CN113727711A - 用于治疗肾脏疾病的新化合物及其药物组合物 - Google Patents

用于治疗肾脏疾病的新化合物及其药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开根据式I的化合物：其中R1同文中定义的。本发明涉及化合物，其生产方法、包含其的药物组合物，以及利用其的治疗方法，用于预防和/或治疗施用本发明化合物可用于预防和/或治疗的多囊肾病(PKD)。
Figure DDA0003316469280000011

Description

用于治疗肾脏疾病的新化合物及其药物组合物
发明领域
本发明涉及可用于预防和/或治疗多囊肾病(PKD)的化合物。本发明还提供生产本发明化合物的方法、包含本发明化合物的药物组合物、通过施用本发明化合物用于预防和/或治疗多囊肾病(PKD)的方法。
发明背景
多囊肾病(PKD)的特征是肾小管起源的充满液体的囊肿大量增大，损害正常肾实质并导致肾功能衰竭。人类常染色体显性PKD(ADPKD)是PKD的一种常见形式，由两个基因PKD1和PKD2中的一个突变引起，这两个基因分别编码相互作用的蛋白多囊蛋白-1和多囊蛋白-2，并且ADPKD是最常见的遗传性肾囊性疾病。(Torres、Harris和Pirson 2007)
在PKD发展过程中，肾总体积呈指数级增加，形成囊肿，而肾功能则相反地下降，特别是肾小球滤过率(GFR)。这会逐渐导致酸尿、肾结石形成、疼痛、血压升高，并最终通过动脉瘤或心功能不全导致死亡。(Torres、Harris和Pirson 2007)
此外，囊肿可能破裂导致感染；通常难以治疗，并且经常需要长时间的抗生素治疗，这可导致抗生素耐药。
最近，已经确定囊肿的发展可能需要通过囊性纤维化跨膜传导调节器(CFTR)进行氯离子转运，其中CFTR可能负责产生和维持充满液体的囊肿。(Yang等人，2008)因此，抑制CFTR会防止或减少囊肿的形成和/或生长。
迄今，还没有治愈的方法，并且只有一种食品药品监督管理局(FDA)批准的PKD治疗方法。此外，目前的治疗重点是管理疾病引起的并发症(Torres 2010)，例如降压药的施用和疾病后期的透析；然而，在最后阶段，肾移植仍然是唯一的选择。据估计，ADPKD的患病率为千分之一，仅在美国就有600,000人受到影响，其中每年约有2144名患者开始接受肾脏替代治疗。(Torres、Harris和Pirson 2007)
此外，还发现抑制CFTR可使腹泻病患者受益，因为肠毒素引起的肠内液体分泌过多会激活肠细胞上的管腔Cl-通道。(Thiagarajah和Verkman 2012)
因此，目前的治疗方法并不令人满意，仍然需要预防和/或治疗PKD的新药物。
发明简述
本发明涉及可用于预防和/或治疗多囊肾病(PKD)，更特别是常染色体显性多囊肾病(ADPKD)的化合物。本发明还提供生产本发明化合物的方法、包含本发明化合物的药物组合物、通过施用本发明化合物预防和/或治疗多囊肾病(PKD)的方法。
因此，在本发明的第一方面中，提供根据式(I)的本发明化合物，其用于预防和/或治疗多囊肾病：
Figure BDA0003316469260000021
其中R1是H或–CH3
在一更具体的方面，提供了本发明化合物，其用于预防和/或治疗多囊肾病(PKD)，并且更特别是常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。
令人惊讶地，尽管本发明化合物在CF患者中具有CFTR调节活性，特别是蛋白质折叠和运输活性(WO 2017/060874)，但出乎预料地发现它们抑制野生型CFTR(非CF疾病的)，因此可以防止和/或减少囊肿的形成和/或生长，特别是在PKD和/或卵巢囊肿中。
另一方面，本发明提供用于预防和/或治疗PKD的药物组合物，其包含本发明化合物和药用载体、赋形剂或稀释剂。在一特定方面，药物组合物可另外包含适于与本发明化合物组合使用的其他治疗活性成分。在一更具体的方面，其他治疗活性成分是用于治疗PKD的物质。
此外，根据制备和使用，可用于本文公开的药物组合物和治疗方法的本发明化合物在药学上是可接受的。
在本发明的另一方面，本发明提供治疗患有选自本文所列病症中的病症并特别是PKD的哺乳动物特别是人，该方法包括施用有效量的本文所述的本发明药物组合物或化合物。
本发明还提供包含本发明化合物，以及用于医药的适当药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在一特定方面，该药物组合物用于预防和/或治疗PKD。
在其他方面，本发明提供了合成本发明化合物的方法，本文后面公开了代表性合成方案和途径。
通过考虑随后的详细描述，其他目的和优点对本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1以箱形图显示与溶媒(DMSO)相比，10μM的受试化合物Cpd 1和Cpd 2作用8天后，3D人囊肿生长试验中囊肿大小(囊肿面积，μm2)的分布，其中从下到上的方框表示数据点的25％百分位值、中值和75％百分位值，底须(whisker)代表10％的百分位数，而顶须代表90％的百分位数。
图2显示与溶媒(DMSO)相比，在(3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM和10μM)下，受试化合物Cpd 1(实心圆)和Cpd 2(实心三角形)作用8天后，3D人囊肿生长试验中囊肿数量的浓度依赖性减少。标准偏差用棒图表示，以便更好地显示。
图3以箱形图显示与溶媒(DMSO)相比，3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM和10μM的Cpd 1作用8天后，3D人囊肿生长试验中囊肿大小(囊肿面积，μm2)的分布，其中从下到上的方框表示数据点的25％百分位值、中值和75％百分位值，底须代表10％的百分位数，而顶须代表90％的百分位数。
图4以箱形图显示与溶媒(DMSO)相比，3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM和10μM的Cpd 2作用8天后，3D人囊肿生长试验中囊肿大小(囊肿面积，μm2)的分布，其中从下到上的方框表示数据点的25％百分位值、中值和75％百分位值，底须代表10％的百分位数，而顶须代表90％的百分位数。
发明详述
定义
以下术语旨在具有下文所给出的含义，并且有助于理解本发明的描述和预期范围。
在描述本发明时，本发明可包括化合物、含有所述化合物的药物组合物以及使用所述化合物和组合物的方法，除非另外说明，否则以下术语(如果存在)具有下述含义。还应当理解：当本文描述时，下文定义的任何部分(moieties)可被多种取代基取代，并且各自的定义旨在包括下文提出的范围内的此类取代的部分。除非另外说明，术语“取代的”的定义如下所示。还应当理解：当在本文中使用时，可以认为术语“基团”和“基”是可互换的。
冠词“一个”("a"和"an")可在文中用于指一个或多于一个(即至少一个)冠词的语法对象。举例来说，“一个类似物”指一个类似物或多于一个类似物。
“药学上可接受的”是指联邦或州政府监管机构或美国以外国家的相应机构批准的或可批准的，或者美国药典或其他公认药典中列出的用于动物，并特别是用于人的。
“药学上可接受的盐”系指本发明化合物的盐，其是药学上可接受的且具有所需的母体化合物的药理活性。具体而言，所述盐是无毒的，可为无机或有机酸加成盐和碱加成盐。尤其是，所述盐包括：(1)酸加成盐，用无机酸形成的，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有机酸形成的，所述有机酸例如乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚酸、3-苯丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代时形成的盐；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡萄糖胺等)配位形成的盐。盐还包括(仅作为示例)钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；以及当化合物包含碱性官能团时，无毒有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“药学上可接受的阳离子”指可接受的酸性官能团的阳离子反离子。所述阳离子以钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵阳离子等为例。
