816-3824)如N19蛋白(Baraldoi等(2004)Infect lmmun 72:4884-4887)肺炎链球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998),铁摄入蛋白(WO01/72337),艰难梭菌(Clostridium difficile)的毒素A或B(WO 00/61761),转铁结合蛋白,肺炎链球菌粘附蛋白(PsaA),重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(特别是其无毒突变体(如在谷氨酸553携带取代的外毒素A(Douglas等(1987)J.Bacteriol.169(11):4967-4971))。其他蛋白如卵清蛋白、钥孔虫戚血兰素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)也能用作载体蛋白。其他合适的载体蛋白包括失活细菌毒素如霍乱类毒素(如描述于WO 2004/083251)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的外毒素A。

在一个优选的实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白独立选自TT、DT、DT突变体(如CRM₁₉₇)、流感嗜血杆菌蛋白D、PhtX、PhtD、PhtDE融合(尤其是WO 01/98334和WO 03/054007所述那些)、脱毒肺炎球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B以及PsaA。

在一个实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白是DT(白喉类毒素)。在另一实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白是TT(破伤风类毒素)。

在另一实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白是PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如EP0594610)。

在一个优选的实施方案中，所述纯化多糖或寡糖缀合CRM₁₉₇蛋白。CRM₁₉₇蛋白是白喉毒素的无毒形式，但与白喉毒素在免疫学上无法区分。CRM₁₉₇通过非产毒性噬菌体β197^tox-感染的白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生，所述噬菌体由产毒性棒状杆菌噬菌体β的亚硝基胍突变产生(Uchida等(1971)Nature New Biology 233:8-11)。CRM₁₉₇蛋白的分子量与白喉毒素相同，但在结构基因上有单碱基变化(鸟嘌呤变成腺嘌呤)。单碱基变化导致成熟蛋白中的氨基酸置换(谷氨酸取代甘氨酸)并消除白喉毒素的毒性。CRM₁₉₇蛋白是糖的安全和有效的T细胞依赖性载体。关于CRM₁₉₇和其产生的更多细节可参见例如美国专利号5,614,382。

在一个实施方案中，所述纯化多糖或寡糖缀合CRM₁₉₇蛋白或CRM₁₉₇的A链(参见CN103495161)。在一个实施方案中，所述纯化多糖或寡糖缀合CRM₁₉₇的A链，其通过基因重组大肠杆菌的表达获得(参见CN103495161)。

优选地，载体蛋白与糖缀合物中多糖或寡糖的比例是1:5-5:1；如1:0.5-4:1、1:1-3.5:1、1.2:1-3:1、1.5:1-2.5:1；例如1:2-2.5:1或1:1-2:1(w/w)。在一个实施方案中，所述载体蛋白与糖缀合物中多糖或寡糖的比例是约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1。

组合物可包含少量游离载体。当给定载体蛋白以游离和缀合形式存在于本发明组合物时，未缀合形式优选整体上不超过5％的组合物中载体蛋白总量，更优选以小于2％重量存在。

2.2免疫原性组合物

在一个实施方案中，本发明涉及含有本文所公开任何纯化多糖和/或糖缀合物的免疫原性组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及含有本文所公开任何糖缀合物的免疫原性组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及含有章节2.1所公开的1-25种不同糖缀合物的免疫原性组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，包含来自肺炎链球菌不同血清型的1-25种糖缀合物(1-25种肺炎球菌缀合物)。在一个实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，包含来自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含来自16或20种不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20价肺炎球菌缀合组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物是14、15、16、17、18或19价肺炎球菌缀合组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物是16价肺炎球菌缀合组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物是19价肺炎球菌缀合组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物是20价肺炎球菌缀合组合物。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型22F和33F的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F和15B的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型2的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型9N的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型17F的糖缀合物。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型20的糖缀合物。

在一个实施方案中，所述本发明免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的糖缀合物。

在一个优选的实施方案中，所述糖各自单独缀合蛋白载体的不同分子(各蛋白载体分子仅有一类糖与之缀合)。在所述实施方案中，所述荚膜糖被称为单独缀合载体蛋白。优选地，上述免疫原性组合物的所有糖缀合物单独缀合载体蛋白。

在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述任意免疫原性组合物的一个实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物的糖缀合物都单独缀合CRM₁₉₇。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物单独缀合PD。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物单独缀合TT。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物与DT缀合。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物单独缀合PD，来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物与TT缀合且来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物与DT缀合。

在一个实施方案中，上述任意免疫原性组合物包含8-20种不同肺炎链球菌血清型。

在一个实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，包含来自不同脑膜炎奈瑟氏菌血清型的1-5种糖缀合物(1-5种脑膜炎球菌缀合物)。在一个实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，包含来自1、2、3、4或5种不同脑膜炎奈瑟氏菌血清型的糖缀合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含4或5种不同脑膜炎奈瑟氏菌。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含1、2、3、4或5价脑膜炎奈瑟氏菌缀合组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物是2价脑膜炎奈瑟氏菌缀合组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物是4价脑膜炎奈瑟氏菌缀合组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物是5价脑膜炎奈瑟氏菌缀合组合物。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含缀合的Y群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenY)和/或缀合的C群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenC)。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含缀合的A群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenA)、缀合的W135群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenW135)、缀合的Y群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenY)和/或缀合的C群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenC)。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含缀合的W135群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenW135)、缀合的Y群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenY)和/或缀合的C群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenC)。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含缀合的A群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenA)、缀合的W135群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenW135)、缀合的Y群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenY)、缀合的C群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenC)和/或缀合的X群脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖(MenX)。

在一些实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物还可包括至少1、2或3种佐剂。在一些实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物还可包括1种佐剂。术语“佐剂”指增强对抗原免疫应答的化合物或混合物。抗原主要用作递送系统，主要作为免疫调节剂或具有两者的强特征。合适的佐剂包括适用于哺乳动物，包括人的那些。

能用于人的已知合适递送-系统型佐剂示例包括但不限于明矾(如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳液如MF59(4.3％w/v鲨烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween 80)、0.5％w/v山油酸山梨醇酯(Span 85))、油包水乳液如Montanide和聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)(PLG)微粒或纳米粒子。

在一个实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物包含铝盐(明矾)作为佐剂(如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在一个优选的实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物包含磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。

增强本文所公开免疫原性组合物效力的进一步示范性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳液制剂(有或没有其他特异性免疫刺激剂如胞壁肽(见下)或细菌细胞壁组分)，例如(a)SAF，含有10％鲨烯、0.4％Tween 80、5％pluronic嵌段共聚物L121和thr-MDP，其微流体化成亚微乳液或涡旋产生大粒径乳液以及(b)RIBI^TM佐剂系统(RAS),(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem),蒙大拿州哈密尔顿)，含有2％鲨烯、0.2％Tween 80和一种或多种细菌细胞壁组分如单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)皂苷佐剂如QS21、STIMULON^TM(Cambridge Bioscience,马萨诸塞州伍斯特)、

(Isconova,瑞典)或

(联邦血清实验所(Commonwealth SerumLaboratories),澳大利亚)可使用或是从其产生的颗粒如ISCOM(免疫刺激复合物)，ISCOMS可能没有额外洗涤剂(例如WO 00/07621)；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(如WO 99/44636))、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂A(MPL)或3-O-脱酰MPL(3dMPL)(参见例如GB-2220221,EP0689454)，与肺炎球菌糖一起使用时任选地基本没有明矾(参见例如WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(参见例如EP0835318,EP0735898,EP0761231)；(7)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(参见例如WO99/52549)；(8)聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂联合辛基酚聚醚(例如WO01/21207)或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂联合至少一种额外非离子表面活性剂如辛基酚聚醚(例如WO 01/21152)；(9)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)(例如WO00/62800)；(10)免疫刺激剂和金属盐粒子(参见例如WO 00/23105)；(11)皂苷和水包油乳液(例如WO 99/11241)；(12)皂苷(如QS21)+3dMPL+IM2(任选地+甾醇)(例如WO98/57659)；(13)用作免疫刺激剂以增强组合物功效的其他物质(substance)。胞壁肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP),N-25乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP),N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)等。

在本发明的一个实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物包含CpG寡核苷酸作为佐剂。

免疫原性组合物可以液体形式(即溶液或悬液)或冻干形式配制。液体制剂可有利地直接从其包装形式施用并因而对注射理想，不需要如本发明冻干组合物那样在水性介质中复水。

本发明免疫原性组合物的配制能用本领域认可的方法完成。例如，单独多糖和/或缀合物能用生理上可接受载剂配制以制备组合物。这类载剂示例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)和葡萄糖溶液。

本公开提供免疫原性组合物，包含本文所公开多糖或糖缀合物与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的任何组合。

在一个实施方案中，所述本公开的免疫原性组合物采用液体形式，优选水性液体形式。

本公开的免疫原性组合物可包含一种或多种缓冲液、盐、二价阳离子、非离子型洗涤剂、冷冻保护剂如糖和抗氧化剂如自由基清除剂或螯合剂，或其任意多种组合。

在一个实施方案中，所述本公开的免疫原性组合物包含缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲液的pKa为约3.5-约7.5。在一些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。在某些实施方案中，所述缓冲液是终浓度1mM-10mM的琥珀酸盐。在一个特定实施方案中，所述琥珀酸盐缓冲液的终浓度是约5mM。

在一个实施方案中，所述本公开的免疫原性组合物包含盐。在一些实施方案中，所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。在一个特定实施方案中，所述盐是氯化钠。在一个特定实施方案中，所述本发明的免疫原性组合物包含150mM的氯化钠。

在一个实施方案中，所述本公开的免疫原性组合物包含表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯20(TWEEN^TM20)、聚山梨醇酯40(TWEEN^TM40)、聚山梨醇酯60(TWEEN^TM60)、聚山梨醇酯65(TWEEN^TM65)、聚山梨醇酯80(TWEEN^TM80)、聚山梨醇酯85(TWEEN^TM85)、TRITON^TMN-101、TRITON^TMX-100、辛基酚聚醚40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽烟酸盐、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15、Solutol H 15)、聚氧乙烯-35-蓖麻酸酯(

EL)、大豆卵磷脂和泊咯沙姆。在一个特定实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是至少0.0001％-10％重量的聚山梨醇酯80(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是至少0.001％-1％重量的聚山梨醇酯80(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是至少0.01％-1％重量的聚山梨醇酯80(w/w)。在其他实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯80的终浓度是1％聚山梨醇酯80(w/w)。

在一个特定实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯20。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯20的终浓度是至少0.0001％-10％重量的聚山梨醇酯20(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯20的终浓度是至少0.001％-1％重量的聚山梨醇酯20(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯20的终浓度是至少0.01％-1％重量的聚山梨醇酯20(w/w)。在其他实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯20的终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯20(w/w)。在另一实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯20的终浓度是1％聚山梨醇酯20(w/w)。

在一个特定实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯40。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯40的终浓度是至少0.0001％-10％重量的聚山梨醇酯40(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯40的终浓度是至少0.001％-1％重量的聚山梨醇酯40(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯40的终浓度是至少0.01％-1％重量的聚山梨醇酯40(w/w)。在其他实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯40的终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯40(w/w)。在另一实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯40的终浓度是1％聚山梨醇酯40(w/w)。

在一个特定实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯60。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯60的终浓度是至少0.0001％-10％重量的聚山梨醇酯60(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯60的终浓度是至少0.001％-1％重量的聚山梨醇酯60(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯60的终浓度是至少0.01％-1％重量的聚山梨醇酯60(w/w)。在其他实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯60的终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯60(w/w)。在另一实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯60的终浓度是1％聚山梨醇酯60(w/w)。

在一个特定实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯65。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯65的终浓度是至少0.0001％-10％重量的聚山梨醇酯65(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯65的终浓度是至少0.001％-1％重量的聚山梨醇酯65(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯65的终浓度是至少0.01％-1％重量的聚山梨醇酯65(w/w)。在其他实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯65的终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯65(w/w)。在另一实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯65的终浓度是1％聚山梨醇酯65(w/w)。

在一个特定实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯85。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯85的终浓度是至少0.0001％-10％重量的聚山梨醇酯85(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯85的终浓度是至少0.001％-1％重量的聚山梨醇酯85(w/w)。在一些所述实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯85的终浓度是至少0.01％-1％重量的聚山梨醇酯85(w/w)。在其他实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯65的终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯85(w/w)。在另一实施方案中，所述制剂中聚山梨醇酯85的终浓度是1％聚山梨醇酯85(w/w)。

在某些实施方案中，所述本公开的免疫原性组合物的pH是5.5-7.5，更优选pH5.6-7.0，更优选pH 5.8-6.0。

在一个实施方案中，本公开提供填充有本文所公开免疫原性组合物的容器。在一个实施方案中，所述容器选自小瓶、注射器、烧瓶、发酵罐、生物反应器、包、广口瓶、安瓿、筒和一次性笔。在某些实施方案中，所述容器是硅化的。

在一个实施方案中，所述本公开的容器由玻璃、金属(如钢铁、不锈钢、铝等)和/或聚合物(如热塑性塑料、弹性体、热塑性弹性体)构成。在一个实施方案中，所述本公开的容器由玻璃构成。

在一个实施方案中，本公开提供填充有本文所公开免疫原性组合物的注射器。在某些实施方案中，所述注射器是硅化的和/或由玻璃构成。

用于注射的典型剂量的本发明免疫原性组合物体积为0.1mL-2mL，更优选0.2mL-1mL，甚至更优选约0.5mL体积。

2.3用作抗原

通过本发明方法纯化的多糖或本文公开的缀合物可用作抗原。例如，其可以是疫苗的部分。

因此，在一个实施方案中，所述通过本发明方法纯化的多糖或用所述多糖获得的糖缀合物用于在对象中产生免疫应答。一方面，所述对象是哺乳动物，如人、猫、绵羊、猪、马、牛或狗。一方面，所述对象是人。

在一个实施方案中，所述通过本发明方法纯化的多糖、用所述多糖获得的糖缀合物或本文公开的免疫原性组合物用于疫苗。

在一个实施方案中，所述通过本发明方法纯化的多糖、用所述多糖获得的糖缀合物或本文公开的免疫原性组合物用作药物。

本文所述免疫原性组合物可用于多种治疗或预防方法以防止、治疗或缓解对象的细菌感染、疾病或病症。特别地，本文所述免疫原性组合物可用于在对象中防止、治疗或缓解肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌或无乳链球菌的感染、疾病或病症。

因此，一方面，本公开提供在对象中防止、治疗或缓解与肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌或无乳链球菌相关感染、疾病或病症的方法，包括给予对象免疫有效量的本公开免疫原性组合物(尤其是包含对应多糖或其糖缀合物的免疫原性组合物)。

在一个实施方案中，本公开提供在对象中诱导对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌或无乳链球菌免疫应答的方法，包括给予对象免疫有效量的本公开免疫原性组合物(尤其是包含对应多糖或其糖缀合物的免疫原性组合物)。

在一个实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物用作疫苗。在这类实施方案中，本文所述免疫原性组合物可用于在对象中防止肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌或无乳链球菌感染。因此，一方面，本发明提供在对象中防止肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌或无乳链球菌感染的方法，包括给予对象免疫有效量的本公开免疫原性组合物。

一方面，所述对象是哺乳动物，如人、猫、绵羊、猪、马、牛或狗。一方面，所述对象是人。

本文公开的免疫原性组合物能用于保护或治疗易受肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌或无乳链球菌感染影响的人，这是通过经全身或粘膜途径施用免疫原性组合物。在一个实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径施用。在一个实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下注射施用。在一个实施方案中，所述本文公开的免疫原性组合物通过肌肉内或皮下注射施用。

一些情况中，仅需要一剂本公开所述免疫原性组合物，但在某些情况如免疫缺陷更高的情况下，可给予第二、第三或第四剂。初始疫苗接种后，对象能接受一次或多次适当间隔的加强免疫。

在一个实施方案中，本公开所述免疫原性组合物的疫苗接种方案是单剂的。

在一个实施方案中，本公开所述免疫原性组合物的疫苗接种方案是多剂方案。

3本发明的具体实施方案如下列编号段落所示：

1.一种从溶液纯化细菌多糖的方法，所述溶液包含所述多糖以及污染物，其中所述方法包括絮凝步骤。

2.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂包含多价阳离子。

3.如段落2所述的方法，其中所述多价阳离子选自铝、铁、钙和镁。

4.如段落2所述的方法，其中所述絮凝剂是至少2个选自以下的多价阳离子的混合物：铝、铁、钙和镁。

5.如段落2所述的方法，其中所述絮凝剂是至少3个选自以下的多价阳离子的混合物：铝、铁、钙和镁。

6.如段落2所述的方法，其中所述絮凝剂是至少4个选自以下的多价阳离子的混合物：铝、铁、钙和镁。

7.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂包含选自以下的物质：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、聚乙烯亚胺(PEI)、铝酸钠和硅酸钠。

