CN103180321A

CN103180321A - 氮杂金刚烷衍生物的一水合物

Info

Publication number: CN103180321A
Application number: CN2011800458669A
Authority: CN
Inventors: 陈爽; J.J.纳皮尔; G.G.Z.张; P.J.布雷克迈尔
Original assignee: AbbVie Inc
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 2010-09-23
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2013-06-26
Also published as: CL2013000756A1; EP2619205A1; JP2017039764A; BR122014023207A2; DOP2013000064A; RU2579121C2; BR112013005434A2; UY33628A; AU2011305462B2; TW201212914A; CR20130169A; AU2011305462A1; CO6720965A2; EP2619205B1; CA2809675A1; WO2012040404A1; TW201626996A; SG188307A1; CN106074548A; US20150239882A1

Abstract

本发明涉及(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐结晶一水合物、包含这种化合物的组合物和制备这种化合物的方法。

Description

氮杂金刚烷衍生物的一水合物

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2010年9月23日申请的美国临时专利申请系列No. 61/385,674的优先权，本文以引证的方式结合其全部内容。

与联邦资助的研究或开发有关的陈述

不适用。

发明背景。

技术领域

本发明涉及氮杂金刚烷衍生物，且更尤其涉及氮杂金刚烷衍生物的结晶一水合物形式、包含这种化合物的组合物、使用这种化合物和组合物来预防或治疗病症和障碍的方法和制备这种化合物的方法。

相关技术的说明

烟碱样乙酰胆碱受体(nAChRs)广泛地分布在中枢(CNS)和周围(PNS)神经系统中。这种受体在调节CNS功能过程中起重要作用，尤其通过调节许多种神经传递介质的释放来起作用，神经传递介质包括但不一定局限于：乙酰胆碱，去甲肾上腺素，多巴胺，血清素和GABA。因此，烟碱样受体介导很宽范围的生理效应，并且是治疗与认知功能、学习和记忆、神经变性、疼痛、炎症、精神病、感觉门控、情绪和情感有关的障碍以及其它病症的靶向。

nAChR的许多亚型存在于CNS和周围神经系统中。每个亚型具有不同的调节总体生理功能的作用。典型地，nAChRs是由亚型蛋白的五聚体组装所构成的离子通道。已经在神经元组织中确定了至少12种亚型蛋白，α2-α10和β2-β4。这些亚型提供了多种多样的同源性和异源性的组合，其说明了受体亚型多样性的原因。例如，在脑组织中负责烟碱的高亲合性结合的主要受体具有组合(α4)₂(β2)₃(α4β2亚型)，而受体的另一个主要群体由同源性(α7)₅(α7亚型)受体组成。

某些化合物，例如植物碱烟碱，与nAChRs的所有亚型相互作用，说明这种化合物具有很深的生理效应。尽管已经表明烟碱具有许多有益特性，但并不是所有的烟碱介导的效果是合乎需要的。例如，烟碱产生胃肠和心血管副作用，在治疗剂量时发生干扰，并且它的上瘾性质和急性毒性是众所周知的。只与nAChR的某些亚型选择性相互作用的配体，可以提供获得有益治疗效果的潜力，同时安全性提高。

已经证明，α7和α4β2 nAChRs在提高认知功能方面起到显著的作用，包括学习、记忆和注意力方面(Levin, E.D., J. Neurobiol. 53: 633-640,2002)。例如，α7 nAChRs与下列有关：与注意力缺陷障碍相关的病症和障碍，注意缺陷多动障碍(ADHD)，精神分裂症，阿尔海默氏疾病(AD)，轻微的认知损害，老年痴呆，与Lewy体相关的痴呆，与唐氏综合征（Down’s syndrome）相关的痴呆，AIDS痴呆和皮克氏病以及炎症。α4β2受体亚型牵涉于注意力、认知能力、癫痫和疼痛控制(Paterson and Norberg，Progress in Neurobiology 61 75-111，2000)以及戒烟或烟碱戒除综合症。