“药学上可接受的溶媒”指用于施用本发明化合物的稀释剂、辅料、赋形剂或载体。
“前药”是指化合物，包括本发明化合物的衍生物，其具有可裂解基团并通过溶剂解或在生理条件下成为在体内具有药学活性的本发明化合物。所述实例包括但不限于胆碱酯衍生物等、N-烷基吗啉酯等。
“溶剂合物”指通常通过溶剂解反应与溶剂缔合的化合物形式。该物理缔合包括氢键。常规溶剂包括水、EtOH、乙酸等。本发明化合物可以例如以结晶形式制备，并且可以是溶剂化或水合的。适当的溶剂合物包括药学上可接受的溶剂合物，例如水合物，并且进一步包括化学计量溶剂合物和非化学计量溶剂合物。在某些情况下，溶剂合物将能够分离，例如，当一个或多个溶剂分子并入晶体固体的晶格中时。“溶剂合物”包括溶液相和可分离溶剂合物。代表性溶剂合物包括水合物、乙醇合物和甲醇合物。
“个体”包括人。术语“人”、“患者”和“个体”在文中互换使用。
“有效量”是指当施用至个体用于治疗疾病时，足以对疾病产生治疗效果的本发明化合物的量。“有效量”可因化合物、疾病及其严重程度、以及要治疗的个体的年龄、体重等而异。
“预防”或“防止”是指降低获得或发展疾病或病患的风险(即，在可暴露于致病剂的个体中，或在发病前易患疾病的个体中，致使疾病的至少一种临床症状没有发展)。
“预防(‘prophylaxis’)”一词与“预防”相关，并且是指旨在预防而不是治疗或治愈疾病的措施或程序。预防措施的非限制性示例可包括接种疫苗；对因例如固定等原因而有血栓形成风险的医院患者施用低分子肝素；以及在访问疟疾流行或感染疟疾风险高的地理区域之前，施用氯喹等抗疟疾药物。
术语“代谢物”是指摄入本发明化合物或其药物组合物后在个体体内形成的化合物。代谢物可在从身体排出之前进一步代谢，例如在尿液或胆汁中。代谢物可保留与原始药物相似或不同的药理活性，从而有助于本发明化合物的整体治疗活性。代谢物可通过各种反应形成，所述反应包括氧化(例如通过细胞色素P450)、还原、水解、水合、肝微粒体酶系统中的结合(例如与硫酸盐、甘氨酸和/或葡萄糖醛酸)、缩合和/或异构化。
在一实施方案中，“治疗”任何疾病或病患是指减轻疾病或病患(即，阻止该疾病或减少其至少一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一实施方案中，“治疗”是指改善至少一个身体参数，这可能是个体无法识别的。还在另一实施方案中，“治疗”是指在身体上(例如可识别症状的稳定化)、生理上(例如身体参数的稳定)或在两者上调控疾病或病患。在另一实施方案中，“治疗”涉及延缓疾病的进程。
如本文所用，术语多囊肾病(PKD)是指肾小管变得结构异常，导致肾内多个囊肿发生和生长的一组病症。具体地讲，所述术语指常染色体显性多囊肾病(ADPKD)和常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)。更具体地讲，所述术语指常染色体显性多囊肾病。
“本发明化合物”和等效表达意指包含如本文所述的式(e)化合物，所述表达包括药学上可接受的盐和溶剂合物，例如水合物，以及药学上可接受的盐的溶剂合物(当上下文允许时)。类似地，提及中间体时，无论它们本身是否要求保护，都意味着包括它们的盐和溶剂合物(在上下文允许的情况下)。
当本文提及范围时，例如但不限于C1-8烷基，范围的引用应视为表示所述范围的每个成员。
本发明化合物的其他衍生物在其酸和酸衍生物形式中均具有活性，但在酸敏感形式中通常具有溶解性、组织相容性或在哺乳动物生物体中延迟释放的优点(Bundgaard1985)。前药包括本领域从业人员熟知的酸衍生物，例如通过母体酸与合适的醇反应制备的酯或者通过母体酸化合物与取代的或未取代的胺或酸酐或混合酸酐反应制备的酰胺。由本发明化合物上的酸性基团衍生的简单脂肪族或芳香族酯、酰胺和酸酐是特别有用的前药。在某些情况下，希望制备双酯型前药，例如(酰氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。具体的所述前药为本发明化合物的C1-8烷基、C2-8烯基、C6-10任选取代的芳基和(C6-10芳基)-(C1-4烷基)酯。
本公开书包括本文提供的本发明化合物的所有同位素形式，无论是形式(i)，其中给定原子序数的所有原子具有在自然界中占主导地位的质量数(或质量数的混合物)(本文称为“天然同位素形式”)，或形式(ii)，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但质量数不同于自然界中占主导地位的原子质量数的原子所取代(本文称为“非天然变体同位素形式”)。据了解，原子可以自然地以质量数的混合物存在。术语“非天然变体同位素形式”还包括下述实施方案，其中相对于天然存在的比例，具有在自然界中不太常见的质量数的给定原子序数的原子比例(在本文中称为“不常见同位素”)已经增加，例如增加至所述原子序数的原子数的>20％、>50％、>75％、>90％、>95％或>99％水平(将后一实施方案称为“同位素富集变体形式”)。术语“非天然变体同位素形式”还包括相对于天然存在的比例，不常见同位素的比例降低的实施方案。同位素形式可包括放射性形式(即它们包含放射性同位素)和非放射性形式。放射性形式通常是同位素富集的变体形式。
因此，化合物的非天然变体同位素形式可在一个或多个原子中包含一种或多种人工或不常见同位素，如氘(2H或D)、碳-11(11C)、碳-13(13C)、碳-14(14C)、氮-13(13N)、氮-15(15N)、氧-15(15O)、氧-17(17O)、氧-18(18O)、磷-32(32P)、硫-35(35S)、氯-36(36Cl)、氯-37(37Cl)、氟-18(18F)、碘-123(123I)、碘-125(125I)，或者与自然界中占主导地位的比例相比，在一个或多个原子中可包含增加比例的所述同位素。
可将包含放射性同位素的非天然变体同位素形式例如用于药物和/或底物组织分布研究。鉴于放射性同位素氚(即3H)和碳-14(即14C)易于引入且易于检测，因此对于该目的特别有用。引入氘(即2H或D)的非天然变体同位素形式可提供因更大的代谢稳定性而产生的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或减少的剂量需求，因此在某些情况下会是优选的。此外，可以制备引入正电子发射同位素(例如11C、18F、15O和13N)的非天然变体同位素形式，并且将在正电子发射断层显像(PET)研究中用于检查底物受体占有率。
还应理解：将具有相同分子式但其原子键合的性质或顺序或其原子的空间排列不同的化合物称为“异构体”。原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。
将互相不为镜像的立体异构体称为“非对映体”，将互为不可重叠的镜像的立体异构体称为“对映体”。当化合物有不对称中心时，例如它与四个不同的基团键合，一对对映体是可能的。对映体可通过其不对称中心的绝对构型来表征，并通过Cahn和Prelog的R-和S-顺序规则来描述，或通过分子旋转偏振光平面的方式来描述并指定为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)异构体)。手性化合物可以作为单个对映体或其混合物存在。含有相等比例的对映体的混合物称为“外消旋混合物”。
“互变异构体”是指特定化合物结构的可互换形式，并且氢原子和电子位移变化的化合物。因此，通过π电子和原子(通常是H)的移动，两种结构可处于平衡状态。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为它们通过酸或碱的处理而迅速相互转化。互变异构的另一个示例是苯基硝基甲烷的酸式-和硝基形式，它们同样由酸或碱处理形成。