8.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂选自明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、铝酸钠和硅酸钠。

9.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是聚乙烯亚胺(PEI)。

10.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂包含明矾。

11.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是明矾。

12.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂包含钾明矾。

13.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是钾明矾。

14.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂包含钠明矾。

15.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是钠明矾。

16.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂包含铵明矾。

17.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是铵明矾。

18.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是选自以下的2种物质的混合物：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、聚乙烯亚胺(PEI)、铝酸钠和硅酸钠。在一个实施方案中，所述选自以下：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、铝酸钠和硅酸钠。

19.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是3种选自以下的物质的混合物：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、聚乙烯亚胺(PEI)、铝酸钠和硅酸钠。

20.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是4种选自以下的物质的混合物：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、铝酸钠和硅酸钠。

21.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂包含选自以下的物质：壳聚糖、鱼胶、辣木种子(辣木)、明胶、马钱子种子(Nirmali坚果树)、瓜尔豆胶和藻酸盐(如棕色海藻提取物)。在一个实施方案中，所述絮凝剂选自壳聚糖、鱼胶、辣木种子(油辣木)、明胶、马钱子种子(Nirmali坚果树)、瓜尔豆胶和藻酸盐(如棕色海藻提取物)。

22.如段落1所述的方法，其中所述絮凝剂是选自以下的物质：壳聚糖、鱼胶、辣木种子(油辣木)、明胶、马钱子种子(Nirmali坚果树)、瓜尔豆胶和藻酸盐(如棕色海藻提取物)。在一个实施方案中，所述絮凝剂选自壳聚糖、鱼胶、辣木种子(油辣木)、明胶、马钱子种子(Nirmali坚果树)、瓜尔豆胶和藻酸盐(如棕色海藻提取物)。

23.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂浓度是约0.1-约20％(w/v)。

24.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂浓度是约0.5-约10％(w/v)。

25.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂浓度是约1-约5％(w/v)。

26.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂浓度是约0.1、约0.25、约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10％(w/v)。

27.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂浓度是约10.5、约11.0、约11.5、约12.0、约12.5、约13.0、约13.5、约14.0、约14.5、约15.0、约15.5、约16.0、约16.5、约17.0、约17.5、约18.0、约18.5、约19.0、约19.5或约20.0％(w/v)。

28.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂浓度是约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5或约5.0％(w/v)。

29.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂浓度是约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5或约4.0％(w/v)。

30.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在数秒(如1-10秒)-约1个月的时间段中加入。

31.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在约2秒-约2周的时间段中加入。

32.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在约1分钟-约1周的时间段中加入。

33.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时到约2天的时间段中加入。

34.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时到约1天的时间段中加入。

35.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时到约1天的时间段中加入。

36.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在约15分钟-约3小时的时间段中加入。

37.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在约30分钟-约120分钟的时间段中加入。

38.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在约2秒、约10秒、约30秒、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约170分钟、约3.0小时、约3.5小时、约4.0小时、约4.5小时、约5.0小时、约5.5小时、约6.0小时、约6.5小时、约7.0小时、约7.5小时、约8.0小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天的时间段中加入。

39.如段落1-38中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在没有搅拌的情况下加入。

40.如段落1-38中任一项所述的方法，其中所述凝剂在搅拌下加入。

41.如段落1-38中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在温和搅拌下加入。

42.如段落1-38中任一项所述的方法，其中所述絮凝剂在剧烈搅拌下加入。

43.如段落1-42中任一项所述的方法，其中所述溶液维持一些时间以允许许絮状物在下游加工前沉淀。

44.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是数秒(如2-10秒)-约1分钟。

45.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约115、至少约120、至少约125、至少约130、至少约135、至少约140、至少约145、至少约150、至少约155或至少约160分钟。

46.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述沉淀时间小于1周。

47.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420,约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380、约1440分钟、约2天、约3天、约4天、约5天或约6天到1周。

48.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是数秒(如1-10秒)-约1个月。

49.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约2秒-约2周。

50.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约1分钟-约1周。

51.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟,约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时,约23小时或约24小时到约2天。

52.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约5分钟、约10分钟、约15分钟,约20分钟,约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟,约9分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时到约1天。

53.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约15分钟,约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时到约1天。

54.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约15分钟-约3小时。

55.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约30分钟-约120分钟。

56.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约10秒、约30秒、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天。

57.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约60、约90、约120、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380或约1440分钟到2天。

58.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约5分钟-约1天。

59.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间是约5分钟-约120分钟。

60.如段落1-43中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤的沉淀时间可以是约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟或约160分钟。

61.如段落43-60中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤在没有搅拌的情况下进行。

62.如段落43-60中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤在搅拌下进行。

63.如段落43-60中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤在温和搅拌下加入。

64.如段落43-60中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤在剧烈搅拌下加入。

65.如段落1-64中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤在酸性pH进行。

66.如段落1-64中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤在低于7.0、6.0、5.0或4.0的pH进行。

67.如段落1-64中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤在7.0-1.0的pH进行。

68.如段落1-64中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤在5.5-2.5、5.0-2.5、4.5-2.5、4.0-2.5、5.5-3.0、5.0-3.0、4.5-3.0、4.0-3.0、5.5-3.5、5.0-3.5、4.5-3.5或4.0-3.5的pH进行。

69.如段落1-64中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤在约5.5、约5.0、约4.5、约4.0、约3.5、约3.0、约2.5、约2.0、约1.5或约1.0的pH进行。

70.如段落1-64中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤在约4.0、约3.5、约3.0或约2.5的pH进行。

71.如段落1-64中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤在约3.5的pH进行。

72.如段落65-71中任一项所述的方法，其中所述酸性pH通过用酸来酸化溶液获得。

73.如段落65-71中任一项所述的方法，其中所述酸性pH通过酸化溶液获得，所用酸选自HCl、H₃PO₄、柠檬酸、乙酸、亚硝酸和硫酸。

74.如段落65-71中任一项所述的方法，其中所述酸性pH通过用氨基酸来酸化溶液获得。

75.如段落65-71中任一项所述的方法，其中所述酸性pH通过用选自甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸的氨基酸酸化溶液获得。

76.如段落65-71中任一项所述的方法，其中所述酸性pH通过用硫酸来酸化溶液获得。

77.如段落65-71中任一项所述的方法，其中所述酸在搅拌下加入。

78.如段落65-71中任一项所述的方法，其中所述酸在温和搅拌下加入。

79.如段落65-71中任一项所述的方法，其中所述酸在剧烈搅拌下加入。

80.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂在约4℃-约30℃的温度进行。

81.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度进行。

82.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂在约20℃的温度进行。

83.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂在约30℃-约95℃的温度进行。

84.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂在约35℃-约80℃、约40℃-约70℃、约45℃-约65℃、约50℃-约60℃、约50℃-约55℃、约45℃-约55℃或约45℃-约55℃的温度进行。

85.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。

86.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂在约50℃的温度进行。

87.如段落43-86中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤若存在，则在约4℃-约30℃的温度进行。

88.如段落43-86中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤若存在，则在约4℃、约5℃、约6℃,约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃,约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃,约22℃,约23℃,约24℃,约25℃,约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度进行。

89.如段落43-86中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤若存在，则在约20℃的温度进行。

90.如段落43-86中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤若存在，则在约30℃-约95℃的温度进行。

91.如段落43-86中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤若存在，则在约35℃-约80℃、约40℃-约70℃、约45℃-约65℃、约50℃-约60℃、约50℃-约55℃、约45℃-约55℃或约45℃-约55℃的温度进行。

92.如段落43-86中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤若存在，则在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。

93.如段落43-86中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤若存在，则在约50℃的温度进行。

94.如段落72-93中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤若存在，则在约4℃-约30℃的温度进行。

95.如段落72-93中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤若存在，则在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度进行。

96.如段落72-93中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤若存在，则在约20℃的温度进行。

97.如段落72-93中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤若存在，则在约30℃-约95℃的温度进行。

98.如段落72-93中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤若存在，则在约35℃-约80℃、约40℃-约70℃、约45℃-约65℃、约50℃-约60℃、约50℃-约55℃、约45℃-约55℃或约45℃-约55℃的温度进行。

99.如段落72-93中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤若存在，则在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。

100.如段落72-93中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤若存在，则在约50℃的温度进行。

101.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和沉淀步骤若存在，则在约4℃-约30℃的温度进行。

102.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和沉淀步骤若存在，则在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度进行。

103.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和沉淀步骤若存在，则在约20℃的温度进行。

104.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和沉淀步骤若存在，则在约30℃-约95℃的温度进行。

105.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和沉淀步骤若存在，则在约35℃-约80℃、约40℃-约70℃、约45℃-约65℃、约50℃-约60℃、约50℃-约55℃、约45℃-约55℃或约45℃-约55℃的温度进行。

106.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和沉淀步骤若存在，则在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。

107.如段落1-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和沉淀步骤若存在，则在约50℃的温度进行。

108.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和酸化步骤在约4℃-约30℃的温度进行。

109.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和酸化步骤在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度进行。

110.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和酸化步骤在约20℃的温度进行。

111.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和酸化步骤在约30℃-约95℃的温度进行。

112.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和酸化步骤在约35℃-约80℃、约40℃-约70℃、约45℃-约65℃、约50℃-约60℃、约50℃-约55℃、约45℃-约55℃或约45℃-约55℃的温度进行。

113.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和酸化步骤在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。

114.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂和酸化步骤在约50℃的温度进行。

115.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂、沉淀和酸化步骤在约4℃-约30℃的温度进行。

116.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂、沉淀和酸化步骤在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度进行。

117.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂、沉淀和酸化步骤在约20℃的温度进行。

118.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂、沉淀和酸化步骤在约30℃-约95℃的温度进行。

119.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂、沉淀和酸化步骤在约35℃-约80℃、约40℃-约70℃、约45℃-约65℃、约50℃-约60℃、约50℃-约55℃、约45℃-约55℃或约45℃-约55℃的温度进行。

120.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂、沉淀和酸化步骤在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。

121.如段落72-79中任一项所述的方法，其中所述加入絮凝剂、沉淀和酸化步骤在约50℃的温度进行。

122.如段落1-71,80-93或101-107中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤包括加入絮凝剂，而没有pH调节。

123.如段落1-122中任一项所述的方法，其中所述絮凝步骤包括加入絮凝剂、调节pH和溶液沉淀。

124.如段落123所述的方法，其中所述絮凝剂在调节pH前加入。

125.如段落123所述的方法，其中所述pH在加入絮凝剂前调节。

126.如段落123所述的方法，其中所述pH在加入絮凝剂和溶液沉淀前调节。

127.如段落123所述的方法，其中所述加入絮凝剂和溶液沉淀在调节pH前进行。

128.如段落1-127中任一项所述的方法，其中絮凝后，通过倾析、沉积、过滤或离心使悬液澄清。

129.如段落1-127中任一项所述的方法，其中絮凝后，通过倾析使悬液澄清。

130.如段落1-127中任一项所述的方法，其中絮凝后，通过旋液分离器使悬液澄清。

131.如段落1-127中任一项所述的方法，其中絮凝后，通过沉淀使悬液澄清。

132.如段落1-127中任一项所述的方法，其中絮凝后，通过漂浮使悬液澄清。

133.如段落1-127中任一项所述的方法，其中絮凝后，通过过滤使悬液澄清。

134.如段落1-127中任一项所述的方法，其中絮凝后，通过离心使悬液澄清。

135.如段落127-134中任一项所述的方法，其中所述含有多糖的溶液收集用于存储。

136.如段落127-134中任一项所述的方法，其中所述含有多糖的溶液收集用于另外加工。

137.如段落127-134中任一项所述的方法，其中所述含有多糖的溶液保存且随后另外加工。

138.如段落134-137中任一项所述的方法，其中所述离心是连续离心。

139.如段落134-137中任一项所述的方法，其中所述离心是斗式离心。

140.如段落134-139中任一项所述的方法，其中所述悬液在约1,000g约2,000g、约3,000g、约4,000g、约5,000g、约6,000g、约8,000g、约9,000g、约10,000g、约11,000g、约12,000g、约13,000g、约14,000g、约15,000g、约16,000g、约17,000g、约18,000g、约19,000g、约20,000g、约25,000g、约30,000g、约35,000g、约40,000g、约50,000g、约60,000g、约70,000g、约80,000g、约90,000g、约100,000g、约120,000g、约140,000g、约160,000g或约180,000g离心。

141.如段落134-139中任一项所述的方法，其中所述悬液在约8,000g,约9,000g、约10,000g、约11,000g、约12,000g、约13,000g、约14,000g、约15,000g、约16,000g、约17,000g、约18,000g、约19,000g、约20,000g或约25,000g离心。

142.如段落134-139中任一项所述的方法，其中所述悬液在约5,000g-约25,000g离心。

143.如段落134-139中任一项所述的方法，其中所述悬液在约8,000g-约20,000g离心。

144.如段落134-139中任一项所述的方法，其中所述悬液在约10,000g-约15,000g离心。

145.如段落134-139中任一项所述的方法，其中所述悬液在约10,000g-约12,000g离心。

146.如段落134-145中任一项所述的方法，其中所述悬液在至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155或至少160分钟期间离心。

147.如段落146中任一项所述的方法，其中所述悬液在小于24小时期间离心。

148.如段落134-145中任一项所述的方法，其中所述悬液在约5、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320或约1380分钟到1440分钟期间离心。

149.悬液优选在约5、约10、约15、约20、约25、约30、约60、约90、约120、约180、约240、约300、约360、约420、约480或约540分钟到约600分钟期间离心。

150.如段落134-145中任一项所述的方法，其中所述悬液在约5分钟-约3小时期间离心。

151.如段落134-145中任一项所述的方法，其中所述悬液在约5分钟-约120分钟期间离心。

152.如段落134-145中任一项所述的方法，其中所述悬液在约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟或约155分钟到约160分钟期间离心。

153.如段落134-145中任一项所述的方法，其中所述悬液在约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟或约55分钟到约60分钟期间离心。

154.如段落134-145中任一项所述的方法，其中所述悬液在约5、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380分钟或约1440分钟期间离心。

155.如段落134-145中任一项所述的方法，其中所述悬液在约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟或约160分钟期间离心。

156.如段落134-138或140-155中任一项所述的方法，其中所述离心是连续离心且进料速度是50-5000ml/min、100-4000ml/min、150-3000ml/min、200-2500ml/min、250-2000ml/min、300-1500ml/min、300-1000ml/min、200-1000ml/min、200-1500ml/min、400-1500ml/min、500-1500ml/min、500-1000ml/min、500-2000ml/min、500-2500ml/min或1000-2500ml/min。

157.如段落134-138或140-155中任一项所述的方法，其中所述离心是连续离心且进料速度是约10、约25、约50、约75、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约1400、约1450、约1500、约1650约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3250、约3500、约3750约4000、约4250、约4500或约5000ml/min。

158.如段落1-157中任一项所述的方法，其中过滤所述含有多糖的溶液。

159.如段落158所述的方法，其中所述过滤选自深层过滤、活性炭过滤、尺寸过滤、透析过滤和超滤。

160.如段落158所述的方法，其中所述过滤步骤是透析过滤。

161.如段落160所述的方法，其中所述过滤是切向流过滤。

162.如段落158所述的方法，其中所述过滤是深层过滤。

163.如段落162所述的方法，其中所述深层过滤设计选自盒、筒、深床(如砂滤器)和透镜状滤器。

164.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-100微米、约0.05-100微米、约0.1-100微米、约0.2-100微米、约0.3-100微米、约0.4-100微米、约0.5-100微米、约0.6-100微米、约0.7-100微米、约0.8-100微米、约0.9-100微米、约1-100微米、约1.25-100微米、约1.5-100微米、约1.75-100微米、约2-100微米、约3-100微米、约4-100微米、约5-100微米、约6-100微米、约7-100微米、约8-100微米、约9-100微米、约10-100微米、约15-100微米、约20-100微米、约25-100微米、约30-100微米、约40-100微米、约50-100微米或约75-100微米。

165.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-75微米、约0.05-75微米、约0.1-75微米、约0.2-75微米、约0.3-75微米、约0.4-75微米、约0.5-75微米、约0.6-75微米、约0.7-75微米、约0.8-75微米、约0.9-75微米、约1-75微米、约1.25-75微米、约1.5-75微米、约1.75-75微米、约2-75微米、约3-75微米、约4-75微米、约5-75微米、约6-75微米、约7-75微米、约8-75微米、约9-75微米、约10-75微米、约15-75微米、约20-75微米、约25-75微米、约30-75微米、约40-75微米或约50-75微米。