可以通过给予亚型选择性的nAChR配体，改变或调节α7和α4β2 nAChRs的活性。配体可以显示拮抗剂、激动基或部分激动剂特性。起到别构调节剂（allosteric modulators）作用的化合物也是已知的。

虽然对于大量烟碱样受体亚型(包括α4β2和α7 nAChRs)非选择性地显示活性的化合物是已知的化合物，但有益的是，相比于其它亚型，提供了选择性地与含有α7的神经元nAChRs、α4β2 nAChRs或α7和α7和α4β2 nAChRs两者相互作用的化合物。

考虑到本领域的这种需要，发明人与其它人研制了新的氮杂金刚烷衍生物，公开在共同待定的公开中。具体地说，美国专利申请公开No. 2008/0167336(以下简称“‘336公开”)涉及氮杂金刚烷衍生物和化合物的盐形式。‘336公开表明，其中公开的某些化合物可以以本发明化合物的盐形式存在。这种化合物的盐包括但不局限于：无水L-酒石酸氢盐，L-酒石酸氢盐水合物，无水磷酸二氢盐，磷酸二氢盐水合物，无水丁二酸氢盐，丁二酸氢盐水合物，盐酸盐四分之一水合物，盐酸盐倍半水合物，柠檬酸二氢盐和柠檬酸一氢盐。由于这些化合物相比于本领域已知的其它化合物可选择性地与含有α7的神经元nAChRs、α4β2 nAChRs或α7和α4β2 nAChRs两者相互作用，所以认为它们是重要的化合物。

附图的简要说明

图1是(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐的粉末X射线衍射图。

图2是(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的结晶盐的热像图。

图3是(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐的吸湿等温线，通过用于测定化合物的吸湿性的动态水分吸附平衡来测定。

图4(a)举例说明了由基本上纯的结晶一水合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐(化合物A)组成的制剂的X射线粉末衍射图。

图4(b)举例说明了从水活度（water activity）为0.20的悬浮液中回收的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐(化合物A)固体的X射线粉末衍射图。

图4(c)举例说明了从水活度为0.15的悬浮液中回收的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐(化合物A)固体的X射线粉末衍射图。

图4(d)举例说明了从水活度为0.10的悬浮液中回收的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐(化合物A)固体的X射线粉末衍射图。

图4(e)举例说明了从水活度为0.05的悬浮液中回收的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐(化合物A)固体的X射线粉末衍射图。

图4(f)举例说明了由基本上纯的结晶无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐(化合物A)组成的制剂的X射线粉末衍射图。

本发明概述

对‘336公开的化合物进行彻底的盐筛选，确定使人们感兴趣的主要化合物。在检验盐组合物的过程中，由于有利的固态特性、药物特性和制备特性，将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的柠檬酸二氢盐无水盐确定为特别感兴趣的化合物。考虑到这些有利的特性，选择(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐进行额外分析，包括多晶型物筛选和多晶型物分析。相应地，本发明涉及(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐和其相关方法和工艺。

本发明的一个实施方案涉及具有式(I)的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的结晶盐

其中该盐包括具有式(II)的柠檬酸二氢基团

。

在一个额外的实施方案中，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐具有的纯度为至少90%的一水合物形式，并且非一水合物形式不大于10%。在又一个额外的实施方案中，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐具有的纯度为至少95%的一水合物形式，并且非一水合物形式不大于5%。在进一步额外的实施方案中，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐具有的纯度为至少97%的一水合物形式，并且非一水合物形式不大于3%。

在进一步实施方案中，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物在粉末X射线衍射图中、在下列2θ度数值处显示至少一个特征峰：8.4 ± 0.20, 11.3 ± 0.20, 14.2 ± 0.20, 15.5 ± 0.20, 16.4 ± 0.20, 16.6 ± 0.20, 17.2 ± 0.20, 19.7 ± 0.20, 20.7 ± 0.20, 21.0 ± 0.20, 21.2 ± 0.20, 21.6 ± 0.20, 24.8 ± 0.20和26.9 ± 0.20。