互变异构形式可与获得所关注化合物的最佳化学反应性和生物活性有关。
本发明化合物可具有一个或多个不对称中心；因此，所述化合物可作为单独的(R)-或(S)-立体异构体或其混合物生产。
除非另外说明，说明书和权利要求书中对特定化合物的描述或命名旨在包括单个对映体及其混合物、其外消旋体或其他。立体化学测定和立体异构体分离的方法在本领域是众所周知的。
应该理解，本发明化合物可经代谢而产生生物活性代谢物。
本发明
本发明涉及可用于预防和/或治疗多囊肾病(PKD)的化合物。本发明还提供生产本发明化合物的方法、包含本发明化合物的药物组合物、通过施用本发明化合物预防和/或治疗PKD的方法。
因此，在本发明的第一方面，提供根据式(I)的本发明化合物，其用于预防和/或治疗PKD：
Figure BDA0003316469260000081
其中R1是H或–CH3。
在一实施方案中，本发明化合物如式I所示，其中R1是H。
在一实施方案中，本发明化合物如式I所示，其中R1是–CH3。
在一实施方案中，以天然同位素形式提供本发明化合物。
在一实施方案中，以非天然变体同位素形式提供本发明化合物。在一特定实施方案中，非天然变体同位素形式是其中在本发明化合物的一个或多个原子中在化学结构中指定的氢处掺入氘(即2H或D)的形式。在一实施方案中，本发明化合物的原子为非放射性同位素形式的。在一实施方案中，本发明化合物的一个或多个原子是放射性同位素形式的。适当地，放射性同位素是稳定同位素。适当地，非天然变体同位素形式是药学上可接受的形式。
在一实施方案中，提供了本发明化合物，其中该化合物的单个原子以非天然变体同位素形式存在。在另一个实施方案中，提供本发明化合物，其中两个或更多个原子以非天然变体同位素形式存在。
非天然同位素变体形式通常可通过本领域技术人员已知的常规技术或本文所述的方法来制备，例如，类似于所附实施例中所述的用于制备天然同位素形式的方法。因此，可以通过利用适当的同位素变体(或标记的)试剂代替示例性实施例中所用的正常试剂制备非天然同位素变体形式。
在一个方面中，根据本文所述任一实施方案的本发明化合物作为游离碱存在。
在一个方面中，根据本文所述任一实施方案中的本发明化合物是药学上可接受的盐。
在一个方面中，根据本文所述任一实施方案中的本发明化合物是化合物的溶剂合物。
在一个方面中，根据本文所述任一实施方案中的本发明化合物是化合物的药学上可接受盐的溶剂合物。
在另一个方面中，可将本发明化合物代谢。在一特定方面，本发明化合物的代谢物可由本发明化合物的氧化、还原、水解、水合、肝微粒体酶系统中的结合、缩合和/或异构化产生。在一特定方面，本发明化合物的代谢物可由本发明化合物的氧化和与葡萄糖醛酸的缀合产生。在一最具体的方面，代谢物选自M2、O-去甲基化M2、M2-葡糖苷酸、M3、Cpd 2(M4)和O-去甲基化M4：
Figure BDA0003316469260000091
虽然每个实施方案的指定基团通常已在上文中单独列出，但本发明化合物包括一种化合物，其中对于每个变量，文中给出的上述结构式和其他结构式中的几个或每个实施方案选自分别指定的具体成员或基团中的一个或多个。因此，本发明旨在包括其范围内的所述实施方案的所有组合。
虽然每个实施方案的指定基团通常已在上文单独列出，但本发明化合物可以是一个或多个变量(例如R基团)选自根据上文所列任何式(e)的一个或多个实施方案。因此，本发明旨在包括其范围内任何公开的实施方案的变量的所有组合。
或者，本发明还考虑从一组或实施方案或其组合中排除一个或多个指定变量。
在某些方面，本发明提供了根据上式的化合物的前药和衍生物。前药是本发明化合物的衍生物，其具有代谢可裂解基团，并通过溶剂解或在生理条件下成为本发明化合物，其在体内是药学活性的。所述示例包括但不限于胆碱酯衍生物等、N-烷基吗啉酯等。
本发明化合物的其他衍生物的酸和酸衍生物形式均具有活性，但酸敏感形式通常具有溶解性、组织相容性或在哺乳动物有机体中延迟释放的优点。(Bundgaard 1985)前药包括本领域技术人员熟知的酸衍生物，例如通过母体酸与合适的醇反应制备的酯，或通过母体酸化合物与取代或未取代的胺、酸酐或混合酸酐反应制备的酰胺。由本发明化合物上的酸性基团衍生的简单脂肪族或芳香族酯、酰胺和酸酐是优选的前药。在某些情况下，希望制备双酯型前药，例如(酰氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。特别有用的是本发明化合物的C1-C8烷基、C2-C8烯基、芳基、C7-C12取代芳基和C7-C12芳基烷基酯。
药物组合物
当用作药物时，通常将本发明化合物以药物组合物的形式施用。所述组合物可以以药学领域众所周知的方式制备，并包含至少一种根据式I的本发明活性化合物。通常，将本发明化合物以药学有效量施用。实际施用的本发明化合物的量通常由医生根据相关情况确定，所述情况包括要治疗的病症，选择的施用途径，实际施用的本发明化合物，个体患者的年龄、体重和反应，患者症状的严重程度等。
可将本发明的药物组合物通过多种途径施用，包括口服、直肠、经皮、皮下、关节内、静脉内、肌肉内和鼻内施用。根据预期的递送途径，优选将本发明化合物配制为可注射或口服组合物，或作为药膏、洗剂或贴剂，全部用于经皮施用。
用于口服施用的组合物可以采取散装液体溶液剂或混悬剂或散装粉剂的形式。然而，更常见的是，将所述组合物以单位剂型提供，以利于准确给药。术语“单位剂型”是指适合作为人类个体和其他哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位包含计算的以产生所需的治疗效果的预定量的活性物质，以及合适的药用赋形剂、溶媒或载体。典型的单位剂型包括液体组合物的预填充、预测量的安瓿或注射器，或固体组合物情况下的丸剂、片剂、胶囊剂等。在所述组合物中，根据式I的本发明化合物通常为少量组分(大约0.1重量％至约50重量％或者优选大约1重量％至约40重量％)，其余为各种溶媒或载体，以及有助于形成所需剂型的加工助剂。
适于口服施用的液体形式可包括适当的水性或非水性溶媒，具有缓冲剂、助悬剂和分配剂、着色剂、矫味剂等。固体形式可包括例如下述成分中的任何一种或类似性质的本发明化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；润滑剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者是矫味剂，例如薄荷或橘子矫味剂。
可注射组合物通常基于本领域已知的可注射无菌盐水或磷酸盐缓冲液或其他可注射载体。如前所述，所述组合物中根据式I的本发明活性化合物通常为少量组分，通常是大约0.05～10重量％，其余为可注射载体等。
通常将透皮组合物配制为含有活性成分的局部软膏剂或乳膏剂，其量通常为大约0.01～大约20重量％，优选大约0.1～大约20重量％，优选大约0.1～大约10重量％，且更优选大约0.5～大约15重量％。当配制成软膏剂时，活性成分通常与石蜡或水溶性软膏基质组合。或者，可以将活性成分用例如水包油乳膏基质配制成乳膏剂。所述经皮制剂在本领域是众所周知的，并且通常包括用于增强活性成分或制剂稳定性的经皮渗透的附加成分。所有此类已知经皮制剂和成分均包括在本发明范围内。
也可将本发明化合物通过经皮装置施用。因此，透皮施用可以利用储库或多孔膜型或固体基质类型的贴剂来完成。
上述可用于口服施用、注射或局部施用组合物的组分仅是代表性的。其他材料以及加工技术等见《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第8部分，1985年第17版，Mack Publishing Company，伊斯顿市，宾夕法尼亚州，将其引入文中作为参考。(Remington和Gennaro 1985)
也可将本发明化合物以缓释形式施用或从缓释药物递送系统施用。代表性缓释材料的描述可在《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)中找到。
下述制剂示例说明可根据本发明制备的代表性药物组合物。然而，本发明不限于下述药物组合物。
制剂1–片剂