166.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-50微米、约0.05-50微米、约0.1-50微米、约0.2-50微米、约0.3-50微米、约0.4-50微米、约0.5-50微米、约0.6-50微米、约0.7-50微米、约0.8-50微米、约0.9-50微米、约1-50微米、约1.25-50微米、约1.5-50微米、约1.75-50微米、约2-50微米、约3-50微米、约4-50微米、约5-50微米、约6-50微米、约7-50微米、约8-50微米、约9-50微米、约10-50微米、约15-50微米、约20-50微米、约25-50微米、约30-50微米、约40-50微米或约50-50微米。

167.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-25微米、约0.05-25微米、约0.1-25微米、约0.2-25微米、约0.3-25微米、约0.4-25微米、约0.5-25微米、约0.6-25微米、约0.7-25微米、约0.8-25微米、约0.9-25微米、约1-25微米、约1.25-25微米、约1.5-25微米、约1.75-25微米、约2-25微米、约3-25微米、约4-25微米、约5-25微米、约6-25微米、约7-25微米、约8-25微米、约9-25微米、约10-25微米、约15-25微米或约20-25微米。

168.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-10微米、约0.05-10微米、约0.1-10微米、约0.2-10微米、约0.3-10微米、约0.4-10微米、约0.5-10微米、约0.6-10微米、约0.7-10微米、约0.8-10微米、约0.9-10微米、约1-10微米、约1.25-10微米、约1.5-10微米、约1.75-10微米、约2-10微米、约3-10微米、约4-10微米、约5-10微米、约6-10微米、约7-10微米、约8-10微米或约9-10微米。

169.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-8微米、约0.05-8微米、约0.1-8微米、约0.2-8微米、约0.3-8微米、约0.4-8微米、约0.5-8微米、约0.6-8微米、约0.7-8微米、约0.8-8微米、约0.9-8微米、约1-8微米、约1.25-8微米、约1.5-8微米、约1.75-8微米、约2-8微米、约3-8微米、约4-8微米、约5-8微米、约6-8微米或约7-8微米。

170.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-5微米、约0.05-5微米、约0.1-5微米、约0.2-5微米、约0.3-5微米、约0.4-5微米、约0.5-5微米、约0.6-5微米、约0.7-5微米、约0.8-5微米、约0.9-5微米、约1-5微米、约1.25-5微米、约1.5-5微米、约1.75-5微米、约2-5微米、约3-5微米或约4-5微米。

171.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米、约1.75-2微米、约2-2微米、约3-2微米或约4-2微米。

172.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米。

173.如段落158-159或162-163中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的标称的保留范围是约0.05-50微米、0.1-25微米0.2-10、微米0.1-10微米、0.2-5微米或0.25-1微米。

174.如段落158-159或162-173中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-2500L/m²、5-2500L/m²、10-2500L/m²、25-2500L/m²、50-2500L/m²、75-2500L/m²、100-2500L/m²、150-2500L/m²、200-2500L/m²、300-2500L/m²、400-2500L/m²、500-2500L/m²、750-2500L/m²、1000-2500L/m²、1500-2500L/m²或2000-2500L/m²。

175.如段落158-159或162-173中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-1000L/m²、5-1000L/m²、10-1000L/m²、25-1000L/m²、50-1000L/m²、75-1000L/m²、100-1000L/m²、150-1000L/m²、200-1000L/m²、300-1000L/m²、400-1000L/m²、500-1000L/m²或750-1000L/m²。

176.如段落155-156或159-170中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-750L/m²、5-750L/m²、10-750L/m²、25-750L/m²、50-750L/m²、75-750L/m²、100-750L/m²、150-750L/m²、200-750L/m²、300-750L/m²、400-750L/m²或500-750L/m²。

177.如段落158-159或162-173中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-500L/m²、5-500L/m²、10-500L/m²、25-500L/m²、50-500L/m²、75-500L/m²、100-500L/m²、150-500L/m²、200-500L/m²、300-500L/m²或400-500L/m²。

178.如段落158-159或162-173中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-400L/m²、5-400L/m²、10-400L/m²、25-400L/m²、50-400L/m²、75-400L/m²、100-400L/m²、150-400L/m²、200-400L/m²或300-400L/m²。

179.如段落158-159或162-173中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-300L/m²、5-300L/m²、10-300L/m²、25-300L/m²、50-300L/m²、75-300L/m²、100-300L/m²、150-300L/m²或200-300L/m²。

180.如段落158-159或162-173中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-200L/m²、5-200L/m²、10-200L/m²、25-200L/m²、50-200L/m²、75-200L/m²、100-200L/m²或150-200L/m²。

181.如段落158-159或162-173中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-100L/m²、5-100L/m²、10-100L/m²、25-100L/m²、50-100L/m²或75-100L/m²。

182.如段落158-159或162-173中任一项所述的方法，其中所述深层过滤器的过滤容积是1-50L/m²、5-50L/m²、10-50L/m²或25-50L/m²。

183.如段落158-159或162-182中任一项所述的方法，其中所述进料速度是1-1000LMH(升/m²/小时)、10-1000LMH、25-1000LMH、50-1000LMH、100-1000LMH、125-1000LMH、150-1000LMH、200-1000LMH、250-1000LMH、300-1000LMH、400-1000LMH、500-1000LMH、600-1000LMH、700-1000LMH、800-1000LMH或900-1000LM。

184.如段落158-159或162-182中任一项所述的方法，其中所述进料速度是1-500LMH、10-500LMH、25-500LMH、50-500LMH、100-500LMH、125-500LMH、150-500LMH、200-500LMH、250-500LMH、300-500LMH或400-500LMH。

185.如段落158-159或162-182中任一项所述的方法，其中所述进料速度是1-400LMH、10-400LMH、25-400LMH、50-400LMH、100-400LMH、125-400LMH、150-400LMH、200-400LMH、250-400LMH或300-400LMH。

186.如段落158-159或162-182中任一项所述的方法，其中所述进料速度是1-250LMH、10-250LMH、25-250LMH、50-250LMH、100-250LMH、125-250LMH、150-250LMH或200-250LMH。

187.如段落158-159或162-182中任一项所述的方法，其中所述进料速度是约1、约2、约5、约10、约25、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290、约300、约310、约320、约330、约340、约350、约360、约370、约380、约390、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000LMH。

188.如段落158-187中任一项所述的方法，其中所述滤液经历微滤。

189.如段落188所述的方法，其中所述微滤是死端过滤。

190.如段落188所述的方法，其中所述微滤是切向微滤。

191.如段落188-190中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的标称的保留范围是约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.45-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米或约1.75-2微米。

192.如段落188-190中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的标称的保留范围是约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米。

193.如段落188-190中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的标称的保留范围是约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2微米。

194.如段落188-190中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的标称的保留是约0.45微米。

195.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-5000L/m²、200-5000L/m²、300-5000L/m²、400-5000L/m²、500-5000L/m²、750-5000L/m²、1000-5000L/m²、1500-5000L/m²、2000-5000L/m²、3000-5000L/m²或4000-5000L/m²。

196.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-2500L/m²、200-2500L/m²、300-2500L/m²、400-2500L/m²、500-2500L/m²、750-2500L/m²、1000-2500L/m²、1500-2500L/m²或2000-2500L/m²。

197.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-1500L/m²、200-1500L/m²、300-1500L/m²、400-1500L/m²、500-1500L/m²、750-1500L/m²或1000-1500L/m²。

198.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-1250L/m²、200-1250L/m²、300-1250L/m²、400-1250L/m²、500-1250L/m²、750-1250L/m²或1000-1250L/m²。

199.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-1000L/m²、200-1000L/m²、300-1000L/m²、400-1000L/m²、500-1000L/m²或750-1000L/m²。

200.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-750L/m²、200-750L/m²、300-750L/m²、400-750L/m²或500-750L/m²。

201.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-600L/m²、200-600L/m²、300-600L/m²、400-600L/m²或400-600L/m²。

202.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-500L/m²、200-500L/m²、300-500L/m²或400-500L/m²。

203.如段落188-194中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约1400、约1450、约1500、约1550、约1600、约1650、约1700、约1750、约1800、约1850、约1900、约1950、约2000、约2050、约2100、约2150、约2200、约2250、约2300、约2350、约2400、约2450或约2500L/m²。

204.如段落158-203中任一项所述的方法，其中所述滤液通过超滤和/或透析过滤进一步处理。

205.如段落158-203中任一项所述的方法，其中所述滤液通过超滤进一步处理。

206.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约5kDa-1000kDa。

207.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约10kDa-750kDa。

208.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约10kDa-500kDa。

209.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约10kDa-300kDa。

210.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约10kDa-100kDa。

211.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约10kDa-50kDa。

212.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约10kDa-30kDa。

213.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约5kDa-1000kDa、约10kDa-1000kDa约20kDa-1000kDa、约30kDa-1000kDa、约40kDa-1000kDa、约50kDa-1000kDa、约75kDa-1000kDa、约100kDa-1000kDa、约150kDa-1000kDa、约200kDa-1000kDa、约300kDa-1000kDa、约400kDa-1000kDa、约500kDa-1000kDa或约750kDa-1000kDa。

214.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约5kDa-500kDa、约10kDa-500kDa、约20kDa-500kDa、约30kDa-500kDa、约40kDa-500kDa、约50kDa-500kDa、约75kDa-500kDa、约100kDa-500kDa、约150kDa-500kDa、约200kDa-500kDa、约300kDa-500kDa或约400kDa-500kDa。

215.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约5kDa-300kDa、约10kDa-300kDa、约20kDa-300kDa、约30kDa-300kDa、约40kDa-300kDa、约50kDa-300kDa、约75kDa-300kDa、约100kDa-300kDa、约150kDa-300kDa或约200kDa-300kDa。

216.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约5kDa-100kDa、约10kDa-100kDa、约20kDa-100kDa、约30kDa-100kDa、约40kDa-100kDa、约50kDa-100kDa或约75kDa-100kDa。

217.如段落204-205中任一项所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截取值范围是约5kDa、约10kDa、约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50kDa、约60kDa、约70kDa、约80kDa、约90kDa、约100kDa、约110kDa、约120kDa、约130kDa、约140kDa、约150kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约400kDa、约500kDa、约750kDa或约1000kDa。

218.如段落204-217中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩因数是约1.5-约10。

219.如段落204-217中任一项所述的方法，其中所述浓缩因数是约2–约8。

220.如段落204-217中任一项所述的方法，其中所述浓缩因数是约2-约5。

221.如段落204-217中任一项所述的方法，其中所述浓缩因数是约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。

222.如段落204-217中任一项所述的方法，其中所述浓缩因数是约2、约3、约4、约5或约6。

223.如段落204-222中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。

224.如段落204-222中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。

225.如段落204-222中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤在以下温度进行：约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃。

226.如段落204-222中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤在约50℃的温度进行。

227.如段落158-226中任一项所述的方法，其中所述超滤滤液通过透析过滤处理。

228.如段落227所述的方法，其中所述替代溶液是水

229.如段落227所述的方法，其中所述替代溶液是溶于水的盐水。

230.如段落229所述的方法，其中所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。

231.如段落229所述的方法，其中所述盐是氯化钠。

232.如段落229所述的方法，其中所述替代溶液是氯化钠，其为约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM,约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM。

233.如段落227所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液。

234.如段落227所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自N-(2-乙酰胺基)-氨基乙磺酸(ACES)、乙酸的盐(乙酸盐)、N-(2-乙酰胺基)-亚氨基二乙酸(ADA)、2-氨基乙磺酸(AES、牛磺酸)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇AMPD、ammediol、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、碳酸氢钠(碳酸氢盐)、N,N’-双(2-羟乙基)-甘氨酸(二甘氨酸)、[双(2-羟乙基)-亚氨基]-三(羟甲基甲烷)(BIS-Tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(BIS-Tris-丙烷)、硼酸、二甲胂酸(甲次砷酸盐)、3-(环己胺)-丙磺酸(CAPS)、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、碳酸钠(碳酸盐)、环己胺乙磺酸(CHES)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、甲酸的盐(甲酸盐),甘氨酸、双甘氨肽、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-乙磺酸(HEPES)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-3-丙磺酸(HEPPS、EPPS)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、咪唑、苹果酸的盐(苹果酸盐)、马来酸的盐(马来酸盐)、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、磷酸的盐(磷酸盐)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、吡啶、琥珀酸的盐(琥珀酸盐)、3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(TAPS)、3-[N-三(羟甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、三乙醇胺(TEA)、2-[三(羟甲基)-甲氨基]-乙磺酸(TES)、N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(Tricine)和三(羟甲基)-甲胺(Tris)。

235.如段落227所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自乙酸的盐(乙酸盐)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、甲酸的盐(甲酸盐)、苹果酸的盐(苹果酸盐)、马来酸的盐(马来酸盐)、磷酸的盐(磷酸盐)和琥珀酸的盐(琥珀酸盐)。

236.如段落227所述的方法，其中所述替代溶液是柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。

237.如段落227所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是琥珀酸的盐(琥珀酸盐)。

238.如段落234-237中任一项所述的方法，其中所述盐是钠盐。

239.如段落234-237中任一项所述的方法，其中所述盐是钾盐。

240.如段落233-239中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约4.0-11.0、约5.0-10.0、约5.5-9.0、约6.0-8.0、约6.0-7.0、约6.5-7.5、约6.5-7.0或约6.0-7.5。

241.如段落233-239中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5或约11.0。

242.如段落233-239中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0。

243.如段落226-231中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约6.5、约7.0或约7.5。

244.如段落233-239中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约7.0。

245.如段落233-244中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-100mM、约0.1mM-100mM、约0.5mM-100mM、约1mM-100mM、约2mM-100mM、约3mM-100mM、约4mM-100mM、约5mM-100mM、约6mM-100mM、约7mM-100mM、约8mM-100mM、约9mM-100mM、约10mM-100mM、约11mM-100mM、约12mM-100mM、约13mM-100mM、约14mM-100mM、约15mM-100mM、约16mM-100mM、约17mM-100mM、约18mM-100mM、约19mM-100mM、约20mM-100mM、约25mM-100mM、约30mM-100mM、约35mM-100mM、约40mM-100mM、约45mM-100mM、约50mM-100mM、约55mM-100mM、约60mM-100mM、约65mM-100mM、约70mM-100mM、约75mM-100mM、约80mM-100mM、约85mM-100mM、约90mM-100mM或约95mM-100mM。

246.如段落233-244中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-50mM、约0.1mM-50mM、约0.5mM-50mM、约1mM-50mM、约2mM-50mM、约3mM-50mM、约4mM-50mM、约5mM-50mM、约6mM-50mM、约7mM-50mM、约8mM-50mM、约9mM-50mM、约10mM-50mM、约11mM-50mM、约12mM-50mM、约13mM-50mM、约14mM-50mM、约15mM-50mM、约16mM-50mM、约17mM-50mM、约18mM-50mM、约19mM-50mM、约20mM-50mM、约25mM-50mM、约30mM-50mM、约35mM-50mM、约40mM-50mM或约45mM-50mM。

247.如段落233-244中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-25mM、约0.1mM-25mM、约0.5mM-25mM、约1mM-25mM、约2mM-25mM、约3mM-25mM、约4mM-25mM、约5mM-25mM、约6mM-25mM、约7mM-25mM、约8mM-25mM、约9mM-25mM、约10mM-25mM、约11mM-25mM、约12mM-25mM、约13mM-25mM、约14mM-25mM、约15mM-25mM、约16mM-25mM、约17mM-25mM、约18mM-25mM、约19mM-25mM或约20mM-25mM。

248.如段落233-244中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-15mM、约0.1mM-15mM、约0.5mM-15mM、约1mM-15mM、约2mM-15mM、约3mM-15mM、约4mM-15mM、约5mM-15mM、约6mM-15mM、约7mM-15mM、约8mM-15mM、约9mM-15mM、约10mM-15mM、约11mM-15mM、约12mM-15mM、约13mM-15mM或约14mM-15mM。

249.如段落233-244中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-10mM、约0.1mM-10mM、约0.5mM-10mM、约1mM-10mM、约2mM-10mM、约3mM-10mM、约4mM-10mM、约5mM-10mM、约6mM-10mM、约7mM-10mM、约8mM-10mM或约9mM-10mM。

250.如段落233-244中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95或约100mM。

251.如段落233-244中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.1mM、约0.2mM、约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约30mM、约40mM或约50mM。