在又一个实施方案中，权利要求1的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的的结晶一水合物具有单位晶胞参数，其中a大约为6.52Å，b大约为20.99Å，c大约为16.83Å，α大约为90.0°，β大约为93.75°，γ大约为90.0°，体积大约为2297.52Å³，Z大约为4。

在另一个实施方案中，当通过动态水分吸收重量分析进行评价时，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物显示了不吸湿的特性，从相对湿度0%至90%，失重低于大约0.2%。

本发明的另一个实施方案涉及包含本发明化合物的药物组合物。这种组合物可以按照本发明的方法给予，一般作为治疗或预防与nAChR活性相关的病症和障碍的治疗方案的一部分，且更尤其是与α7 nAChR活性、α4β2 nAChR活性或α7 nAChR活性与α4β2 nAChR活性两者相关的病症和障碍。

本发明的又一个实施方案涉及调节α7和α4β2 nAChR活性的方法。该方法可有效用于治疗、预防或不但治疗而且预防与α7和α4β2 nAChR两者活性都相关的病症和障碍，尤其用于哺乳动物。

本发明的进一步实施方案涉及选择性地调节nAChR活性的方法，例如α7 nAChR活性。该方法可有效用于治疗、预防或不但治疗而且预防哺乳动物的与α7 nAChR活性相关的病症和障碍。也包括选择性调节α4β2 nAChR活性的方法。

这种方法可有效用于与注意力缺陷障碍相关的病症和障碍，注意缺陷多动障碍(ADHD)，阿尔海默氏疾病(AD)，精神分裂症，轻微认知损害，年龄相关的记忆损害(AAMI)，老年痴呆，AIDS痴呆，Pick's疾病，与Lewy体相关的痴呆，与唐氏综合征（Down’s syndrome）相关的痴呆，精神分裂症，戒烟，戒除烟碱综合症，肌萎缩性侧索硬化，Huntington's疾病，与外伤性脑损伤相关的CNS功能削弱，急性疼痛，手术后疼痛，慢性疼痛，炎症性疼痛，神经性疼痛，不孕，循环不足，与创伤愈合相关的新血管生长的需要，更尤其是血管闭塞周围的循环，与皮肤移植的血管形成相关的新血管生长的需要，缺血，炎症，败血症，创伤愈合和与糖尿病相关的其它并发症，以及其它系统和神经元免疫调节活性。

本发明的其它实施方案涉及使用柠檬酸二氢盐无水盐作为起始原料来制备本发明的结晶一水合物盐的方法。具体地说，制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐的方法包括下列步骤：(a) 在大约65℃至大约85℃的温度范围内，将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷溶解在至少一种溶剂中；(b) 在至少30分钟期间内，将溶液的温度调节到大约55℃至大约75℃的温度范围；(c) 向该溶液中加入至少一种其它溶剂，混合至少30分钟；(d) 用两个小时以上的时间，将该溶液的温度调节到大约30℃至大约50℃的温度范围；(e) 在至少三个小时期间内，向该溶液中加入至少一种其它溶剂；(f) 在大约30℃至大约50℃的温度范围下，将该浆液保持至少一个小时；(g) 将该浆液的温度调节到大约-5℃至大约15℃的温度范围；(h) 将该浆液混合至少一个小时；和(i) 回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐。

步骤(a)的溶剂可以包括有机溶剂、水和其组合物。在进一步实施方案中，步骤(a)的溶剂选自：甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯，水和其混合物。在优选实施方案中，步骤(a)的溶剂包括2-丙醇和水的混合物。2-丙醇和水的混合物可以包括大约1:10至大约10:1比例范围的2-丙醇与水。在更优选实施方案中，2-丙醇和水的混合物可以包括大约3:1至大约5:1比例范围的2-丙醇与水。另外，步骤(a)的温度可以在大约70℃至大约80℃的范围，在更优选的实施方案中，步骤(a)的温度可以在大约74℃至大约76℃的范围。