可将根据式I的本发明化合物作为干粉与干明胶粘合剂以大约1:2的重量比混合。可添加少量硬脂酸镁作为润滑剂。该混合物可在压片机中形成240-270mg片剂(每片80-90mg根据式I的本发明活性化合物)。
制剂2–胶囊剂
根据式I的本发明化合物可作为干粉与淀粉稀释剂以大约1:1的重量比混合。可将该混合物填充到250mg胶囊中(每胶囊125mg根据式I的本发明活性化合物)。
制剂3–液体制剂
可将根据式I的本发明化合物(125mg)与蔗糖(1.75g)和黄原胶(4mg)混合，并且可将所得混合物混合，过10目U.S.筛，然后与先前制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠(11:89，50mg)水溶液混合。可将苯甲酸钠(10mg)、矫味剂和着色剂用水稀释并在搅拌下加入。然后，可在搅拌下加入足够的水。然后，可再加入足够的水，以使总体积达到5毫升。
制剂4–片剂
可将根据式I的本发明化合物作为干粉与干明胶粘合剂以大约1:2的重量比混合。可添加少量硬脂酸镁作为润滑剂。可将所述混合物在压片机中压成450-900mg片剂(150-300mg根据式I的本发明活性化合物)。
制剂5–注射剂
可将根据式I的本发明化合物溶解或悬浮在无菌缓冲盐水可注射水介质中，浓度大约为5mg/mL。
制剂6–局部的
可在大约75℃下熔化硬脂醇(250g)和白色凡士林(250g)，然后将溶于水中(大约370g)的根据式I的本发明化合物(50g)、对羟基苯甲酸甲酯(0.25g)、对羟基苯甲酸丙酯(0.15g)、十二烷基硫酸钠(10g)和丙二醇(120g)的混合物加入，并将所得混合物搅拌，直到其凝结。
治疗方法
在一个实施方案中，本发明提供用于预防和/或治疗多囊肾病(PKD)的本发明化合物或包含本发明化合物的药物组合物。在一特定实施方案中，PKD为常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。
在另一实施方案中，本发明提供本发明化合物或包含本发明化合物的药物组合物，其用于制备预防和/或治疗PKD的药物。在一特定实施方案中，PKD为常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。
在其他治疗方法方面，本发明提供预防和/或治疗患有PKD的哺乳动物的方法，所述方法包括施用有效量的用于治疗或预防所述病症的本发明化合物或本文所述的一种或多种药物组合物。在一特定实施方案中，PKD为常染色体显性多囊肾病(ADPKD)
在一实施方案中，本发明提供包含本发明化合物和另外的治疗物质的药物组合物。在一特定实施方案中，另外的治疗物质为PKD治疗物质。在一特定实施方案中，PKD为常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。
注射剂量水平为大约0.1mg/kg/h至至少10mg/kg/h，均持续大约1h至大约120h，尤其是持续24h至96h。也可施用大约0.1mg/kg至大约10mg/kg或更大的预载剂量，以达到足够的稳态水平。对于40至80kg的人类患者，最大总剂量预期不会超过大约1g/天。
为了预防和/或治疗长期病症，例如退行性病症，治疗方案通常持续数月或数年，因此为了患者的方便和耐受性，首选口服施用。口服施用时，每天一到四(1～4)次常规剂量，尤其是每天一到三(1～3)次常规剂量，通常每天一到两(1～2)次常规剂量，并且最通常是每天一(1)次常规剂量是代表性方案。或者，对于长效药物，口服施用，两周一次、每周一次和每天一次是代表性方案。具体地讲，剂量方案可以是每1～14天，更特别是1～10天，甚至更特别是1～7天，并且最特别是1～3天。
利用所述施用方式，每个剂量提供大约1mg至大约1000mg本发明化合物，每个特定剂量提供大约10mg至大约500mg，并尤其是大约30mg至大约250mg。
通常选择透皮施用，以提供与使用注射剂量获得的相似或更低的血药浓度。
当用于预防病症发作时，通常根据医生的建议并在医生的监督下，将本发明化合物以上述剂量水平施用至有患病症风险的患者。具有患特定病症风险的患者通常包括有该病症家族史的患者，或通过基因测试或筛查确定特别易患该病症的患者。
可将本发明化合物作为唯一活性物质施用，或可将其与其他治疗物质联合施用，包括证明具有相同或类似治疗活性且确定对所述联合施用安全且有效的本发明其他化合物。在一特定实施方案中，两种(或更多种)物质的共同施用保证显著更低的待使用的每种物质的剂量，从而降低副作用的出现。
在一实施方案中，将本发明化合物或包含本发明化合物的药物组合物作为药物施用。在一特定实施方案中，所述药物组合物另外包含其它活性成分。
在一实施方案中，将本发明化合物与用于治疗和/或预防与PKD相关的疾病的其它治疗物质共同施用，特定物质包括但不限于血管加压素受体拮抗剂，特别是血管加压素-2受体拮抗剂(托伐普坦、利伐普坦)、普伐他汀、万格司他(venglustat)，博舒替尼、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如贝那普利、佐芬普利、培哚普利、群多普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利或雷米普利)、二甲双胍、八肽(奥曲肽)、环肽(兰瑞肽)、microRNA的短寡核苷酸抑制剂(抗miR)(例如抗-miR17(RGLS4326)(Lee等人，2019))和血管紧张素II受体阻滞剂(ARBs)(例如氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦(fimasartan)和阿齐沙坦)。在一特定实施方案中，其他治疗物质选自托伐普坦和二甲双胍。在另一特定实施方案中，其它特定物质是RGLS4326。
作为相同治疗方案的一部分，对于联合施用，包括向患者递送两种或更多种治疗物质的任何方式，这对于技术人员来说是显而易见的。虽然两种或两种以上物质可在单一制剂(即作为单一药物组合物)中同时施用，但这不是必需的。可将所述物质用不同剂型且在不同时间施用。
简称
简称 定义
ADPKD 常染色体显性多囊肾病
CAS# 美国化学会编号
CFTR 囊性纤维化跨膜传导调节因子
CF 囊性纤维化
DBU 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯CAS#6674-22-2
DMSO 二甲基亚砜
HEPES 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸–CAS#7365-45-9
LCMS 液相色谱-质谱联用
LiHMDS 双(三甲基硅基)氨基锂(CAS#4039-32-1)
MeCN 乙腈
mg 毫克
equiv 当量
h 小时
equiv 当量
min 分钟
min 分钟
mL 毫升
mmol 毫摩尔
μL 微升
μm 微米
μm<sup>2</sup> 平方微米
RT 室温
N 正常
g 克
nM 纳摩尔的
PKD 多囊肾病
wt CFTR 野生型CFTR
TECC 经皮钳位电路
THF 四氢呋喃
化学合成方法
通用
可根据WO 2017/060874公开的，制备本发明化合物。
具体地讲，Cpd 1作为Cpd 381，描述于WO 2017/060874的687页；Cpd 2(M4)作为Cpd 629,描述于WO 2017/060874的758页；M3作为Cpd 630，描述于WO 2017/060874的758页。
M2作为Cpd 892，描述于WO 2017/060873的655页；O-去甲基M2作为Cpd 898，描述于WO 2017/060873的656页。
实施例1.示例性合成
Figure BDA0003316469260000161
1.1.步骤i：环丁基-3-氧代-丙腈