252.如段落233-244中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约10mM。

253.如段落233-252中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含螯合剂。

254.如段落233-252中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含明矾螯合剂。

255.如段落233-252中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸盐(EDTA)、N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸(EDTA-OH)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、1,2-环己二胺-N,N,N',N'-四乙酸(CyDTA)、二亚乙基三胺-N,N,N',N",N"-五乙酸(DTPA)、1,3-二氨基丙-2-醇-N,N,N',N'-四乙酸(DPTA-OH)、乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯乙酸)(EDDHA)、乙二胺-N,N'-二丙酸二盐酸盐(EDDP),乙二胺-四(亚甲基磺酸)(EDTPO)、次氮基三(亚甲基膦酸)(NTPO)、亚氨基二乙酸(IDA)、异亚硝基-二乙酸(HIDA)、次氮基三乙酸(NTP)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、二巯基丁二酸(DMSA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)、α硫辛酸(ALA)、次氮基三乙酸(NTA),呋喃硫胺(TTFD)、二巯基丙醇、青霉胺、去铁胺(DFOA)、地拉罗司、膦酸盐、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。

256.如段落233-255中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸盐(EDTA)、N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸(EDTA-OH)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、1,2-环己二胺-N,N,N',N'-四乙酸(CyDTA)、二亚乙基三胺-N,N,N',N",N"-五乙酸(DTPA),1,3-二氨基丙-2-醇-N,N,N',N'-四乙酸(DPTA-OH)、乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯乙酸)(EDDHA),柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。

257.如段落233-254中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含作为螯合剂的乙二胺四乙酸盐(EDTA)。

258.如段落233-254中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含作为螯合剂的柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。

259.如段落233-254中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含作为螯合剂的柠檬酸钠。

260.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是1-500mM。

261.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是2-400mM。

262.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-400mM。

263.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-200mM。

264.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-100mM。

265.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-50mM。

266.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-30mM。

267.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM,约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约45mM、约50mM,约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95或约100mM。

268.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM或约100mM。

269.如段落253-258中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM。

270.如段落233-269中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含盐。

271.如段落270所述的方法，其中所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。

272.如段落270所述的方法，其中所述盐是氯化钠。

273.如段落270-272中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含氯化钠，其是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mM。

274.如段落227-273中任一项所述的方法，其中所述透析体积数是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50。

275.如段落227-273中任一项所述的方法，其中所述透析体积数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100。

276.如段落227-273中任一项所述的方法，其中所述透析体积数是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。

277.如段落227-276中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。

278.如段落227-276中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。

279.如段落227-276中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在以下温度进行：约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃,约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃。

280.如段落227-276中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在约50℃的温度进行。

281.如段落204-277中任一项所述的方法，其中所述超滤和透析过滤步骤若都实施，则在约20℃-约90℃的温度进行。

282.如段落204-277中任一项所述的方法，其中所述超滤和透析过滤步骤若都实施，则在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。

283.如段落204-277中任一项所述的方法，其中所述超滤和透析过滤步骤若都实施，则在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃,约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。

284.如段落204-277中任一项所述的方法，其中所述超滤和透析过滤步骤若都实施，则在约50℃的温度进行。

285.如段落1-284中任一项所述的方法，其中所述含多糖溶液(如上清、滤液或保留物)通过活性炭过滤步骤处理。

286.如段落285所述的方法，其中所述活性炭加入的形式是粉末，作为颗粒状活性炭滤床，作为压制炭块或挤压炭块(参见例如Norit活性炭)。

287.如段落286所述的方法，其中所述活性炭加入的量是约0.1-20％(重量体积)、1-15％(重量体积)、1-10％(重量体积)、2-10％(重量体积)、3-10％(重量体积)、4-10％(重量体积)、5-10％(重量体积)、1-5％(重量体积)或2-5％(重量体积)。

288.如段落286-287中任一项所述的方法，其中所述混合物进行搅拌并静置。

289.如段落286-287中任一项所述的方法，其中所述混合物进行搅拌并保持静置约5、约10、约15、约20、约30、约45、约60、约90、约120、约180、约240分钟或更长。

290.如段落286-289中任一项所述的方法，其中所述活性炭随后去除。

291.如段落286-290中任一项所述的方法，其中所述活性炭通过例如离心或过滤去除。

292.如段落285所述的方法，其中所述溶液经固定于基质中的活性炭过滤。

293.如段落285所述的方法，其中所述基质是溶液可渗透的多孔过滤介质。

294.如段落292-293中任一项所述的方法，其中所述基质包含支撑材料。

295.如段落292-293中任一项所述的方法，其中所述基质包含粘合材料。

296.如段落294-295中任一项所述的方法，其中所述支撑材料是合成聚合物。

297.如段落294-295中任一项所述的方法，其中所述支撑材料是天然来源的聚合物。

298.如段落296所述的方法，其中所述合成聚合物包括聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种。

299.如段落296所述的方法，其中所述合成聚合物选自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酸甲酯。

300.如段落297所述的方法，其中所述天然来源的聚合物包括纤维素、多糖、葡聚糖或琼脂糖中的任意一种。

301.如段落297所述的方法，其中所述天然来源的聚合物选自纤维素、多糖、葡聚糖和琼脂糖。

302.如段落294-301中任一项所述的方法，其中所述聚合物支撑材料若存在，则采用纤维网络形式以提供机械刚性。

303.如段落294-302中任一项所述的方法，其中所述粘合材料若存在，则是树脂。

304.如段落292-303中任一项所述的方法，其中所述基质具有膜片形式。

305.如段落292-304中任一项所述的方法，其中所述固定于基质中的活性炭采用流通式碳筒形式。

306.如段落304所述的方法，其中所述膜片是卷绕式。

307.如段落292-306中任一项所述的方法，其中所述数个盘彼此堆叠。

308.如段落307所述的方法，其中所述堆叠盘的构型是透镜状。

309.如段落292-308中任一项所述的方法，其中所述炭过滤器中的活性炭获自泥炭、褐煤、木材或椰子壳。

310.如段落292-309中任一项所述的方法，其中所述固定于基质中的活性炭放置于壳体以形成独立滤器单元。

311.如段落292-310中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器包含纤维素基质，其中适当地保留有活性炭粉末且结合树脂。

312.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-100微米、约0.05-100微米、约0.1-100微米、约0.2-100微米、约0.3-100微米、约0.4-100微米、约0.5-100微米、约0.6-100微米、约0.7-100微米、约0.8-100微米、约0.9-100微米、约1-100微米、约1.25-100微米、约1.5-100微米、约1.75-100微米、约2-100微米、约3-100微米、约4-100微米、约5-100微米、约6-100微米、约7-100微米、约8-100微米、约9-100微米、约10-100微米、约15-100微米、约20-100微米、约25-100微米、约30-100微米、约40-100微米、约50-100微米或约75-100微米。

313.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-50微米、约0.05-50微米、约0.1-50微米、约0.2-50微米、约0.3-50微米、约0.4-50微米、约0.5-50微米、约0.6-50微米、约0.7-50微米、约0.8-50微米、约0.9-50微米、约1-50微米、约1.25-50微米、约1.5-50微米、约1.75-50微米、约2-50微米、约3-50微米、约4-50微米、约5-50微米、约6-50微米、约7-50微米、约8-50微米、约9-50微米、约10-50微米、约15-50微米、约20-50微米、约25-50微米、约30-50微米、约40-50微米或约50-50微米。

314.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-25微米、约0.05-25微米、约0.1-25微米、约0.2-25微米、约0.3-25微米、约0.4-25微米、约0.5-25微米、约0.6-25微米、约0.7-25微米、约0.8-25微米、约0.9-25微米、约1-25微米、约1.25-25微米、约1.5-25微米、约1.75-25微米、约2-25微米、约3-25微米、约4-25微米、约5-25微米、约6-25微米、约7-25微米、约8-25微米、约9-25微米、约10-25微米、约15-25微米或约20-25微米。

315.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-10微米、约0.05-10微米、约0.1-10微米、约0.2-10微米、约0.3-10微米、约0.4-10微米、约0.5-10微米、约0.6-10微米、约0.7-10微米、约0.8-10微米、约0.9-10微米、约1-10微米、约1.25-10微米、约1.5-10微米、约1.75-10微米、约2-10微米、约3-10微米、约4-10微米、约5-10微米、约6-10微米、约7-10微米、约8-10微米或约9-10微米。

316.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-8微米、约0.05-8微米、约0.1-8微米、约0.2-8微米、约0.3-8微米、约0.4-8微米、约0.5-8微米、约0.6-8微米、约0.7-8微米、约0.8-8微米、约0.9-8微米、约1-8微米、约1.25-8微米、约1.5-8微米、约1.75-8微米、约2-8微米、约3-8微米、约4-8微米、约5-8微米、约6-8微米或约7-8微米。

317.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-5微米、约0.05-5微米、约0.1-5微米、约0.2-5微米、约0.3-5微米、约0.4-5微米、约0.5-5微米、约0.6-5微米、约0.7-5微米、约0.8-5微米、约0.9-5微米、约1-5微米、约1.25-5微米、约1.5-5微米、约1.75-5微米、约2-5微米、约3-5微米或约4-5微米。

318.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米、约1.75-2微米、约2-2微米、约3-2微米或约4-2微米。

319.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米。

320.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器的标称的微米等级是约0.05-50微米、0.1-25微米0.2-10、微米0.1-10微米、0.2-5微米或0.25-1微米。

321.如段落285-320中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器实施的进料速度为1-500LMH、10-500LMH、15-500LMH、20-500LMH、25-500LMH、30-500LMH、40-500LMH、50-500LMH、100-500LMH、125-500LMH、150-500LMH、200-500LMH、250-500LMH、300-500LMH或400-500LMH。

322.如段落285-320中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器实施的进料速度为1-200LMH、10-200LMH、15-200LMH、20-200LMH、25-200LMH、30-200LMH、40-200LMH、50-200LMH、100-200LMH、125-200LMH或150-200LMH。

323.如段落285-320中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器实施的进料速度为1-150LMH、10-150LMH、15-150LMH、20-150LMH、25-150LMH、30-150LMH、40-150LMH、50-150LMH、100-150LMH或125-150LMH。

324.如段落285-320中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器实施的进料速度为1-100LMH、10-100LMH、15-100LMH、20-100LMH、25-100LMH、30-100LMH、40-100LMH或50-100LMH。

325.如段落285-320中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器实施的进料速度为1-75LMH、5-75LMH、10-75LMH、15-75LMH、20-75LMH、25-75LMH、30-75LMH、35-75LMH、40-75LMH、45-75LMH、50-75LMH、55-75LMH、60-75LMH、65-75LMH或70-75LMH。

326.如段落285-320中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器实施的进料速度为1-50LMH、5-50LMH、7-50LMH、10-50LMH、15-50LMH、20-50LMH、25-50LMH、30-50LMH、35-50LMH、40-50LMH或45-50LMH。

327.如段落285-320中任一项所述的方法，其中所述活性炭滤器实施的进料速度为约1、约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约225、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约700、约800、约900、约950或约1000LMH。

328.如段落285-327中任一项所述的方法，其中所述溶液通过活性炭滤器处理，其中所述滤器的过滤容积是5-1000L/m²、10-750L/m²、15-500L/m²、20-400L/m²、25-300L/m²、30-250L/m²、40-200L/m²或30-100L/m²。

329.如段落285-327中任一项所述的方法，其中所述溶液通过活性炭滤器处理，其中所述滤器的过滤容积是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000L/m²。

330.如段落285-329中任一项所述的方法，其中实施1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个活性炭过滤步骤。

331.如段落285-329中任一项所述的方法，其中实施1、2或3个活性炭过滤步骤。

332.如段落285-329中任一项所述的方法，其中实施1或2个活性炭过滤步骤。

333.如段落285-332中任一项所述的方法，其中所述溶液通过串联的活性炭滤器处理。

334.如段落285-332中任一项所述的方法，其中所述液通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个串联的活性炭滤器处理。

335.如段落285-332中任一项所述的方法，其中所述溶液通过2、3、4或5个串联的活性炭滤器处理。

336.如段落285-332中任一项所述的方法，其中所述溶液通过2个串联的活性炭滤器处理。

337.如段落285-332中任一项所述的方法，其中所述溶液通过3个串联的活性炭滤器处理。

338.如段落285-332中任一项所述的方法，其中所述溶液通过4个串联的活性炭滤器处理。

339.如段落285-332中任一项所述的方法，其中所述溶液通过5个串联的活性炭滤器处理。

340.如段落285-339中任一项所述的方法，其中所述活性炭过滤步骤以单次通过模式进行。

341.如段落285-339中任一项所述的方法，其中所述活性炭过滤步骤以再循环模式进行。

342.如段落341所述的方法，其中实施2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个活性炭过滤循环。

343.如段落341所述的方法，其中实施2、3、4、5、6、7、8、9或10个活性炭过滤循环。

344.如段落341所述的方法，其中实施2或3个活性炭过滤循环。

345.如段落341所述的方法，其中实施2个活性炭过滤循环。

346.如段落285-345中任一项所述的方法，其中所述滤液进一步过滤。

347.如段落285-345中任一项所述的方法，其中所述滤液经受微滤。

348.如段落347所述的方法，其中所述微滤是死端过滤(垂直过滤)。

349.如段落347所述的方法，其中所述微滤是切向微滤。

350.如段落347-349中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的标称的保留范围是约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.45-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米或约1.75-2微米。

351.如段落347-349中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的标称的保留范围是约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米。

352.如段落347-349中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的标称的保留范围是约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0微米。

353.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的标称的保留范围是约0.2微米。

354.如段落347-353中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-6000L/m²、200-6000L/m²、300-6000L/m²、400-6000L/m²、500-6000L/m²、750-6000L/m²、1000-6000L/m²、1500-6000L/m²、2000-6000L/m²、3000-6000L/m²或4000-6000L/m²。

355.如段落347-353中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-4000L/m²、200-4000L/m²、300-4000L/m²、400-4000L/m²、500-4000L/m²、750-4000L/m²、1000-4000L/m²、1500-4000L/m²、2000-4000L/m²、2500-4000L/m²、3000-4000L/m²、3000-4000L/m²或3500-4000L/m²。

356.如段落347-353中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-3750L/m²、200-3750L/m²、300-3750L/m²、400-3750L/m²、500-3750L/m²、750-3750L/m²、1000-3750L/m²、1500-3750L/m²、2000-3750L/m²、2500-3750L/m²、3000-3750L/m²、3000-3750L/m²或3500-3750L/m²。

357.如段落347-353中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是100-1250L/m²、200-1250L/m²、300-1250L/m²、400-1250L/m²、500-1250L/m²、750-1250L/m²或1000-1250L/m²。

358.如段落347-353中任一项所述的方法，其中所述微滤过滤器的过滤容积是约100、约200、约300、约400、约550、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3100、约3200、约3300、约3400、约3500、约3600、约3700、约3800、约3900、约4000、约4100、约4200、约4300、约4400、约4500、约4600、约4700、约4800、约4900、约5000、约5250、约5500、约5750或约6000L/m²。

359.如段落285-359中任一项所述的方法，其中所述滤液通过超滤和/或透析过滤进一步澄清。

360.如段落285-359中任一项所述的方法，其中所述滤液通过超滤进一步澄清。

361.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约5kDa-1000kDa。

362.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约10kDa-750kDa。

363.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约10kDa-500kDa。

364.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约10kDa-300kDa。

365.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约10kDa-100kDa。

366.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约10kDa-50kDa。

367.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约10kDa-30kDa。

368.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约5kDa-1000kDa、约10kDa-1000kDa约20kDa-1000kDa、约30kDa-1000kDa、约40kDa-1000kDa、约50kDa-1000kDa、约75kDa-1000kDa、约100kDa-1000kDa、约150kDa-1000kDa、约200kDa-1000kDa、约300kDa-1000kDa、约400kDa-1000kDa、约500kDa-1000kDa或约750kDa-1000kDa。

369.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约5kDa-500kDa、约10kDa-500kDa、约20kDa-500kDa、约30kDa-500kDa、约40kDa-500kDa、约50kDa-500kDa、约75kDa-500kDa、约100kDa-500kDa、约150kDa-500kDa、约200kDa-500kDa、约300kDa-500kDa或约400kDa-500kDa。

370.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约5kDa-300kDa、约10kDa-300kDa、约20kDa-300kDa、约30kDa-300kDa、约40kDa-300kDa、约50kDa-300kDa、约75kDa-300kDa、约100kDa-300kDa、约150kDa-300kDa或约200kDa-300kDa。

371.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约5kDa-100kDa、约10kDa-100kDa、约20kDa-100kDa、约30kDa-100kDa、约40kDa-100kDa、约50kDa-100kDa或约75kDa-100kDa。

372.如段落359或360所述的方法，其中所述超滤膜的分子量截留范围是约5kDa、约10kDa、约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50kDa、约60kDa、约70kDa、约80kDa、约90kDa、约100kDa、约110kDa、约120kDa、约130kDa、约140kDa、约150kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约400kDa、约500kDa、约750kDa或约1000kDa。