步骤(b)可以包括：在至少30分钟期间内，将溶液的温度调节到大约60℃至大约70℃的温度。在优选的重复（iteration）中，步骤(b)可以包括：在至少30分钟期间内，将溶液的温度调节到大约64℃至大约66℃的温度。

步骤(c)的溶剂可以包括有机溶剂、水和其组合物。在优选的实施方案中，步骤(c)的溶剂可以选自甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯，水和其混合物。在更优选的实施方案中，步骤(c)的溶剂可以包括2-丙醇。另外，相对于步骤(a)所加入的溶剂量，步骤(c)使用的2-丙醇的量可以包括大约2个体积至大约10个体积。在优选实施方案中，相比于步骤(a)使用的溶剂数量，步骤(c)使用的2-丙醇数量可以包括大约5个体积至大约7个体积。

步骤(d)可以包括：经过两个小时以上的时间，将温度调节至大约35℃至大约45℃。在该方法的优选循环中，步骤(d)可以包括：在大约30分钟至大约八小时的期间内，将温度调节至大约39℃至大约41℃。然而，本领域技术人员可以理解，在不背离本发明范围的条件下，可以将时间延长。

步骤(e)的溶剂可以包括有机溶剂、水和其组合物。在优选的实施方案中，步骤(e)的溶剂可以选自甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯，水和其混合物。在更优选的实施方案中，步骤(e)的溶剂可以包括2-丙醇。另外，相对于步骤(a)所加入的溶剂量，步骤(e)使用的2-丙醇的量可以包括大约1个体积至大约10个体积。在优选实施方案中，相比于步骤(a)使用的溶剂数量，步骤(e)使用的2-丙醇数量可以包括大约4个体积至大约6个体积。

步骤(f)可以包括：将反应的温度调节至大约35℃至大约45℃，保持至少一个小时。在优选实施方案中，步骤(f)可以包括：将温度调节至大约39℃至大约41℃，保持至少一个小时。

步骤(g)可以包括：将浆液的温度调节到大约0℃至大约10℃的温度范围。在更优选的实施方案中，步骤(g)可以包括：将浆液的温度调节到大约4℃至大约6℃的温度范围。

进一步的，步骤(i)可以包括：过滤回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐。

在另一个实施方案中，本发明包括制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐的方法，该方法包括下列步骤：(a) 在大约75℃的温度，将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷溶解在大约4个体积的2-丙醇和大约1个体积的水中；(b) 在至少30分钟期间内，将溶液的温度调节到大约65℃的温度范围；(c) 向该溶液中加入大约6个体积的2-丙醇，并混合至少30分钟时间；(d) 经过两个小时以上的时间，将温度调节至大约40℃；(e) 在至少三个小时期间内，向该溶液中加入大约5个体积的2-丙醇；(f) 在大约40℃的温度，将该浆液保持至少一个小时；(g) 将该浆液的温度调节到大约5℃的温度；(h) 将该浆液混合至少一个小时；和(i) 回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的结晶一水合物盐。

在替代性实施方案中，本发明还包括制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐的方法，该方法包括下列步骤：(a) 在反应容器中，使无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐与溶剂接触；(b) 密封该反应容器，避免该悬浮液在环境条件下接触光；和(c)回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的结晶一水合物盐。

按照该方法，步骤(a)的溶剂可以包括水。另外，无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的数量可以包括大约100 mg至大约300 mg，水的数量可以包括大约0.1 mL至大约2.0 mL。在进一步优选实施方案中，无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的数量包括大约150 mg至大约250 mg，其中水的数量包括大约0.8 mL至大约1.2 mL。本领域技术人员还可以理解，步骤(a)的溶剂可以包括有机溶剂和水的混合物。此外，有机溶剂可以包括甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯和其混合物。