将1升4颈圆底烧瓶装配2个滴液漏斗和仪器顶部的隔板。将整个系统在真空下火焰干燥(热枪)10分钟，然后在正氮气流(气球)下冷却至RT。在正氮气流下调整低温温度计，然后利用正氮气流将1N LiHMDS的THF溶液(468.0mL，468.0mmol，1.5当量)经套管引入烧瓶中。如温度计所确认，将溶液冷却至-78℃(干冰/丙酮冷却槽)。通过注射器将干燥的MeCN(24.4mL，468.0mmol，1.5当量)添加到第一个滴液漏斗中，然后滴加(历经20分钟)到反应混合物中。加完后，将混合物在-78℃下搅拌1小时。此时，将环丁烷羧酸乙酯(CAS#14924-53-9，43.1mL，312.1mmol，1.0当量)的干燥THF(106mL)溶液引入第二个滴液漏斗中。在-78℃下，将所述溶液缓慢添加到反应混合物中，历经2h。将混合物在-78℃下搅拌2h。将反应混合物倒入300mL冷水中，搅拌30分钟，并让其升温至RT。然后，将混合物在乙酸乙酯和H2O之间分配。分离有机层，并将水层用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。将合并的有机相丢弃。然后，用100mL 2N HCl酸化水层，然后用乙酸乙酯(3×300mL)萃取，用50mL盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，以得到标题化合物，该化合物无需进一步纯化即可使用。
1.2.步骤ii：3-环丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-5-胺
在圆底烧瓶中填充3-环丁基-3-氧代-丙腈(10g，81.4mmol)、4-氟苯基肼盐酸盐(CAS#823-85-8，12g，74mmol)和EtOH(35mL)。将反应混合物回流2小时并冷却至RT。真空除去一半溶剂。剧烈搅拌混合物并加入二异丙基醚(350mL)。继续搅拌1h，并将形成的沉淀物过滤，用二异丙醚洗涤，并在40℃下减压干燥，以得到标题化合物。
1.3.步骤iii：3-环丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4,6-二醇
将3-环丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-5-胺(5g，18.6mmol)和丙二酸二乙酯(CAS#105-53-3，8.5mL，55.8mmol)的混合物在100℃加热30min，然后在170℃加热3h。将反应混合物冷却至RT，并溶解于二氯甲烷(60mL)中。将所得溶液倒入搅拌的正庚烷(700mL)溶液中。将沉淀物经过滤收集，用正庚烷洗涤，并在40℃下减压干燥，以得到标题化合物。
1.4.步骤iv：4,6-二氯-3-环丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶
向装有Dean-Stark装置的三颈圆底烧瓶填充二氯化磷酸苯酯(CAS#770-12-7，854g，4.05mol)。历经5min，分批加入3-环丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4,6-二醇(404g，1.35mol)。历经1h，将温度升至170℃，并在170℃下继续搅拌21h。将反应混合物冷却至50℃，并缓慢加到搅拌的4N NaOH(5L)水溶液中，将温度保持在20℃以下。将混悬液在10-15℃下搅拌1小时，然后加入冷水(3L)。通过过滤收集沉淀物，用水冲洗，并在40℃下减压干燥，以得到标题化合物。
1.5步骤v：4-氯-3-环丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-甲酸甲酯
将加压容器填充4,6-二氯-3-环丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶(5g，14.9mmol)、Pd(dppf)Cl2·DCM(CAS#95464-05-4，218mg，0.3mmol)和醋酸钠(1.8g，22.3mmol)的二氧六环/甲醇(1:1，25mL)溶液。将系统加载CO(4bars)，并在40℃下加热2小时。将容器冷却至RT，并通过LCMS监测转化。再次将反应容器填充CO(4bars)，并在40℃下加热。重复所述序列，直到观察到完全转化。将粗混合物减压浓缩，并通过快速柱色谱纯化，用正庚烷/二氯甲烷混合物洗脱(90/10至30/70)，以得到标题化合物。
1.6步骤vi：3-环丁基-1-(4-氟苯基)-4-[4-(4-甲氧基-1-哌啶基)-1-哌啶基]吡唑并[3,4-b]吡啶-6-甲酸甲酯
向4-氯-3-环丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-甲酸甲酯(8.11g，22.6mmol)的干燥N-甲基吡咯烷酮(100mL)溶液中，加入4-甲氧基-1,4'-联哌啶(5.37g，27.1mmol)和二异丙基乙胺(9.42mL，54.2mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌24小时，然后冷却至室温，并用水稀释。在0℃下冷却后，形成混悬液。将混悬液过滤，并用水冲洗所得沉淀物。干燥后，得到标题化合物。
1.7步骤vii：3-环丁基-1-(4-氟苯基)-4-[4-(4-甲氧基-1-哌啶基)-1-哌啶基]吡唑并[3,4-b]吡啶-6-甲酸
将3-环丁基-1-(4-氟苯基)-4-[4-(4-甲氧基-1-哌啶基)-1-哌啶基]吡唑并[3,4-b]吡啶-6-甲酸甲酯(80μmol)溶于THF/乙醇的混合物(1/1；6mL)中，并在室温下，加入1N氢氧化钠(0.5mL，500μmol)的水溶液。将溶液搅拌4h。加入1N HCl(0.5mL，500μmol)水溶液和磷酸盐缓冲液(pH 6.2)。减压除去部分溶剂，并将所得混合物用氯仿萃取两次。将合并的有机相经硫酸镁干燥，过滤并减压蒸发，以得到标题化合物。
1.8步骤viii：N-(二甲基氨磺酰基)-1-(4-氟苯基)-4-[4-(4-甲氧基哌啶-4-基)哌啶-1-基]-3-(丙烷-2-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-甲酰胺
在室温下，将3-环丁基-1-(4-氟苯基)-4-[4-(4-甲氧基-1-哌啶基)-1-哌啶基]吡唑并[3,4-b]吡啶-6-甲酸(0.15mmol)和羰基二咪唑(37mg，0.23mmol)在无水DMF(800μL)中搅拌1h。然后，对于Cpd 1加入N,N-二甲基磺酰胺(37mg，0.30mmol)或者对于Cpd 2加入N-甲基磺酰胺(33mg，0.30mmol)和三乙胺(42μL，0.30mmol)，随后缓慢加入DBU(34μL，0.23mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30min，用甲醇稀释，并经制备型HPLC在
Figure BDA0003316469260000181
SunfireTMC8柱(30×150mm)上，用40％至70％梯度的在10mM醋酸铵水溶液中的乙腈纯化，以得到标题化合物。
Cpd 1NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.01ppm(dd,J＝8.84,4.55Hz,2H),7.44
ppm(s,1H),7.25ppm(t,J＝8.46Hz,2H),4.03-3.94ppm(m,1H),3.73-3.69ppm(m,2H),3.37ppm(s,3H),3.3-3.24ppm(m,1H),3.04ppm(s,6H),2.97-2.87ppm(m,4H),2.65-2.56ppm(m,2H),2.52-2.36ppm(m,5H),2.13-2.02ppm(m,4H),1.9ppm(s,2H),2.01-1.9ppm(m,2H),1.73-1.61ppm(m,3H)
Cpd 2NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.90-8.08(m,2H),7.45(s,1H),7.13-7.36(m,2H),5.65(d,J＝4.6Hz,1H),3.87-4.00(m,1H),3.82(d,J＝12.2Hz,2H),3.65(br.s.,1H),3.39(s,3H),3.15-3.45(m,4H),3.04(t,J＝12.0Hz,2H),2.73-2.87(m,3H),2.35-2.70(m,9H),1.94-2.22(m,6H).