373.如段落359-371中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩因数是约1.5-约10.0。

374.如段落359-371中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩因数是约2.0-约8.0。

375.如段落359-371中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩因数是约2.0-约5.0。

376.如段落359-371中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩因数是约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。在一个实施方案中，所述浓缩因数是约2.0、约3.0、约4.0、约5.0或约6.0。

377.如段落359-376中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。

378.如段落285-311中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。

379.如段落359-376中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤在以下温度进行：约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃。

380.如段落359-376中任一项所述的方法，其中所述超滤步骤在约50℃的温度进行。

381.如段落359-380中任一项所述的方法，其中所述超滤滤液通过透析过滤处理。

382.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是水。

383.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是溶于水的盐水。

384.如段落383所述的方法，其中所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。

385.如段落383所述的方法，其中所述盐是氯化钠。

386.如段落383所述的方法，其中所述替代溶液是氯化钠，其是约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100,约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450或约500mM。

387.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液。

388.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自N-(2-乙酰胺基)-氨基乙磺酸(ACES)、乙酸的盐(乙酸盐)、N-(2-乙酰胺基)-亚氨基二乙酸(ADA)、2-氨基乙磺酸(AES、牛磺酸)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇AMPD、ammediol、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、碳酸氢钠(碳酸氢盐)、N,N’-双(2-羟乙基)-甘氨酸(二甘氨酸)、[双(2-羟乙基)-亚氨基]-三(羟甲基甲烷)(BIS-Tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(BIS-Tris-丙烷),硼酸、二甲胂酸(甲次砷酸盐)、3-(环己胺)-丙磺酸(CAPS)、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、碳酸钠(碳酸盐)、环己胺乙磺酸(CHES)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、甲酸的盐(甲酸盐),甘氨酸、双甘氨肽、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-乙磺酸(HEPES)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-3-丙磺酸(HEPPS、EPPS)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、咪唑、苹果酸的盐(苹果酸盐)、马来酸的盐(马来酸盐)、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、磷酸的盐(磷酸盐)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、吡啶、琥珀酸的盐(琥珀酸盐)、3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(TAPS)、3-[N-三(羟甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、三乙醇胺(TEA)、2-[三(羟甲基)-甲氨基]-乙磺酸(TES)、N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(Tricine)和三(羟甲基)-甲胺(Tris)。

389.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自乙酸的盐(乙酸盐)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、甲酸的盐(甲酸盐)、苹果酸的盐(苹果酸盐)、马来酸的盐(马来酸盐)、磷酸的盐(磷酸盐)和琥珀酸的盐(琥珀酸盐)。

390.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。

391.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是琥珀酸的盐(琥珀酸盐)。

392.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是磷酸的盐(磷酸盐)。

393.如段落388-392中任一项所述的方法，其中所述盐是钠盐。

394.如段落388-392中任一项所述的方法，其中所述盐是钾盐。

395.如段落381所述的方法，其中所述替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是磷酸钾。

396.如段落381-395中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约4.0-11.0、约5.0-10.0、约5.5-9.0、约6.0-8.0、约6.0-7.0、约6.5-7.5、约6.5-7.0或约6.0-7.5。

397.如段落381-395中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5或约11.0。

398.如段落381-395中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0。

399.如段落381-395中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约6.5、约7.0或约7.5。

400.如段落381-395中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约6.0。

401.如段落381-395中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约6.5。

402.如段落381-395中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的pH是约7.0。

403.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-100mM、约0.1mM-100mM、约0.5mM-100mM、约1mM-100mM、约2mM-100mM、约3mM-100mM、约4mM-100mM、约5mM-100mM、约6mM-100mM、约7mM-100mM、约8mM-100mM、约9mM-100mM、约10mM-100mM、约11mM-100mM、约12mM-100mM、约13mM-100mM、约14mM-100mM、约15mM-100mM、约16mM-100mM、约17mM-100mM、约18mM-100mM、约19mM-100mM、约20mM-100mM、约25mM-100mM、约30mM-100mM、约35mM-100mM、约40mM-100mM、约45mM-100mM、约50mM-100mM、约55mM-100mM、约60mM-100mM、约65mM-100mM、约70mM-100mM、约75mM-100mM、约80mM-100mM、约85mM-100mM、约90mM-100mM或约95mM-100mM。

404.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-50mM、约0.1mM-50mM、约0.5mM-50mM、约1mM-50mM、约2mM-50mM、约3mM-50mM、约4mM-50mM、约5mM-50mM、约6mM-50mM、约7mM-50mM、between约8mM-50mM、约9mM-50mM、约10mM-50mM、约11mM-50mM、约12mM-50mM、约13mM-50mM、约14mM-50mM、约15mM-50mM、约16mM-50mM、约17mM-50mM、约18mM-50mM、约19mM-50mM、约20mM-50mM、约25mM-50mM、约30mM-50mM、约35mM-50mM、约40mM-50mM或约45mM-50mM。

405.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-25mM、约0.1mM-25mM、约0.5mM-25mM、约1mM-25mM、约2mM-25mM、约3mM-25mM、约4mM-25mM、约5mM-25mM、约6mM-25mM、约7mM-25mM、约8mM-25mM、约9mM-25mM、约10mM-25mM、约11mM-25mM、约12mM-25mM、约13mM-25mM、约14mM-25mM、约15mM-25mM、约16mM-25mM、约17mM-25mM、约18mM-25mM、约19mM-25mM或约20mM-25mM。

406.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-15mM、约0.1mM-15mM、约0.5mM-15mM、约1mM-15mM、约2mM-15mM、约3mM-15mM、约4mM-15mM、约5mM-15mM、约6mM-15mM、约7mM-15mM、约8mM-15mM、约9mM-15mM、约10mM-15mM、约11mM-15mM、约12mM-15mM、约13mM-15mM或约14mM-15mM。

407.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM-10mM、约0.1mM-10mM、约0.5mM-10mM、约1mM-10mM、约2mM-10mM、约3mM-10mM、约4mM-10mM、约5mM-10mM、约6mM-10mM、约7mM-10mM、约8mM-10mM或约9mM-10mM。

408.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95或约100mM。

409.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约0.1mM、约0.2mM、约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约40mM或约50mM。

410.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约30mM。

411.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约25mM。

412.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约20mM。

413.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约15mM。

414.如段落387-402中任一项所述的方法，其中所述透析过滤缓冲液的浓度是约10mM。

415.如段落381-414中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含螯合剂。

416.如段落381-414中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含明矾螯合剂。

417.如段落381-414中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸盐(EDTA)、N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸(EDTA-OH)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、1,2-环己二胺-N,N,N',N'-四乙酸(CyDTA)、二亚乙基三胺-N,N,N',N",N"-五乙酸(DTPA)、1,3-二氨基丙-2-醇-N,N,N',N'-四乙酸(DPTA-OH)、乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯乙酸)(EDDHA)、乙二胺-N,N'-二丙酸二盐酸盐(EDDP)、乙二胺-四(亚甲基磺酸)(EDTPO)、次氮基三(亚甲基膦酸)(NTPO)、亚氨基二乙酸(IDA)、异亚硝基-二乙酸(HIDA)、次氮基三乙酸(NTP)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、二巯基丁二酸(DMSA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)、硫辛酸(ALA),次氮基三乙酸(NTA),呋喃硫胺(TTFD)、二巯基丙醇、青霉胺、去铁胺(DFOA)、地拉罗司、膦酸盐、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。

418.如段落381-414中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸盐(EDTA)、N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸(EDTA-OH)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、1,2-环己二胺-N,N,N',N'-四乙酸(CyDTA)、二亚乙基三胺-N,N,N',N",N"-五乙酸(DTPA),1,3-二氨基丙-2-醇-N,N,N',N'-四乙酸(DPTA-OH)、乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯乙酸)(EDDHA)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。

419.如段落381-414中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含作为螯合剂的乙二胺四乙酸盐(EDTA)。

420.如段落381-414中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含作为螯合剂的柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。

421.如段落381-414中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含作为螯合剂的柠檬酸钠。。

422.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是1-500mM。

423.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是2-400mM。

424.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-400mM。

425.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-200mM。

426.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-100mM。

427.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-50mM。

428.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是10-30mM。

429.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM,约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约45mM、约50mM,约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95或约100mM。

430.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM或约100mM。

431.如段落415-421中任一项所述的方法，其中所述替代溶液中的螯合剂浓度是约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM。

432.如段落387-431中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含盐。

433.如段落432所述的方法，其中所述盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠和其组合。

434.如段落432所述的方法，其中所述盐是氯化钠。

435.如段落432-434中任一项所述的方法，其中所述替代溶液包含氯化钠，其是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mM。

436.如段落381-435中任一项所述的方法，其中所述透析体积数是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50。

437.如段落381-435中任一项所述的方法，其中所述透析体积数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85,约90、约95或约100。

438.如段落381-435中任一项所述的方法，其中所述透析体积数是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。

439.如段落381-438中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。

440.如段落381-438中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。

441.如段落381-438中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在以下温度进行：约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃。

442.如段落381-438中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在约50℃的温度进行。

443.如段落359-438中任一项所述的方法，其中所述超滤和透析过滤步骤若都实施，则在约20℃-约90℃的温度进行。

444.如段落359-438中任一项所述的方法，其中所述超滤和透析过滤步骤若都实施，则在约35℃-约80℃的温度、在约40℃-约70℃的温度、在约45℃-约65℃的温度、在约50℃-约60℃的温度、在约50℃-约55℃的温度、在约45℃-约55℃的温度或在约45℃-约55℃的温度进行。

445.如段落359-438中任一项所述的方法，其中所述超滤和透析过滤步骤若都实施，则在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃,约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃,约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃,约52℃,约53℃,约54℃,约55℃,约56℃,约57℃,约58℃、约59℃,约60℃,约61℃,约62℃,约63℃,约64℃,约65℃,约66℃,约67℃,约68℃,约69℃,约70℃,约71℃,约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度进行。

446.如段落359-438中任一项所述的方法，其中所述超滤和透析过滤步骤若都实施，则在约50℃的温度进行。

447.如段落359-446中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液通过调整大小均一化。

448.如段落359-446中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液经受机械调整大小。

449.如段落359-446中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液经受高压均质剪切。

450.如段落359-446中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液经受化学水解。

451.如段落359-450中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液调整大小到靶分子量。

452.如段落359-451中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液调整大小到约5kDa-约4,000kDa的分子量。

453.如段落359-451中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液调整大小到约10kDa-约4,000kDa的分子量。

454.如段落359-451中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液调整大小到约50kDa-约4,000kDa的分子量。

455.如段落359-451中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液调整大小到分子量约50kDa-约3,500kDa；约50kDa-约3,000kDa；约50kDa-约2,500kDa；约50kDa-约2,000kDa；约50kDa-约1,750kDa；约50kDa-约1,500kDa；约50kDa-约1,250kDa；约50kDa-约1,000kDa；约50kDa-约750kDa；约50kDa-约500kDa；约100kDa-约4,000kDa；约100kDa-约3,500kDa；约100kDa-约3,000kDa；约100kDa-约2,500kDa；约100kDa-约2,250kDa；约100kDa-约2,000kDa；约100kDa-约1,750kDa；约100kDa-约1,500kDa；约100kDa-约1,250kDa；约100kDa-约1,000kDa；约100kDa-约750kDa；约100kDa-约500kDa；约200kDa-约4,000kDa；约200kDa-约3,500kDa；约200kDa-约3,000kDa；约200kDa-约2,500kDa；约200kDa-约2,250kDa；约200kDa-约2,000kDa；约200kDa-约1,750kDa；约200kDa-约1,500kDa；约200kDa-约1,250kDa；约200kDa-约1,000kDa；约200kDa-约750kDa；或约200kDa-约500kDa。在进一步的这类实施方案中，所述纯化多糖调整大小到分子量约250kDa-约3,500kDa；约250kDa-约3,000kDa；约250kDa-约2,500kDa；约250kDa-约2,000kDa；约250kDa-约1,750kDa；约250kDa-约1,500kDa；约250kDa-约1,250kDa；约250kDa-约1,000kDa；约250kDa-约750kDa；约250kDa-约500kDa；约300kDa-约4,000kDa；约300kDa-约3,500kDa；约300kDa-约3,000kDa；约300kDa-约2,500kDa；约300kDa-约2,250kDa；约300kDa-约2,000kDa；约300kDa-约1,750kDa；约300kDa-约1,500kDa；约300kDa-约1,250kDa；约300kDa-约1,000kDa；约300kDa-约750kDa；约300kDa-约500kDa；约500kDa-约4,000kDa；约500kDa-约3,500kDa；约500kDa-约3,000kDa；约500kDa-约2,500kDa；约500kDa-约2,250kDa；约500kDa-约2,000kDa；约500kDa-约1,750kDa；约500kDa-约1,500kDa；约500kDa-约1,250kDa；约500kDa-约1,000kDa；约500kDa-约750kDa；或约500kDa-约600kDa。

456.如段落359-451中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液调整大小到分子量约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa、约35kDa、约40kDa、约45kDa、约50kDa、约75kDa、约90kDa、约100kDa、约150kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约350kDa、约400kDa、约450kDa、约500kDa、约550kDa、约600kDa、约650kDa、约700kDa、约750kDa、约800kDa、约850kDa、约900kDa、约950kDa、约1000kDa、约1250kDa、约1500kDa、约1750kDa、约2000kDa、约2250kDa、约2500kDa、约2750kDa、约3000kDa、约3250kDa、约3500kDa、约3750kDa或约4,000kDa。

457.如段落1-456中任一项所述的方法，其中所述多糖纯化溶液无菌过滤。

458.如段落457所述的方法，其中所述无菌过滤是死端过滤。

459.如段落457所述的方法，其中所述无菌过滤是切向过滤。

460.如段落457-459中任一项所述的方法，其中所述滤器的标称的保留范围是约0.01-0.2微米、约0.05-0.2微米、约0.1-0.2微米或约0.15-0.2微米。

461.如段落457-459中任一项所述的方法，其中所述滤器的标称的保留范围是约0.05、约0.1、约0.15或约0.2微米。

462.如段落457-459中任一项所述的方法，其中所述滤器的标称的保留范围是约0.2微米。

463.如段落457-462中任一项所述的方法，其中所述滤器的过滤容积是约25-1500L/m²、50-1500L/m²、75-1500L/m²、100-1500L/m²、150-1500L/m²、200-1500L/m²、250-1500L/m²、300-1500L/m²、350-1500L/m²、400-1500L/m²、500-1500L/m²、750-1500L/m²、1000-1500L/m²或1250-1500L/m²。

464.如段落457-462中任一项所述的方法，其中所述滤器的过滤容积是约25-1000L/m²、50-1000L/m²、75-1000L/m²、100-1000L/m²、150-1000L/m²、200-1000L/m²、250-1000L/m²、300-1000L/m²、350-1000L/m²、400-1000L/m²、500-1000L/m²或750-1000L/m²。

465.如段落457-462中任一项所述的方法，其中所述滤器的过滤容积是25-500L/m²、50-500L/m²、75-500L/m²、100-500L/m²、150-500L/m²、200-500L/m²、250-500L/m²、300-500L/m²、350-500L/m²或400-500L/m²。

466.如段落457-462中任一项所述的方法，其中所述滤器的过滤容积是25-300L/m²、50-300L/m²、75-300L/m²、100-300L/m²、150-300L/m²、200-300L/m²或250-300L/m²。

467.如段落457-462中任一项所述的方法，其中所述滤器的过滤容积是25-250L/m²、50-250L/m²、75-250L/m²、100-250L/m²或150-250L/m²、200-250L/m²。

468.如段落457-462中任一项所述的方法，其中所述滤器的过滤容积是25-100L/m²、50-100L/m²或75-100L/m²。

469.如段落457-462中任一项所述的方法，其中所述滤器的过滤容积是约25、约50、约75、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400或约1500L/m²。

470.如段落1-469中任一项所述的方法，其中所述获得的纯化多糖是液体溶液。

471.如段落1-469中任一项所述的方法，其中所述获得的纯化多糖是干粉。

472.如段落1-469中任一项所述的方法，其中所述获得的纯化多糖溶液是冻干的。

473.如段落1-469或472中任一项所述的方法，其中所述获得的纯化多糖溶液是冷冻干燥的饼。

474.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是荚膜多糖、荚膜下多糖或脂多糖。

475.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是荚膜多糖。

476.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自金黄色葡萄球菌的荚膜多糖。

477.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自5型金黄色葡萄球菌的荚膜多糖。

478.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自8型金黄色葡萄球菌的荚膜多糖。

479.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自粪肠球菌的荚膜多糖。

480.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖。

481.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖。

482.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自A群脑膜炎奈瑟氏菌(MenA)、W135群脑膜炎奈瑟氏菌(MenW135)、Y群脑膜炎奈瑟氏菌(MenY)、X群脑膜炎奈瑟氏菌(MenX)或C群脑膜炎奈瑟氏菌(MenC)的荚膜多糖。