在进一步的替代性实施方案中，本发明包括药物组合物，其含有作为活性组分的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的晶体一水合物盐和可药用载体、稀释剂或赋形剂。在药物组合物的优选实施方案中，基于该组合物的总重量，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物的存在数量为大约0.1%至大约99.9%重量。在该实施方案中，含有(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物的药物组合物在粉末X射线衍射图中、在下列2θ度数值处显示至少一个特征峰：8.4 ± 0.20, 11.3 ± 0.20, 14.2 ± 0.20, 15.5 ± 0.20, 16.4 ± 0.20, 16.6 ± 0.20, 17.2 ± 0.20, 19.7 ± 0.20, 20.7 ± 0.20, 21.0 ± 0.20, 21.2 ± 0.20, 21.6 ± 0.20, 24.8 ± 0.20和26.9 ± 0.20。

本发明的详细说明

已知化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷存在许多盐形式，正如共同待定‘336公开所报道的那样。作为盐形式之一，柠檬酸二氢盐被确定为人们感兴趣的主要化合物，这是由于观察到一些与该化合物相关的益处。具体地说，无水柠檬酸二氢盐显示了有利的固态特性，包括高结晶性、可接受的熔点、不吸湿性和避免出现复杂的多晶型现象的能力。此外，无水柠檬酸二氢盐显示了有益的药物特性，包括固态稳定性：在40℃和75%相对湿度下经过12周能够保持稳定性、当接触UV/可见ICH类型I光源时能够保持稳定性、当在40℃下接触过氧化物蒸汽八天时能够保持稳定性。无水柠檬酸二氢盐在水中还显示了28 mg/ml的溶解度。此外，无水柠檬酸二氢盐还显示了有益的制备特性，因此，可以制备具有可接受的纯度和产率的该化合物，并且可以通过研磨来控制粒径。

考虑到这些有利的特性，选择(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐进行额外分析，包括多晶型物筛选和多晶型物分析。人们注意到，当按照‘336公开的方法制备时，可以回收无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐。因此，本发明的发明人对该无水柠檬酸二氢盐进行多晶型物筛选和热力学分析，确定是否可以制备该化合物的其它形式。具体地说，将柠檬酸二氢盐悬浮在各种溶剂中，从而确定是否可以制备其它晶体形式。

当与‘336公开所公开的化合物相比时，本发明的新的一水合物显示了有益特性。具体地说，在较高的水活度、较高的相对湿度或较高的水活度并且较高的相对湿度条件下，本发明的一水合物是该盐的热力学稳定形式，因此，当接触较高湿度并且较高水活度环境时，与无水形式相比，该一水合物可提供更好的化学和物理稳定性。这些类型的条件在某些类型的药物组合物中是很普遍的条件，例如溶液剂、混悬剂或任何肠胃外制剂。本发明的柠檬酸二氢盐一水合物形式还提供了制剂加工的益处。湿式制粒方法通常用于制备药物活性组分。在湿式制粒法期间，使用一水合物形式可以避免从无水形式至一水合物形式的任何转化，这种转化产生稳定性问题。相应地，柠檬酸二氢盐一水合物可提供物理化学稳定性，这种特性在以前是无法获得的。

本发明的柠檬酸二氢盐一水合物化合物通常含有一个分子的化学式(I)的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷和一个分子的化学式(II)的柠檬酸的盐(即，柠檬酸二氢盐)。虽然本发明主要集中于氮杂金刚烷化合物的(4s)-非对映体，但本发明的化合物可以存在式(Ia)和(Ib)所代表的形式：

。

异构体(Ia)和异构体(Ib)的氮杂-金刚烷部分不是手性的，然而，认为连接L₁的C-4碳是假不对称的碳。式(Ia)和(Ib)所代表的化合物是非对映体。按照下列所描述的内容，式(Ia)的结构的构型归属被指定为4r：Synthesis, 1992, 1080, Becker, D. P.; Flynn, D.L. and as defined in Stereochemistry of Organic Compounds, E.L. Eliel, S.H Wilen; John Wiley and Sons, Inc. 1994。此外，使用相同的方法，式(Ib)的结构的构型归属被指定为4s。