表I.本发明的说明性化合物
Figure BDA0003316469260000191
生物学实施例
实施例2.体外测试
2.1在野生型CFTR中的黄色荧光蛋白(YFP)卤化物测定
2.1.1测试原理
为了评价受试化合物抑制野生型CFTR的能力，利用转染野生型人CFTR的HEK293细胞，进行YFP卤化物分析。(Galietta、Jayaraman和Verkman 2001)在24小时内，用剂量范围的受试化合物孵育细胞，并绘制所得的野生型CFTR活性图，以得到EC50。
还将受试化合物与毛喉素(forskolin)一起加到表达野生型CFTR的细胞中，以充分激活质膜上可用的CFTR，并准确测定通道活性的抑制。
2.1.2方案
利用jetPEI(Polyplus转染)，用10～80ng野生型CFTR和20ng编码YFP(H148Q/I152L/F47L)的质粒转染HEK293细胞。转染后，直接将细胞接种在涂有聚-D-赖氨酸的黑色96孔板中，密度为每孔70,000个细胞。第二天，将细胞用校正剂处理24小时。在所述温孵期后，用含Ca2+和Mg2+的DPBS清洗细胞两次。随后，用10μM毛喉素和所需浓度的增效剂(体积40μl)处理细胞，并在室温下孵育10min，该时间点在先前的实验中得到优化，从而形成良好的窗口(阳性对照/阴性对照>2)和信号背景比。利用EnVision读板仪(Perkinlemer)测量YFP荧光。将信号记录7秒，在将110μL NaI缓冲液(137mM NaI，2.7mM KI，1.7mM KH2PO4，10.1mMNa2HPO4，5mM D-葡萄糖)以150μl/s的速度注入孔中之前开始，最终体积为150μl。激发波长是485nm，而发射波长是530nm。
利用4参数希尔函数拟合浓度-响应实验，其形式为响应＝底部+(顶部-底部)/(1+(EC50/浓度)^HillSlope))，以测定EC50值。
2.1.3结果
在本测试中，Cpd 1以728nM的EC50抑制WT CFTR，而Cpd 2以102nM的EC50抑制wtCFTR。
实施例3TECC测试
3.1测试原理
TECC测试用于评价化合物对正常原代支气管上皮细胞(HBE细胞)上的作用，其是更接近生理条件的。
3.2人支气管上皮(HBE)细胞培养
从正常(wt CFTR)的移植肺分离的支气管上皮细胞是从接受计划移植的供体的肺分离的。将所述原代细胞直接在直径6.5mm和孔径0.4μm(Costar，#3397)的IV型胶原-涂层聚碳酸酯Transwell支架上，于气液(ali)界面中培养18～25天，基本上同之前对TECC的描述相同。(Fulcher等人，2005)
3.3方案
利用EP Design(Bertem，比利时)开发和销售的TECC仪器，完成跨-上皮钳位电路(TECC)记录。在记录过程中，将上皮细胞在基底外侧(640μl)和顶端(160μl)用NaCl-林格溶液(120mM NaCl、20mM HEPES、1.2mM CaCl2、1.2mM MgCl2、0.8mM KH2PO4、0.8mM K2HPO4、5mM葡萄糖，pH 7.4)浸泡，并保持在37℃。将顶端阿米洛利用于抑制内源性ENaC电流(100μM)，而毛喉素(0.3μM)用于顶端和基底外侧，以刺激CFTR。首先将实验期间使用的所有触发剂和化合物溶解于DMSO中，以形成1000倍的浓缩溶液，在刚在处理之前，用NaCl-林格溶液制备10倍的储备液，用于在实验期间加入正确浓度的触发剂和/或化合物。在记录之前，将细胞用受试化合物处理24小时，并在电生理记录前，在TECC缓冲液中重复所述处理。在20-min的时间范围内进行测量，每2分钟进行记录。在开路情况下，测量跨上皮电位(PD)和跨上皮电阻(Rt)，并使用欧姆定律转换为Ieq。将Ieq的最大增加(ΔIeq)用作CFTR活性增加的衡量指标。
3.3.1结果
在所述测试中，当利用0.3μM毛喉素激活CFTR通道时，将正常HBE细胞用Cpd 1和Cpd 2的组合孵育，致使电流从10.7μA/cm2(DMSO对照；溶媒)降低至3.06μA/cm2(通道活性降低72％)。
当用0.1μM毛喉素激活CFTR通道时，将正常HBE细胞用Cpd 1和Cpd 2的组合孵育，致使电流从4.09μA/cm2(DMSO对照；溶媒)降低至0.8μA/cm2(通道活性降低80％)。
当用0.3μM毛喉素激活CFTR通道时，将正常HBE细胞用Cpd 1单独孵育，致使电流从14.4μA/cm2(DMSO对照；溶媒)降低至6.6μA/cm2(通道活性降低54％)，pIC50为6.97(得出108nM的IC50值)。
当用0.3μM毛喉素激活CFTR通道时，将正常HBE细胞用Cpd 2单独孵育，致使电流从14.1μA/cm2(DMSO对照；溶媒)降低至5.9μA/cm2(通道活性降低58％)，pIC50为7.50(得出32nM的IC50值)。
在没有毛喉素的情况下，通道活性导致0.25μA/cm2的电流。
实施例4在YHA测试中二甲双胍和化合物1的组合对CFTR活性的作用
4.1测试原理
为了利用肾小管细胞评价受试化合物组合抑制野生型CFTR的能力，研发YFP卤化物测试，其利用转染野生型小鼠CFTR的mIMCD3_wt细胞(
Figure BDA0003316469260000211
CRL-2123)(Galietta，Jayaraman和Verkman 2001)。在24小时内，用剂量范围的化合物1或剂量范围的化合物1与剂量增加的二甲双胍的组合孵育细胞。在测量之前立即，将毛喉素以及与剂量增加的二甲双胍组合或未组合的剂量范围的化合物1一起加入到表达野生型CFTR的mIMCD3细胞中，以完全激活质膜上的可用CFTR。绘制受试化合物对通道的抑制图，以得到IC50s。
4.2测试方案
利用jetPEI(Polyplus转染)，将小鼠mIMCD3_wt细胞用20ng野生型CFTR和80ng编码YFP(H148Q/I152L/F47L)的质粒转染。转染后，直接将细胞接种在涂有聚D-赖氨酸的黑色96孔板中，密度为每孔40,000个细胞。第二天，将细胞用化合物处理24小时。在所述温孵期后，用含Ca2+和Mg2+的DPBS清洗细胞两次。随后，用10μM毛喉素和所需浓度的化合物(体积40μl)处理细胞，并在室温下孵育15min，该时间点在先前的实验中得到优化，从而形成良好的窗口(阳性对照/阴性对照>2)和信号背景比。利用EnVision读板仪(Perkinlemer)测量YFP荧光。将信号记录7秒，将110μL NaI缓冲液(137mM NaI，2.7mM KI，1.7mM KH2PO4，10.1mMNa2HPO4，5mM D-葡萄糖)以150μl/s的速度注入孔中之后开始，最终体积为150μl。激发波长是485nm，而发射波长是530nm。
利用4参数希尔函数拟合浓度-响应实验，其形式为响应＝底部+(顶部-底部)/(1+(EC50/浓度)^HillSlope))，以测定EC50值。
4.3结果
当进行上述测试时，得到下述结果。