483.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌的荚膜多糖。

484.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自无乳链球菌(B族链球菌(GBS))的荚膜多糖。

485.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII型GBS的荚膜多糖。

486.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌菌株的荚膜多糖，所述菌株是致泻性大肠杆菌群(EEC群)的部分。

487.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌菌株的荚膜多糖，所述菌株是致泻性大肠杆菌群(EEC群)的部分，如大肠杆菌-肠毒素性(ETEC)、大肠杆菌-肠致病性(EPEC)、大肠杆菌-O157:H肠出血性(EHEC)或大肠杆菌-肠侵袭性(EIEC)。在一个实施方案中，所述细菌荚膜多糖来源是致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)。

488.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自以下血清型的大肠杆菌血清型的荚膜多糖：O157:H7、O26:H11、O111:H-和O103:H2。

489.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自来自选自以下血清型的大肠杆菌血清型的荚膜多糖：O6:K2:H1和O18:K1:H7。

490.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自以下血清型的大肠杆菌血清型的荚膜多糖：O45:K1、O17:K52:H18、O19:H34和O7:K1。

491.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型O104:H4的荚膜多糖。

492.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型O1:K12:H7的荚膜多糖。

493.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型O127:H6的荚膜多糖。

494.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型O139:H28的荚膜多糖。

495.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型O128:H2的荚膜多糖。

496.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌的荚膜多糖。

497.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自以下血清型的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23B、23F、24B、24F、29、31、33F、34、35B、35F、38、72和73。

498.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自以下血清型的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23B、23F、24F、29、31、33F、35B、35F、38、72和73。

499.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自以下血清型的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：8、10A、11A、12F、15B、22F和33F。

500.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型1的荚膜多糖。

501.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型2的荚膜多糖。

502.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型3的荚膜多糖。

503.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型4的荚膜多糖。

504.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型5的荚膜多糖。

505.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型6A的荚膜多糖。

506.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型6B的荚膜多糖。

507.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型6C的荚膜多糖。

508.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型7F的荚膜多糖。

509.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型8的荚膜多糖。

510.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型9V的荚膜多糖。

511.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型9N的荚膜多糖。

512.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型10A的荚膜多糖。

513.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型11A的荚膜多糖。

514.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型12F的荚膜多糖。

515.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型14的荚膜多糖。

516.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型15A的荚膜多糖。

517.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型15B的荚膜多糖。

518.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型15C的荚膜多糖。

519.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型16F的荚膜多糖。

520.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型17F的荚膜多糖。

521.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型18C的荚膜多糖。

522.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型19A的荚膜多糖。

523.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型19F的荚膜多糖。

524.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型20的荚膜多糖。

525.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型20A的荚膜多糖。

526.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型20B的荚膜多糖。

527.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型22F的荚膜多糖。

528.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型23A的荚膜多糖。

529.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型23B的荚膜多糖。

530.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型23F的荚膜多糖。

531.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型24B的荚膜多糖。

532.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型24F的荚膜多糖。

533.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型29的荚膜多糖。

534.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型31的荚膜多糖。

535.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型33F的荚膜多糖。

536.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型34的荚膜多糖。

537.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型35B的荚膜多糖。

538.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型35F的荚膜多糖。

539.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型38的荚膜多糖。

540.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型72的荚膜多糖。

541.如段落1-473中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型73的荚膜多糖。

542.一种通过段落1-541中任一项所述方法获得的纯化细菌多糖。

543.一种通过段落1-541中任一项所述方法可获得的纯化细菌多糖。

544.一种通过段落1-541中任一项所述方法获得的纯化细菌多糖，所述细菌多糖用作抗原。

545.一种通过段落1-541中任一项所述方法获得的纯化细菌多糖，所述细菌多糖缀合载体蛋白。

546.一种通过段落1-541中任一项所述方法获得的纯化细菌多糖，所述细菌多糖进一步缀合载体蛋白。

547.一种通过段落1-541中任一项所述方法获得的纯化细菌多糖的糖缀合物。

548.一种免疫原性组合物，所述组合物包含段落542-543中任一项所述的纯化多糖。

549.一种免疫原性组合物，所述组合物包含段落546-547中任一项所述的糖缀合物。

550.一种免疫原性组合物，所述组合物包含本文公开的任何糖缀合物。

551.一种免疫原性组合物，所述组合物包含本文所公开糖缀合物的任意组合。

如本文所用，术语“约”意味着在数值的统计学有意义范围内，如所示浓度范围、时间框架、分子量、温度或pH。这种范围能在一个数量级内，通常在给定值或范围的20％内，更通常在10％内，甚至更通常在5％或1％内。有时，这种范围能在用于测量和/或测定给定值或范围的标准方法典型的实验误差内。术语“约”涵盖的可允许变化取决于所研究特定系统，且能由本领域普通技术人员容易理解。当本申请列举范围时，该范围内的每一个数字被视作本公开实施方案。

本文术语“包含”(comprising、comprise和comprises)意在发明者可任选地用术语“基本由…组成”(consisting essentially of、consist essentially of和consistsessentially of)和“由…组成”(consisting of、consist of和consists of)在每一种情况中分别替代。

“免疫原性量”、“免疫学有效量”、“治疗有效量”、“预防有效量”或“剂量”各在本文中可互换使用，一般指足以引起免疫应答的抗原或免疫原性组合物的量，所述免疫应答是细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)应答或两者都有，如本领域技术人员已知的标准试验所测。

本文档的任何范围内的任意整数被视作本公开实施方案。

本专利说明书内引用的所有参考文献或专利申请通过引用纳入本文。

本发明通过所附实施例阐明。除非另有详细描述，下面的实施例用标准技术完成，其为本领域技术人员熟知且是常规的。实施例是阐述性的，而非限制本发明。

实施例

实施例1.肺炎球菌多糖血清型8的纯化

纯化的工艺流程图如图1所示。该工艺用NLS灭活发酵液开始(参见EP2129693)且包括回收单元操作(絮凝、离心和深层过滤)，然后是纯化单元操作(超滤和碳过滤)。

1.起始材料

所述工艺用NLS灭活的肺炎链球菌血清型8的发酵液开始。

培养物生长于Hy-Soy培养基。生长结束时(如光密度不再增加所示)，培养物用NLS灭活(参见EP2129693)。

2.絮凝

此步骤的主要目的是沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。其也有助于下游澄清单元操作。絮凝用通过加入NLS裂解的发酵液进行。

2.1pH和明矾的作用

进行实验以检测pH、明矾百分比和维持时间的作用。

预置量的发酵液等分到不同容器内，加入10％(w/w)明矾储液(用十二水硫酸铝钾和去离子水制备)至2％(w/v)的终浓度。

然后，pH调至所需水平。容器接着在多个维持时间点后以12,000g离心15分钟。测定上清的蛋白、多糖和净度。在2％明矾存在下在1、4和24小时的维持时间，pH对蛋白去除和净度的作用如图2所示。此数据显示在pH 2.5–4.0和2％明矾下的蛋白去除相当有效。大于80％的蛋白杂质在此单一步骤中去除。离心分离液(concrate)的净度受到pH和维持时间影响。图2显示pH 3.5产生最高的离心分离液净度。

明矾浓度和维持时间在pH 3.5对蛋白去除和离心分离液净度的作用如图3所示。维持时间研究在环境温度(20±2℃)进行。结果显示1.0％明矾对蛋白去除或离心分离液澄清都不足够。2％与3％明矾之间的差异不显著。

2.2温度的作用

经絮凝的发酵液(pH3.5和2％明矾)加热至50℃，维持30和60分钟。冷却至环境温度后，样品在12,000g离心。测量所述离心分离液净度与在环境温度进行絮凝的离心分离液比较。来自环境温度絮凝的离心分离液的OD600是0.99。50℃ 30分钟后，OD600减少到0.13，60分钟后，OD600进一步减少到0.04。这清楚证明离心分离液的净度可通过在较高温度絮凝而显著改善。

2.3影响絮凝的变量的作用

为更好定义影响血清型8絮凝过程的变量的作用，实施研究。我们检测了明矾浓度、pH、温度和维持时间对多糖回收、净度和杂质去除的系数(factor)。

指定量的明矾室温加入发酵液，随后用5N H₂SO₄或5N NaOH调节pH。样品置于设置所需温度的水浴，在各时间点，取样分析，随后12,000x g离心。分析上清的多糖浓度、蛋白和浊度(OD600)。

结果分析显示pH、明矾百分比和维持时间对于絮凝单元操作的合适性相当宽泛，pH:2.75–3.75；明矾:1.5–3.0％w/v；和维持时间:1.5–3小时。温度的所需范围是约45–60℃。

3.离心

实施离心以使离心分离液澄清，从而其能以合理容量过滤。离心速度设为12,000-xg。

4.深层过滤

尽管离心是主要的固体/液体分离单元操作，但其没有从进料流中去除所有颗粒，深层过滤单元操作纳入离心与第一超滤单元操作之间。

初始研究用标称的保留范围为0.25–1.0微米的滤器。离心分离液的净度对过滤容量有影响。

尤其是絮凝在约20℃进行时，离心分离液的净度不佳，OD600在0.8–1.4范围内且过滤容量受影响。使用更高温度的絮凝条件时，深层过滤工艺显示更稳健和恒定的容积，过滤容量超过400L/m²，即使离心分离液的OD600范围是0.04-0.2。

5.任选的0.45微米过滤

尽管是任选的，0.45微米滤器用于一些深层过滤后的样品。

6.超滤/透析过滤-(UFDF-1)

纯化起始于深层滤液(来自上面步骤4或5)。

此操作用缓冲液取代用过的发酵培养基，同时减少低分子量宿主细胞杂质和剩余絮凝剂(铝)的水平。

首次UFDF前，深层滤液用5N氢氧化钠调至7.0。或者，pH在UFDF透析过滤前未调节，透析过滤针对柠檬酸钠/磷酸钠，pH 7.0(如10mM磷酸盐/25mM柠檬酸盐pH 7.0)作为透析过滤缓冲液实施。

7.碳过滤

此单元操作降低宿主细胞杂质如蛋白和核酸以及有色杂质的水平(参见WO2008118752)。

研究通过炭过滤器去除蛋白杂质的效力。3个7”直径R32SP炭过滤器串联。来自UFDF-1的保留物以40LMH流速过滤，记录用于炭滤液的UV280。

保留物的UV280信号在炭过滤前仅为460-mAU，相较于水冲洗基线(380-mAU)非常低。这表明大部分蛋白相关杂质已通过之前的单元操作去除。然而，炭过滤器仍然非常有效地去除剩余残留杂质。这在滤器呈一排放置后于UV280信号减少中显示，其中UV信号降到基线。此数据表明蛋白相关杂质通过单次通过炭过滤器去除。

8.超滤/透析过滤-(UFDF-2)

此单元操作使产物浓缩到所需浓度并用对于缀合正确的缓冲液取代25mM柠檬酸钠、10mM磷酸钠，pH 7.0。此步骤用30-kDa分子量截取值滤器进行。

剩余柠檬酸盐的存在可能干扰缀合化学。不同溶液用作透析过滤缓冲液：50mMNaCl与水的组合，或25mM磷酸钠pH 6.0作为透析过滤缓冲液

评估25mM磷酸钠pH 6.0对柠檬酸盐去除的作用。此实验中，炭滤液浓缩2.6倍，随后用25mM磷酸钠pH 6.0进行透析过滤。移出样品并分析多个透析过滤点的剩余柠檬酸盐。

获得0.13的截留率。实现6-log的下降需要小于7个透析体积的25mM磷酸钠pH6.0。

9.一致性

为证明上述回收和纯化工艺能产生可重复结果，产生3个一致性批次。完整的发酵批次用上述工艺絮凝和离心。

3个一致性批次的步骤和总收率如表2所示。所有步骤收率为约77–99％，重现性和稳健性非常好。

表2用于血清型8一致性批次的步骤和总收率

3个一致性批次的分析结果如表3所示。3个一致性批次满足所有预定义的验收标准。

表3用于血清型8一致性批次的分析结果

实施例2.肺炎球菌多糖血清型33F的纯化

用于纯化肺炎球菌多糖33F的工艺流程图如图1所示。该工艺用NLS处理的发酵液开始且包括回收单元操作(絮凝、离心和深层过滤)，然后是纯化单元操作(超滤和碳过滤)。

1.起始材料

所述工艺用NLS灭活的肺炎链球菌血清型33F的发酵液开始。培养物生长于Hy-Soy培养基。生长结束时(如光密度不再增加所示)，培养物用NLS灭活(参见EP2129693)。

2.絮凝

此步骤的主要目的是沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。其也协助下游澄清单元操作。絮凝用通过加入NLS来裂解的发酵液进行。

2.1pH的作用

进行实验以检测pH的效果。

为确定血清型33F絮凝的最优pH，对失活33F发酵液进行酸滴定研究。来自研究的结果如图4所示。杂质去除vs.pH的图显示，最大杂质去除在/低于pH 3.5实现。

使用先前实验中鉴定的pH，实施明矾絮凝研究。来自研究的结果如图5所示。如OD600所测的沉淀速度在明矾浓度>1.0％时基本不变。最高杂质去除是在1.5％明矾处，尽管在1-3％明矾之间没有发现显著差异。滴定范围中没有显著多糖浓度变化。

2.2参数的作用

为确定添加明矾的速度作用，发酵批次分成2份，明矾储液在3分钟或60分钟内加入。对离心后净度或深层过滤容量没有显著影响。这表明明矾加入速度不是显著的工艺参数。

为进一步完善絮凝条件，设置实验设计(DOE)来检测明矾浓度、pH、温度和维持时间对多糖回收、净度及蛋白去除的作用。检测到的因数如表4所示。

表4 33F絮凝研究中检测的DOE因子

因子	范围
		明矾浓度(％w/v)	0-4
pH	2-5
		温度(℃)	20-60
维持时间(min)	30-90

多糖回收在所测条件下未受到显著影响，因为所有条件产生大于95％的回收。类似地，蛋白去除就所测全部条件而言高于90％。明矾浓度对净度影响最大，如OD600所测。在低明矾浓度下，OD600增加。随着温度下降和pH上升，净度略有增加。

为确定絮凝条件对澄清单元操作的效果，对在50℃絮凝的发酵液进行连续离心研究。

如在20℃絮凝的发酵液所观察，对于50℃絮凝的发酵液，进料速度为400-1200mL/min的离心分离液净度没有显著增加。然而，离心分离液净度和深层过滤容量相较于20℃絮凝显著提高。使用新絮凝条件，深层过滤容量高于400L/m²。

为确认絮凝温度从20℃增加到50℃是否改善离心分离液净度和因而的深层过滤容量(见下)，测量离心分离液净度和深层过滤容量(参见表5)。

表5絮凝温度对离心分离液和深层滤液净度的影响

絮凝温度	离心分离液OD600	深层滤液OD600
			20℃	0.060	0.025
50℃	0.031	0.016

3.离心

4.深层过滤

尽管离心是主要的固体/液体分离单元操作，但是其没有从进料流中去除所有颗粒，深层过滤单元操作纳入离心与第一超滤单元操作之间。

5.任选的0.45微米过滤

尽管是任选的，0.45微米滤器用于一些深层过滤后的样品。

6.超滤/透析过滤-(UFDF-1)

纯化起始于深层滤液(来自上面步骤4或5)。

初始实验中，深层滤液的pH用5N氢氧化钠从3.5调至7.0。尽管这不影响多糖分子量，但其确实在33F上引起O-酰基的部分脱乙酰作用。

有建议认为脱乙酰作用归因于5N氢氧化钠中和期间产生的高局部pH。因此，决定在浓缩深层滤液至易控制体积后的透析过滤期间调节33F的pH。

透析过滤用柠檬酸钠/磷酸钠,pH 7.0(如10mM磷酸盐/25mM柠檬酸盐pH 7.0)进行。

或者，25mM EDTA也能用于取代柠檬酸盐。

7.碳过滤

炭过滤步骤能以单次通过模式或再循环模式进行。为确定哪种操作模式对于血清型33F是最好的，进行再循环炭过滤研究。此实验中，来自UFDF-1的保留物经2个170LMH的连续47mm Cuno R32SP盘(总面积5cm²)过滤，且在每个循环(共5个循环)后测定杂质水平。杂质去除在～30L/m²的最低进料挑战时最佳。高于1个循环的额外杂质去除不显著，表明用再循环模式的益处很少或没有。