表II.在浓度增加的二甲双胍和30μM Cpd 1存在的情况下，mIMCD3_wt YHA测试中的IC50。
[Cpd 1](μM) [二甲双胍](μM) IC<sub>50</sub>(μM)
30 0 3.12
30 20 3.67
30 40 2.32
30 80 3.79
30 160 2.91
30 310 1.91
30 630 1.77
30 1250 1.82
30 2500 0.83
30 5000 0.92
在小鼠mIMCD3_wt细胞中，仅30μM的化合物1能够抑制小鼠CFTR活性，EC50为3.12μM。
在小鼠mIMCD3细胞中，与二甲双胍联用时，化合物1显示出抑制小鼠CFTR通道的作用，当剂量增加的二甲双胍与化合物1联用时，其效力增加。当5μM二甲双胍与化合物1联合时，化合物1抑制小鼠CFTR，IC50为0.92μM。在本测试中，二甲双胍与化合物1联合时，观察到的效力变化可表明二甲双胍与化合物1在抑制小鼠CFTR方面具有加和和/或协同效应。
实施例5细胞实验
5.1 3D小鼠囊肿实验
5.1.1实验原理
本实验利用形成小囊肿的PKD1-/-敲低的小鼠髓质管细胞。然后，用毛喉素进一步刺激囊肿，使其扩张。然后，向试验化合物中加入额外的毛喉素，以评估其抵抗囊肿形成的能力。3天后，对所述细胞进行成像，以测量囊肿大小、细胞数量、细胞核形状、壁厚。
5.1.2实验方案
如前所述，已用Pkd1 KO小鼠内髓集合管细胞(mIMRFNPKD 5E4)进行了3D囊肿培养试验。(Booij等人，2017年)简言之：将mIMRFNPKD 5.104细胞与Cyst-Gel(OcellO B.V.，Oortweg 21，Leiden，2333CH，荷兰)混合。利用CyBio Felix 96/60机器人液体分配器(Analyik Jena AG)，将15μL细胞-凝胶混合物移液至384-孔板(GreinerμClear，GreinerBio One B.V.)。将凝胶-细胞混合物以每孔2250个细胞的最终细胞密度进行接种。在37℃下凝胶聚合30分钟后，向每个孔中加入33μL培养基。细胞在凝胶中生长96小时，之后细胞与毛喉素(Calbiochem)共同暴露，并将下述分子：雷帕霉素(SelleckChem，S1039)、星形孢菌素(SelleckChem，S1421)分别用作囊肿抑制或毒性对照。在3D实验中，以指定的最终浓度对受试化合物进行测试。72小时后，用4％甲醛(Sigma-Aldrich)固定培养物，并同时用0.2％Triton-X100(Sigma Aldrich)渗透培养物，并用0.25μM罗丹明-鬼笔环肽(Sigma-Aldrich)和0.1％Hoechst 33258(Sigma Aldrich)在1x PBS(Sigma Aldrich)中在4℃避光染色2天。固定和染色后，用1x PBS清洗板子，然后用Greiner SilverSeal(Greiner Bio-One B.V.)密封板子，并在成像前储存于4℃下。利用装配4x尼康物镜的Molecular DevicesImageXpress Micro XLS(Molecular Devices)进行成像。对于每个孔，在Z方向为两个通道制作了34个图像，在每个图像中捕获整个Z平面。利用Ominer软件(OcellO BV.)对肌动蛋白和细胞核进行图像分析。
5.1.3结果
在3D囊肿实验中，与溶媒(设置为100％)相比，Cpd 1(10μM)的72小时孵育致使囊肿肿胀14.5％，对应于囊肿肿胀降低85.5％。
在3D囊肿实验中，与溶媒(设置为100％)相比，Cpd 2(10μM)的72小时孵育致使囊肿肿胀-1.7％，对应于囊肿肿胀降低100％。
5.2 3D人体囊肿生长实验
5.2.1实验原理
该实验在DiscoveryBioMed，Inc(400Riverhills Business Park,Suite 435,伯明翰，AL 35242-8101,USA)进行，利用来自人ADPKD供体肾的人细胞，其在3D培养中形成囊肿。在本实验设计中，用受试化合物治疗(囊肿缩小设计)前，允许形成囊肿持续4天。没有将特定的触发剂用于支持囊肿的形成。对受试化合物进行评价，以确定其防止已形成的囊肿生长以及新囊肿形成的能力。在受试化合物处理8天后，将这些细胞进行成像，以特别测量细胞的数量、囊肿数量和囊肿大小。
5.2.2实验方案
已用从源自Discovery BioMed‘s Autosomal Dominant Polycystic KidneyDisease(ADPKD)供体5(已确认pkd1基因突变)的囊肿收集的细胞完成3D人囊肿发生实验。
选择减少实验范例来测试受试化合物在凝胶中已经开始形成囊肿时减缓或停止囊肿扩张的能力。用8种不同剂量(3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM和10μM)测试化合物1和2。
在第0天，将供体5细胞以5,500个细胞/孔接种到专用Discovery BioMed生物凝胶中，并在第5、7、9和11天将受试化合物或溶媒加到细胞中。在整个研究过程中，用含2.5％FBS的专用Discovery BioMed RenalCyte Media来维持细胞。重要的是，没有添加刺激物例如毛喉素或精氨酸-加压素。在第4天(药物治疗前)和第12天用Cytation 5(BioTek)进行的实验结束时，利用4倍放大物镜获取图像，其中6幅图像被捕获并拼合在一起，以形成整个384-孔板中单个孔的完整区域。在整个凝胶的多个点上捕获场，并将整个堆栈转换为z投影。利用经过训练的深度学习算法分析Brightfield图像，以识别囊肿并测量其数量和大小。在第13天，图像采集后，利用Promega 3D CellTiterGlo(CTG)估计细胞数量。
5.2.3结果
用10μM剂量的Cpd 1孵育致使定量的人类囊肿面积减少31％(相对于DMSO对照组p<0.05，通过1-way ANOVA和随后的Kruskal-Wallis post-hoc分析确定显著性)。(图1)
用10μM剂量的Cpd 2孵育致使定量的人类囊肿面积减少41％(相对于DMSO对照组p<0.05，通过1-way ANOVA和随后的Kruskal-Wallis post-hoc分析确定显著性)。(图1)
用Cpd 1孵育致使形成的人囊肿数量浓度-依赖性减少。从0.1μM剂量至高达10μM剂量，Cpd 1显示显著效果(相对于DMSO对照组p<0.05，通过2-way ANOVA和随后的Dunnett’s post-hoc分析确定显著性)。(图2)
用Cpd 2孵育致使形成的人囊肿数量浓度-依赖性减少。从0.1μM剂量至高达10μM剂量，Cpd 2显示显著效果(相对于DMSO对照组p<0.05，通过2-way ANOVA和随后的Dunnett’s post-hoc分析确定显著性)。(图2)
表III.Cpd 1和Cpd 2对溶媒(DMSO)的箱形图囊肿大小分布
受试组 DMSO Cpd 1(10μM) Cpd 2(10μM)
数据点数量 85 71 67
10％百分位数(μm<sup>2</sup>) 1993 1608 1689
25％百分位数(μm<sup>2</sup>) 3141 1941 1858
中值(μm<sup>2</sup>) 4526 2764 2444
75％百分位数(μm<sup>2</sup>) 6646 4682 3406
90％百分位数(μm<sup>2</sup>) 8647 6765 5589
p值 NA <0.0001 <0.0001
表IV图2：Cpd 1和Cpd 2相比溶媒(DMSO)的浓度依赖性囊肿大小分布
Figure BDA0003316469260000251
表V 图3-Cpd 1相比溶媒(DMSO)的浓度依赖性囊肿大小分布
Figure BDA0003316469260000261
表VI 图4-Cpd 2相比溶媒(DMSO)的浓度依赖性囊肿大小分布
Figure BDA0003316469260000262
5.3与托伐普坦联合的体内实验
5.3.1模型原理
ADPKD小鼠模型基于PKD1flox/flox(具有位于外显子2-4的两侧的lox位点)/普遍存在的CreERT2的小鼠，其中通过在出生后第12天用他莫昔芬处理小鼠(在哺乳期雌性小鼠中)而激活Cre重组酶，而普遍敲除PKD1基因。PKD1基因的纯合敲除导致肾囊肿的快速形成，在一定程度上模拟人类ADPKD疾病的发展。
在该模型中评价受试化合物(托伐普坦、Cpd 2和托伐普坦+Cpd 2的组合)减少肾囊肿形成(囊肿体积％)的能力，以及通过血尿素氮(BUN)浓度(肾功能标志物)测量的保护小鼠肾功能免于衰竭的能力。
具体而言，尿素氮是血液中的一种正常废物，由食物蛋白质分解和身体代谢产生，通常由肾脏清除。当肾功能减低时，BUN水平升高。
5.3.2实验方案
实验前，将PKD1 flox/flox(具有在外显子2-4两侧的lox位点)/普遍存在的CreERT2的小鼠群体维持在Charles River Laboratories(法国)。为了诱导Cre重组酶活性，在出生后第12天，通过腹腔注射，将他莫昔芬(60mg/kg葵花籽油溶液)注射给哺乳期雌性小鼠。随后，给幼崽喂食含他莫昔芬的牛奶。治疗从4周龄开始，持续11周。将托伐普坦纳入饮食(0.1％)，并将其单独或与Cpd 2联合以250mg/kg，q.d.，p.o.施用。在治疗开始时或在研究期间定期收集血清，以在Spotchem生物分析仪上测定血尿素氮(BUN)水平。尸检时，收集肾脏并称重，以确定肾脏重量/体重比。
对于每只小鼠，在石蜡包埋前，将在矢状面切割的一半肾脏用标准方法在缓冲甲醛(VWR，法国)中固定24小时。在图像分析之前，对肾脏切片用苏木精染色。
利用CalopixTM图像分析软件(Tribvn，法国)，由苏木精染色的肾切片计算囊肿百分比。将囊性百分比测量为囊性面积与总截面积的比率(Rodger等人，2016年)。为了估计囊肿体积，将囊肿百分比乘以2个肾脏的总重量，以确定总囊肿重量，然后通过假设1g/mL囊肿液，将总囊肿重量转换为总囊肿体积(Rodger等人，2016)。
进行两个独立实验。结合两个实验结果(BUN和囊肿体积％)，进行荟萃分析(meta-analysis)，以提高显著确定Cpd 2及其与托伐普坦的组合的效果的能力。
5.3.3荟萃分析结果
已将所有实验组相对疾病组的Dunnett post-hoc多重比较的双因素方差分析(two-way ANOVA)应用于处死时(第15周)BUN(mg/mL)x相对于第4周BUN的对数倍变化(logFC)，作为组和研究的函数。
计算第15周(处死)相对于第4周(治疗开始)的平均倍数变化，假设疾病组(未治疗)的变化为100％。
表VII 研究中与第4周相比的第15周的BUN平均倍数变化
Figure BDA0003316469260000271
Figure BDA0003316469260000281
尽管与疾病组相比，在第4周至第15周单独施用托伐普坦或Cpd 2并未导致显著的倍数变化，但与疾病组相比，托伐普坦和Cpd 2的组合产生显著的倍数变化差异，表明在试验剂量下，托伐普坦和Cpd 2联用确实可影响疾病进程。
结论
本领域技术人员应该理解：上述描述本质上是示例性和解释性的，并且旨在说明本发明及其优选实施方案。通过常规实验，技术人员将认识到在不背离本发明精神的情况下，可以进行显而易见的修改和变更。在所附权利要求书的范围内的所有所述修改预期包括在其中。因此，不预期通过上述描述定义本发明，而是通过下述权利要求及其等价物进行定义。
将本说明书中引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)引入文中作为参考，就好像将每个单独的出版物明确和单独说明引入文中如同已完全阐述作为参考一样。
应当理解：各种因素例如化合物的细胞穿透能力不同可导致体外生化和细胞分析中化合物活性之间的差异。
本申请中给出和阐述的本发明化合物的至少一些化学名称可能已通过使用市售化学命名软件程序自动生成，且未经独立验证。完成所述功能的代表性程序包括Open EyeSoftware，Inc.出售的Lexichem命名工具和MDL，Inc.出售的Autonom软件工具。在所示化学名称和描述的结构不同的情况下，将以描述的结构为准。
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Claims (9)

1.提供根据式(I)的化合物，其用于预防和/或治疗多囊肾病：
Figure FDA0003316469250000011
其中R1是H或–CH3；
或其药学上可接受的盐或溶剂合物或者其溶剂合物的药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是H。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是–CH3。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或者根据权利要求13的药物组合物，其用于预防和/或治疗常染色体显性多囊肾病。
5.药物组合物，其包含根据权利要求1-3中任何一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其还包含其他治疗物质。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中其他治疗物质是多囊肾病治疗物质。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中其他治疗物质是托伐普坦。
9.根据权利要求6所述的药物组合物，其中其他治疗物质是二甲双胍。
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