8.任选的0.2微米过滤

尽管是任选的，0.2微米滤器用于一些炭过滤后的样品。

9.超滤/透析过滤-(UFDF-2)

此单元操作使产物浓缩到所需浓度并用就缀合而言正确的缓冲液取代25mM柠檬酸钠、10mM磷酸钠,pH 7.0。此步骤用30-kDa分子量截取值滤器进行。

剩余柠檬酸盐的存在可能干扰缀合化学。为大幅降低柠檬酸盐水平，用不同缓冲液进行透析过滤实验。

这些实验中，炭滤液浓缩4倍，随后用不同缓冲液透析过滤。去除样品并分析剩余柠檬酸盐。

水具有50％的最高截留率且实现目标下降需要约22个透析体积。

10mM磷酸钠pH 7.0和10mM磷酸钾pH 6.5都有约20％的相似截留率，实现6-log的目标下降需要10个透析体积。

25mM氯化钠具有8％的最低截留率且实现目标下降需要7个透析体积。氯化钠浓度减少到10mM可引起截留率上升到28％。

为确保达到剩余柠檬酸盐水平，氯化钠浓度增加到50mM。6个透析体积的50mM氯化钠后，保留物针对水再用6个透析体积进行透析过滤。

10.无菌过滤

填充到贮藏瓶前的终单元操作是无菌过滤(0.2微米过滤)。

11.一致性

为证明上述回收和纯化工艺能产生可重复结果，产生3个一致性批次。发酵批次用上述工艺絮凝和离心。

3个一致性批次的步骤和总收率如表6所示。所有步骤收率为约90％或更高，重现性非常好。总收率均值是73％。

表6用于血清型33F一致性批次的步骤和总收率

3个一致性批次的分析结果如表3所示。3个一致性批次满足所有预定义验收标准。

3个一致性批次的分析结果如表7所示。

表7用于33F一致性批次的分析结果(20℃絮凝)

试验	001	002	003
				O-乙酰化	0.87	0.85	0.90
剩余柠檬酸盐	<LOQ	<LOQ	<LOQ
				剩余NLS	<LOQ	<LOQ	<LOQ
剩余核酸	<0.02％	<0.02％	<0.04％
				剩余蛋白	0.2％	0.2％	0.3％
剩余C poly	4.4wt％	4.2wt％	4.7wt％
				剩余Al	<1ppm	<1ppm	<1ppm

2个更多批次用同一过程生产，除了絮凝在50℃进行，而不是20℃。来自这些批次的分析结果以及来自一致性批次的平均结果如表8所示。这些结果显示增加絮凝温度对产品质量没有任何影响。

表8 33F在50℃絮凝的分析结果

Assay	50℃-1	50℃-2
			O-乙酰化	1.03	1.04
剩余柠檬酸盐	<LOQ	<LOQ
			剩余NLS	<LOQ	<LOQ
剩余核酸	0.02％	0.02％
			剩余蛋白	0.2％	0.2％
剩余C poly	4.1	3.2
			总收率	68％	57％

实施例3.肺炎球菌多糖血清型15B的纯化

用于纯化肺炎球菌多糖15B的工艺流程图如图1所示。该工艺以NLS处理的发酵液开始且包括回收单元操作(絮凝、离心和深层过滤)，然后是纯化单元操作(超滤和碳过滤)。

1.起始材料

所述工艺以NLS灭活的肺炎链球菌血清型15B的发酵液开始。培养物生长于Hy-Soy培养基。生长结束时(如光密度不再增加所示)，培养物用NLS灭活(参见EP2129693)。

2.絮凝

与实施例1和2类似，进行实验以检测不同参数对絮凝的影响。

影响变量是pH、明矾百分比和维持时间。

此数据显示在pH 2.5–4.0和1-3％明矾的蛋白去除非常有效，超过90％蛋白杂质在此单一步骤中去除。杂质去除的效率不受维持时间(1、4或24小时)影响。

为确认就15B开发的絮凝条件，进行DOE研究以检测明矾浓度、pH和维持时间对多糖回收、净度及杂质去除的效果。pH、明矾百分比和维持时间的因子范围分别是：2–4、0–4％w/v和1–4小时。

此DOE研究的实验数据如表9所示。在设计空间内共进行20次实验。

表9

结果提示在设计空间内，pH、明矾百分比和维持时间就絮凝单元操作而言的合适性相当宽泛，pH:2.7–3.8；明矾:1–2.5％(w/v)；和维持时间:1.5–3小时。在其他血清型的DOE研究中观察到类似结果。

上述实验在20℃进行。

为进一步确定絮凝条件对澄清单元操作的效果，对在50℃絮凝的发酵液进行连续离心研究。

如在20℃絮凝的发酵液所观察，就50℃絮凝的发酵液而言，进料速度为400-800mL/min的离心分离液净度没有显著增加。

3.离心

4.深层过滤

5.任选的0.45微米过滤

尽管是任选的，但0.45微米滤器用于一些深层过滤后的样品。

6.超滤/透析过滤-(UFDF-1)

纯化起始于深层滤液(来自上面步骤4或5)。

初始实验中，深层滤液的pH用5N氢氧化钠从3.5调至7.0。然而，这可能引起15B上O-酰基的部分脱乙酰作用。

因此，决定在浓缩深层滤液至易控制体积后的透析过滤期间调节15B的pH。

在用于15B的缓冲液选择研究中，测试10–50mM的柠檬酸盐浓度，和不同磷酸钠浓度。

透析过滤针对柠檬酸钠/磷酸钠,pH 7.0(如10mM磷酸盐/25mM柠檬酸盐pH 7.0)进行。

7.碳过滤

3个7”直径Cuno R32SP炭过滤器串联使用。来自UFDF-1的保留物首先绕过滤器，从而记录280nm的UV信号用于起始溶液。保留物以32LMH流速过滤后，记录用于炭滤液的UV280并与保留物作比较。UV280信号下降约95％证明蛋白相关杂质通过单次通过过炭过滤器去除。

炭过滤步骤能以单次通过模式或再循环模式进行。为确定穿过炭的添加是否为血清型15B加入任何益处，完成实验，其中来自UFDF-1的保留物经3个64LMH的7寸Cuno R32SP盘系列过滤。在每次穿过后测定杂质水平、UV280水平和Borate Lowry蛋白试验。结果显示单次通过足以去除大部分杂质。单次通过滤液和第二通道滤液的蛋白浓度分别是25.2和20.6μg/mL。将冲洗滤器引起的稀释分解因子时，第一通道滤液和第二通道滤液的蛋白量大致相同。

8.超滤/透析过滤-(UFDF-2)

此单元操作使产物浓缩到所需浓度并用就缀合而言正确的缓冲液取代25mM柠檬酸钠,10mM磷酸钠,pH 7.0。此步骤用30-kDa分子量截取值滤器进行。

剩余柠檬酸盐的存在可能干扰缀合化学。为大幅降低柠檬酸盐水平，用不同缓冲液进行透析过滤实验(参见实施例1和2)。

9.均一化

纯化的15B多糖能均一化，例如机械调整大小(参见例如WO2015110942)。

10.无菌过滤

填充到贮藏瓶前的终单元操作是无菌过滤(0.2微米过滤)。

11.一致性

3个一致性批次的步骤和总收率如表10所示。所有步骤收率为约75-98％，重现性和稳健性非常好。总收率均值是60％。

表10用于血清型15B一致性批次的步骤和总收率

3个一致性批次的分析结果如表11所示。3个一致性批次满足所有预定义验收标准。

3个一致性批次的分析结果如表11所示。

表11用于15B一致性批次的分析结果

测试	15B-001	15B-002	15B-003
				O-乙酰化	0.94	0.88	0.87
甘油	0.97	0.92	0.93
				剩余柠檬酸盐	<LOQ	<LOQ	<LOQ
剩余NLS	<LOQ	<LOQ	<LOQ
				剩余核酸	<0.12	<0.13	<0.13
剩余蛋白	0.2％	0.2％	0.2％
				剩余C poly	1.5％	1.8％	1.8％
剩余Al	<0.05ppm	<0.05ppm	<0.05ppm

表12 50℃批次比较

试验	50℃-1	50℃-2
			O-乙酰化	0.94	0.94
剩余柠檬酸盐	<LOQ	<LOQ
			剩余NLS	<LOQ	<LOQ
剩余核酸	<0.02	N/A
			剩余蛋白	N/A	N/A
剩余C poly	1.0％	0.9％
			总收率	43％	N/A

实施例4.肺炎球菌多糖血清型22F的纯化

用于纯化肺炎球菌多糖22F的工艺流程图如图1所示。该工艺以NLS灭活发酵液开始且包括回收单元操作(絮凝、离心和深层过滤)，然后是纯化单元操作(超滤和碳过滤)。

1.起始材料

所述工艺以肺炎链球菌血清型22F的NLS灭活发酵液开始。培养物生长于Hy-Soy培养基。生长结束时(如光密度不再增加所示)，培养物用NLS处理(参见EP2129693)。

2.絮凝

2.1pH和明矾的作用

此数据显示在pH 2.5–4.0和1.5-3％明矾的蛋白去除非常有效，超过90％蛋白杂质在此单一步骤中去除。

为确认就22F开发的絮凝条件，进行DOE研究以检测明矾浓度和pH对多糖回收、净度及杂质去除的效果。

蛋白去除效率在降低的pH下极高。明矾与pH的组合有效。

2.2温度的作用

进行研究以检测温度对絮凝发酵液粒径的效果。在20℃絮凝(2％w/v明矾,pH3.5)后，絮凝发酵液加热至所需温度并保持1小时。冷却到环境温度(15-25℃)后，絮凝发酵液在12,000-xg离心并测定净度(OD600)。

结果示于表13。

表13.絮凝粒径和离心分离液OD在多个温度的结果

离心分离液OD600在升高的温度显著降低。

先前的实验观察到絮凝发酵液粒径在高温下较大。显示粒径随絮凝温度变化的视觉比较如图6所示。对于第一次实验，絮凝温度维持室温(RT)，而第二次实验增加到45℃，持续1小时。

图6中，室温和45℃加热1小时后的絮凝发酵液平均粒径分别是9.8μm和65μm。加热至45℃的絮凝发酵液粒径增加显著。除了粒径更大，细粒(<1μm)的量也减少。大颗粒形成和细粒减少有助于进一步的步骤(如离心和深层过滤)，产生更清澈的离心分离液。

生产2个额外22F批次，其中变化仅为絮凝温度(20℃或50℃)。离心分离液净度(离心后)和来自这些批次的后深层过滤(见下)如表14所示。

表14.絮凝温度对离心分离液和深层滤液净度的影响

批次	离心分离液OD600	深层滤液OD600
			1(20℃)	0.09	0.024
2(50℃)	0.04	0.016

3.离心

4.深层过滤

5.任选的0.45微米过滤

尽管是任选的，0.45微米滤器用于一些深层过滤后的样品。

6.超滤/透析过滤-(UFDF-1)

纯化起始于深层滤液(来自上面步骤4或5)。

进行碳过滤前，22F多糖的pH调至7.0±0.5。如上所示，用NaOH调节pH能引起O-酰基的部分脱乙酰作用。由于22F多糖也包含O-乙酰基，决定在浓缩深层滤液至易控制体积后的透析过滤期间调节22F溶液的pH。

在用于血清型22F的缓冲液选择研究中，测试0–40mM的柠檬酸盐浓度，和不同磷酸钠浓度。

当柠檬酸盐浓度高于20mM且磷酸盐浓度为10mM或更低时，获得最高透析过滤通量。

7.碳过滤

UFDF1保留物经3或4个连续堆积的7”直径R32SP炭过滤器过滤。进行一系列实验以测量R32SP炭过滤器对去除剩余UV和来自UFDF1保留物的RI杂质的效力。UV260/280nm吸光度有至少95％下降。这指示明显去除来自UFDF1保留物的蛋白和核酸相关杂质。结果显示碳具有去除蛋白相关杂质的良好能力。

8.超滤/透析过滤-(UFDF-2)

9.均一化

纯化的22F多糖能均一化，例如机械调整大小(参见例如WO2015110942)。

10.无菌过滤

填充到贮藏瓶前的终单元操作是无菌过滤(0.2微米过滤)。

11.一致性

为证明上述回收和纯化工艺能产生可重复结果，产生3个一致性批次(絮凝温度20℃)。发酵批次用上述工艺絮凝和离心。

3个一致性批次的步骤和总收率如表14所示。所有步骤收率为约90％或更高，重现性非常好。总收率均值是58％。

表14.用于22F多糖一致性批次的步骤和总收率

¹01和03未均一化

3个一致性批次的分析结果如表15所示。

表15用于22F一致性批次的分析结果

2个更多批次用同一过程生产，除了絮凝在50℃进行，而不是20℃。来自这些批次的分析结果以及来自一致性批次的平均结果如表16所示。这些结果清楚显示增加絮凝温度对产品质量没有任何影响。

表16. 50℃Demo与一致性批次的比较

¹该批次未就剩余NLS分析

实施例5.肺炎球菌多糖血清型10A的纯化

用于纯化肺炎球菌多糖10A的工艺流程图如图1所示。该工艺以NLS灭活发酵液开始且包括回收单元操作(絮凝、离心和深层过滤)，然后是纯化单元操作(超滤和碳过滤)。

1.原料

所述工艺开始于肺炎链球菌血清型10A的NLS灭活发酵液。培养物生长于Hy-Soy培养基。生长结束时(如光密度不再增加所示)，培养物用NLS处理(参见EP2129693)。

2.絮凝

血清型10A絮凝的最优pH通过DOE测定(参见例如实施例1和3)。

基于预测打谱器(Prediction Profiler)，合适性几乎在pH 3.5和2％明矾处于最优。还显示pH略低于3.5会有助于微小改善蛋白去除和离心分离液净度，多糖收率略有减少，但同时峰值纯度可能稍高。

关于其他血清型的开发工作显示在絮凝期间增加温度使得深层过滤容量更高。然而，加热发酵液可能对多糖分子量产生影响。实验在10A上完成以确定高温是否引起分子量减少。第一次实验中，絮凝发酵液在20、50、60和70℃的温度孵育，维持时间是1、4和22小时。仅来自4小时维持时间的各温度样品进行纯化。所有样品显示相同1H-NMR谱，然而，60℃和70℃样品显示分子量显著下降。第二次实验中，絮凝发酵液在20、35、45和55℃的温度孵育，维持时间是1、2和4小时，所有样品进行纯化。此研究显示对于45℃多至4小时而言，分子量变化极小。在55℃暴露第一小时可观察到分子量略降，但差异在试验误差范围内。

3.离心

4.深层过滤

5.任选的0.45微米过滤

尽管是任选的，0.45微米滤器用于一些深层过滤后的样品。

6.超滤/透析过滤-(UFDF-1)

纯化起始于深层滤液(来自上面步骤4或5)。

进行碳过滤前，22F多糖的pH调至7.0±0.5。

透析过滤初始用10mM磷酸钠pH 7.0进行。这成功调节pH至所需值。然而，在仅使用磷酸钠的透析过滤期间，形成白色沉淀。分离白色固体并测定为包含磷酸铝。磷酸铝在中性pH不溶于水，其由于絮凝步骤后存在的剩余铝而形成。为防止磷酸铝形成，决定向透析过滤缓冲液加入螯合剂。根据关于其他血清型柠檬酸钠的工作进行选择。高于10mM的柠檬酸盐浓度对防止随着时间雾状形成有效。25mM的柠檬酸盐浓度显示去除残留铝至小于1ppm。

7.碳过滤

UFDF1保留物经R32SP盘炭过滤器过滤。结果显示碳具有去除蛋白相关杂质的良好能力。

8.超滤/透析过滤-(UFDF-2)

9.无菌过滤

填充到贮藏瓶前的终单元操作是无菌过滤(0.2微米过滤)。

10.一致性

为证明上述回收和纯化工艺能产生可重复结果，产生3个一致性批次(絮凝温度45℃)。发酵批次用上述工艺絮凝和离心。

3个一致性批次的步骤和总收率如表17所示。所有步骤收率高于72％，重现性非常好。总收率均值是68％。

表17用于10A一致性批次的步骤和总收率

单元操作	10A-001	10A-002	10A-003
				发酵液	NA	NA	NA
离心分离液	100	100	100
				深层滤液	100	100	99
UFDF1保留物	91	93	97
				炭滤液	80	76	72
UFDF2保留物	98	89	99
				终过滤	99	99	99
总收率	71	63	69

3个一致性批次的分析结果如表18所示。

表18用于10A一致性批次的分析结果

试验	10A-001	10A-002	10A-003
				剩余柠檬酸盐	<LOQ	<LOQ	<LOQ
剩余NLS	<LOQ	<LOQ	<LOQ
				剩余核酸	<0.15％	<0.11％	<0.21％
剩余蛋白	0.5％	0.4％	0.4％
				剩余C poly	5.0wt％	4.9wt％	4.4wt％
剩余Al	<0.05ppm	<0.05ppm	<0.05ppm

实施例6.肺炎球菌多糖血清型11A的纯化

用于纯化肺炎球菌多糖11A的工艺流程图如图1所示。该工艺以NLS灭活发酵液开始且包括回收单元操作(絮凝、离心和深层过滤)，然后是纯化单元操作(超滤和碳过滤)。

1.起始材料

所述工艺开始于肺炎链球菌血清型11A的NLS灭活发酵液。培养物生长于Hy-Soy培养基。生长结束时(如光密度不再增加所示)，培养物用NLS处理(参见EP2129693)。

2.絮凝

先前关于其他血清型纯化工艺的工作显示澄清单元操作受溶液pH和所加入明矾浓度影响。为理解这些因素对血清型11A絮凝的影响，进行DOE研究，该研究包括对絮凝过程有影响的另一因素–絮凝时间。

各参数的范围如表19所列。

表19用于血清型11A絮凝DOE研究的参数范围

范围	低	高
			pH	2	5
明矾浓度	0％	4％
			时间	15分钟	105分钟

实施这3个参数变化的一系列20个实验。

絮凝过程期间各变量(明矾浓度、pH和絮凝时间)与响应(PS回收、OD600和蛋白去除)之间的关系通过预测打谱器分析。最不重要的变量是絮凝时间，当明矾浓度和pH设置为中点时，絮凝时间对蛋白去除或净度几乎没有影响且对多糖回收影响很小。明矾浓度主要影响净度。最优明矾浓度是约2.5％，这产生最佳净度。尽管当明矾浓度为1.5％-3％时，OD600差异较小。另一方面，絮凝pH主要影响蛋白去除，pH越低，蛋白去除越高。在pH 3.5和更低时，实现最大杂质去除。

设计额外实验以确定增加絮凝温度是否甚至改善下游操作。

为确定温度对血清型11A絮凝的影响，在3个不同温度进行实验。除了温度，检测絮凝期间的2个不同搅拌速度。11A发酵液用2％明矾、pH 3.5在不同温度絮凝1小时。絮凝后，发酵液离心并测量离心分离液净度。离心分离液随后经深层滤器过滤，测定过滤容量。实验条件和结果如表20所示。深层滤液经0.45um死端过滤器进一步过滤，使用Vmax模型。

4种条件下的深层过滤容量没有差异，全部都高于400L/m²。然而，0.45微米Vmax结果有显著差异。50℃絮凝的Vmax为～1300L/m²，比其他条件高约8倍。类似地，10℃絮凝具有最低Vmax。

表20不同温度和搅拌速度下的血清型11A絮凝

	实验1	实验2	实验3	实验4
					温度	20℃	50℃	10℃	20℃
搅拌速度	214rpm	214rpm	214rpm	321rpm
					OD600	0.064	0.055	0.062	0.056
深层过滤容量	>400L/m<sup>2</sup>	>400L/m<sup>2</sup>	>400L/m<sup>2</sup>	>400L/m<sup>2</sup>
					0.45微米Vmax	177L/m<sup>2</sup>	1367L/m<sup>2</sup>	146L/m<sup>2</sup>	171L/m<sup>2</sup>

关于高温絮凝的潜在担忧是高温对11A分子结构和分子量的影响。血清型11A具有3个O-乙酰基和1个经磷酸连接多糖重复单元的甘油基。所有这些基团可能在低pH和高温下于絮凝期间切掉。高温对分子的其他影响是对分子量的影响。此条件(pH 3.5)下的絮凝期间，较长多糖链可降解成较短链，这能引起分子量更低。我们的实验显示产物与室温絮凝后纯化的初始11A相同(参见表24)。

3.离心

4.深层过滤

为确定发酵液维持时间对深层过滤容量的影响，来自用2％明矾和pH 3.5在20℃絮凝的离心分离液于2-8℃维持多至3天。然后，离心分离液用深层滤器过滤并测定过滤容量。深层过滤容量在2天维持中没有显著差异(表21)。

表21发酵液维持时间对过滤容量的影响

时间	Day 0	Day 1	Day 2
				过滤容量(L/m<sup>2</sup>)	193	185	243

5.任选的0.45微米过滤

尽管是任选的，0.45微米滤器用于一些深层过滤后的样品。

6.超滤/透析过滤-(UFDF-1)

纯化起始于深层滤液(来自上面步骤4或5)。

在关于其他血清型的开发工作中(见上)，发现10mM磷酸钠,25mM柠檬酸钠,pH7.0是用于UF/DF工艺的良好缓冲液。磷酸盐缓冲液用于调节pH至中性。柠檬酸盐缓冲液用作螯合剂以去除铝。

7.碳过滤

8.超滤/透析过滤-(UFDF-2)

9.均一化

纯化的11A多糖能均一化，例如机械调整大小(参见例如WO2015110942)。

10.无菌过滤

填充到贮藏瓶前的终单元操作是无菌过滤(0.2微米过滤)。

11.一致性

为证明上述回收和纯化工艺能产生可重复结果，产生3个一致性批次(絮凝温度20_℃)。发酵批次用上述工艺絮凝和离心。

3个一致性批次的步骤和总收率如表17所示。

表22用于11A一致性批次的步骤和总收率

单元操作	11A-001	11A-002	11A-003
				发酵液	NA	NA	NA
离心分离液	100	100	100
				深层滤液	89	89	92
UFDF1保留物	99	98	98
				炭滤液	91	89	94
UFDF2保留物	95	98	56<sup>1</sup>
				均一化	99.9	96.7	91.6
总收率	78	77	48

¹开阀引起的产品损失

3个一致性批次的分析结果如表23所示。

表23用于11A一致性批次的分析结果

在不同温度进行絮凝。絮凝之一在50℃进行，此材料的一部分用上述工艺纯化。来自此纯化的分析结果以及来自一致性批次的平均结果如表24所示。这些结果清楚显示增加絮凝温度对产品质量没有影响。

表24. 50℃Demo与一致性批次的比较

实施例7.肺炎球菌多糖血清型12F的纯化

用于纯化肺炎球菌多糖12F的工艺流程图如图1所示。该工艺以NLS灭活发酵液开始且包括回收单元操作(絮凝、离心和深层过滤)，然后是纯化单元操作(超滤和碳过滤)。

均一化步骤是任选的。

1.起始材料

所述工艺开始于肺炎链球菌血清型12F的NLS灭活发酵液。培养物生长于Hy-Soy培养基。生长结束时(如光密度不再增加所示)，培养物用NLS处理(参见EP2129693)。

2.絮凝

先前关于其他血清型纯化工艺的工作显示澄清单元操作受溶液pH和所加入明矾浓度影响，但不来自絮凝搅拌时间。为理解这些因素对血清型12F絮凝的影响，进行DOE研究。

各参数范围列于表25。

表25用于血清型12F絮凝DOE研究的参数范围

范围	低	高
			pH	2	5
明矾浓度	0％	4％
			时间	30分钟	90分钟

实施这3个参数变化的一系列16个实验(室温)。

絮凝过程期间各变量(明矾浓度、pH和絮凝时间)与反应(PS回收、OD600和蛋白去除)之间的关系通过预测刻画器分析。最不重要的变量是絮凝时间，当明矾浓度和pH设置为中点时，絮凝时间对蛋白去除或多糖回收几乎没有影响且对净度影响很小。

明矾浓度主要影响净度。最优明矾浓度是约2.7％，这产生最佳净度。尽管当明矾浓度为1.5％-3.5％时，OD600差异较小。明矾浓度对多糖回收有一些影响。当其增加至约4％时，多糖回收略低。另一方面，絮凝pH主要影响蛋白去除，pH越低，蛋白去除越高。在pH3.5和更低时，实现最大杂质去除。

关于其他血清型的工作显示增加在絮凝期间增加温度使得深层过滤容量更高。絮凝温度增加到50℃时，离心分离液净度大幅增加(OD600从0.338(20℃)减少到0.073(50℃))且过滤容量增加超过8倍。当高温用于絮凝时，粒径急剧变化到大粒径范围，这随后使得离心更容易。

也进行其他实验以理解絮凝温度对絮凝过程的影响。血清型12F发酵液用2％明矾,pH 3.5在2个不同温度絮凝1小时。絮凝后，发酵液离心并测量离心分离液净度(OD600)。离心分离液随后经深层滤器过滤以测定过滤容量。深层滤液经0.45um死端过滤器进一步过滤，使用Vmax模型。来自这些实验的结果如表26所示。

表26不同温度下的血清型12F絮凝

从表26可见，当50℃用作絮凝温度时，OD600较低。所有条件下的深层过滤容量没有差异，因为全部没有达到过滤容量。然而，0.45um Vmax数据仍显示高温絮凝好许多。

3.离心

4.深层过滤

5.任选的0.45微米过滤

尽管是任选的，0.45微米滤器用于一些深层过滤后的样品。

6.超滤/透析过滤-(UFDF-1)

纯化起始于深层滤液(来自上面步骤4或5)。

7.碳过滤

UFDF1保留物经R32SP盘炭过滤器过滤。结果显示碳具有去除蛋白相关杂质的良好能力且来自碳过滤的产物回收很好。

就一些样品进行碳过滤后0.2μm过滤(可选)。

8.超滤/透析过滤-(UFDF-2)

9.无菌过滤

填充到贮藏瓶前的终单元操作是无菌过滤(0.2微米过滤)。

10.一致性

3个一致性批次的步骤和总收率如表27所示。

表27用于12F一致性批次的步骤和总收率

单元操作	12F-001	12F-002	12F-003
				发酵液	NA	NA	NA
离心分离液	100	100	100
				深层滤液	89	88	91
UFDF1保留物	97	97	96
				炭滤液	83	86	82
UFDF2保留物	93	94	94
				终过滤	94	99	96
总收率	63	67	65

3个一致性批次的分析结果如表28所示。

表28用于12F一致性批次的分析结果

试验	11A-001	11A-002	11A-003
				剩余柠檬酸盐	<LOQ	<LOQ	<LOQ
剩余NLS	<LOQ	<LOQ	<LOQ
				剩余核酸(w:w)	<0.03％	<0.03％	<0.03％
剩余蛋白(w:w)	0.5％	0.5％	0.5％
				剩余C poly	0.6wt％	0.5wt％	0.6wt％
剩余Al	5ppm	6ppm	6ppm

实施例8.金黄色葡萄球菌Cp5和Cp8多糖的纯化

此实施例描述用于分离金黄色葡萄球菌5型(Cp5)和8型(Cp8)荚膜多糖的纯化工艺。

1.起始材料

用于纯化工艺的起始材料是全细胞(未裂解)的金黄色葡萄球菌发酵收获物。

2.酸水解

金黄色葡萄球菌收获后，全细胞发酵液通过加入强酸(如硫酸)调至酸性pH，加热，然后孵育一段时间(参见WO2011041003)。水解后，发酵液冷却，接着通过加入氢氧化钠溶液来中和。

3.絮凝

絮凝如下进行：将10％(w/v)水性明矾(磷酸钠铝)溶液加入冷却的(20–30℃)中性发酵液(上述步骤2的)，搅拌，产生溶于发酵液的终2％(w/v)明矾溶液。发酵液通过加入氢氧化钠溶液(1–10N)中和(pH 6.9–7.1)。中和后，经絮凝的发酵液室温孵育至少10分钟，然后经微滤澄清。

4.发酵液澄清(微滤或离心)

絮凝发酵液通过切向流微滤澄清，采用0.2μm孔径中空纤维膜。此澄清的所需产物是来自浓缩和透析过滤阶段的渗透液；保留物最终弃去。发酵液在恒定通量条件下浓缩约4倍，剪切率为4000-8000s^-1。浓缩后，恒定体积透析过滤(5个透析体积)用去离子水进行。透析过滤还在恒定通量条件下实施。

透析过滤后，来自浓缩和透析过滤阶段的合并渗透液用作下一操作的进料。

5.超滤/透析过滤-(UFDF-1)

微滤渗透液用中空纤维切向流超滤膜浓缩和透析过滤。保留物作为产物收集；渗透液作为废物弃去。进料(微滤渗透液)浓缩约8-15倍。浓缩后，保留物用至少10个透析体积的125mM磷酸钠,pH 7.5缓冲液透析过滤。

透析过滤后，保留物通过从滤器装置流出来回收。

或者，离心也能用作澄清方法以分离絮凝发酵液中沉淀的细胞碎片与液体。上清随之可通过后续碳过滤步骤加工。

6.碳过滤

透析过滤保留物接着用碳过滤进行过滤。对于Cp5纯化和Cp8纯化，使用CunoR32SP级炭过滤器。保留物经单次通过操作的炭过滤器进料。炭滤液作为产物收集。产物过滤后，炭用125mM磷酸钠(pH 7.5)缓冲液冲洗。此冲洗液与产物滤液合并，进入高碘酸盐氧化。

7.高碘酸盐氧化

合并的炭滤液和滤器冲洗液接着经历与高碘酸盐的氧化反应。室温下，将1.0M高碘酸溶液加入来自先前纯化步骤的炭滤液/冲洗液(产生50mM终浓度的高碘酸盐)。此反应混合物室温孵育30分钟。然后，向反应混合物加入摩尔过量的丙二醇以淬灭反应。淬灭后，反应产物通过加入氢氧化钠中和(pH 6.9–7.1)。反应产物溶液随后进入终超滤/透析过滤操作。

8.超滤/透析过滤-(UFDF-2)

高碘酸盐氧化产物混合物通过中空纤维切向流超滤膜方式浓缩和透析过滤。材料在恒定TMP条件和恒定剪切率下浓缩2-4倍(到约4–8g/L Cp5/Cp8)。其次，保留物用至少10个透析体积的DI水透析过滤(恒定体积)。

透析过滤后，回收保留物，滤器接着用最小体积的DI水冲洗。冲洗液流尽并用保留物收集；合并的材料随后无菌过滤。

9.无菌过滤

合并的保留物和冲洗液经适当调整大小的死端无菌级滤器(0.2μm孔)过滤到无菌容器内。然后，此滤液在4℃保存。

本说明书提及的所有出版物和专利申请指示本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用纳入本文，程度就如同各单独出版物或专利申请特定和个别指示通过引用纳入。

尽管前述发明通过说明和实施例方式部分详细描述以用于清晰理解目的，可在所附权利要求范围内实施某些变化和修改。

Claims

2.如权利要求1所述的方法，其中絮凝剂包含选自铝、铁、钙和镁的多价阳离子。

3.如权利要求1所述的方法，其中絮凝剂包含选自以下的物质：明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、聚乙烯亚胺(PEI)、铝酸钠和硅酸钠。

4.如权利要求1所述的方法，其中絮凝剂选自明矾(如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化羟铝、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(II)(硫酸亚铁)、氯化铁(III)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚DADMAC、铝酸钠和硅酸钠。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中絮凝剂浓度是约0.1-约20％(w/v)。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述溶液维持一些时间以允许絮状物在下游加工前沉淀。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述絮凝步骤在酸性pH进行。

8.如权利要求6-7中任一项所述的方法，其中沉淀步骤，若存在，在约4℃-约30℃的温度进行。

9.如权利要求6-7中任一项所述的方法，其中沉淀步骤，若存在，在约30℃-约95℃的温度进行。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中絮凝后，通过倾析、沉积、过滤或离心使悬液澄清。

11.如权利要求10所述的方法，其中过滤含有多糖的溶液。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述过滤是深层过滤。

13.如权利要求11-12中任一项所述的方法，其中对滤液进行微滤。

14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中通过超滤和透析过滤进一步处理滤液。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述超滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。

16.如权利要求14-15中任一项所述的方法，其中替代溶液包含螯合剂。

17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。

18.如权利要求10-17中任一项所述的方法，其中通过活性炭过滤步骤处理所述含有多糖的溶液。

19.如权利要求18所述的方法，其中对所述滤液进行微滤。

20.如权利要求18-19中任一项所述的方法，其中通过超滤和透析过滤使所述滤液进一步澄清。

21.如权利要求20所述的方法，其中替代溶液包含螯合剂。

22.如权利要求20-21中任一项所述的方法，其中所述透析过滤步骤在约20℃-约90℃的温度进行。

23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中通过调整大小使所述多糖的纯化溶液均一化。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中将所述多糖的纯化溶液进行无菌过滤。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖是荚膜多糖。

26.一种通过权利要求1-25中任一项所述的方法获得的纯化的细菌多糖的糖缀合物。

27.一种包含权利要求26所述的糖缀合物的免疫原性组合物。