按照本文所描述的反应路线和实施例，使用个别立体异构体，可以分别地合成异构体(Ia)和(Ib)。或者，当在合成过程中使用立体异构体的混合物时，可以一起合成异构体(Ia)和(Ib)，而后可以利用色谱方法、从两个异构体的混合物中分离个别异构体。还可以通过将包含在用对映体纯羧酸制备的式(I)化合物中的胺的盐的分级结晶来分离异构体的混合物。

本发明涉及(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物结晶固体，可以用图1说明的它的粉末X射线衍射图中的特征峰来对其进行确定。分析化学领域的技术人员通过其粉末X射线衍射图中的很少一个特征峰，就可以容易地确定(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物固体。在(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的粉末X射线衍射图中，特征峰的2θ角位置是：8.4 ± 0.20, 11.3 ± 0.20, 14.2 ± 0.20, 15.5 ± 0.20, 16.4 ± 0.20, 16.6 ± 0.20, 17.2 ± 0.20, 19.7 ± 0.20, 20.7 ± 0.20, 21.0 ± 0.20, 21.2 ± 0.20, 21.6 ± 0.20, 24.8 ± 0.20和26.9 ± 0.20。由此，本发明的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物在粉末X射线衍射图中、在下列2θ度数值处显示至少一个特征峰：8.4 ± 0.20, 11.3 ± 0.20, 14.2 ± 0.20, 15.5 ± 0.20, 16.4 ± 0.20, 16.6 ± 0.20, 17.2 ± 0.20, 19.7 ± 0.20, 20.7 ± 0.20, 21.0 ± 0.20, 21.2 ± 0.20, 21.6 ± 0.20, 24.8 ± 0.20和26.9 ± 0.20。另外，本发明进一步预期，结晶(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物在粉末X射线衍射图中、在下列2θ度数值处显示至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个或至少十三个特征峰：8.4 ± 0.20, 11.3 ± 0.20, 14.2 ± 0.20, 15.5 ± 0.20, 16.4 ± 0.20, 16.6 ± 0.20, 17.2 ± 0.20, 19.7 ± 0.20, 20.7 ± 0.20, 21.0 ± 0.20, 21.2 ± 0.20, 21.6 ± 0.20, 24.8 ± 0.20和26.9 ± 0.20。此外，本发明进一步预期，结晶(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物在粉末X射线衍射图中、在下列2θ度数值处显示下列十四个特征峰：8.4 ± 0.20, 11.3 ± 0.20, 14.2 ± 0.20, 15.5 ± 0.20, 16.4 ± 0.20, 16.6 ± 0.20, 17.2 ± 0.20, 19.7 ± 0.20, 20.7 ± 0.20, 21.0 ± 0.20, 21.2 ± 0.20, 21.6 ± 0.20, 24.8 ± 0.20和26.9 ± 0.20。

进一步的，图2说明了(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的热重分析(TGA)。热重分析显示，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物随着温度提高而脱水。具体地说，在大约60℃起始至大约70℃，一水合物盐显示损失了大约2.5%至大约3.5%的质量。在优选实施方案中，在大约65℃起始时，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的一水合物盐显示损失大约2.9%的质量。

还获得了(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的结晶单位晶胞参数，并且按照下列参数测定：a是6.519Å，b是20.982Å，c是16.833Å，α大约为90.0°，β大约为93.75°，γ大约为90.0°，得到大约2297.52Å³的晶胞体积，其中a、b和c各自是晶格的代表性的长度，α、β和γ都是单位晶胞角度。盐以单斜晶P21/n空间群结晶。

进一步的，通常认为(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐不吸湿，在相对湿度为0%至90%的情况下，通过动态水分吸附平衡（dynamic moisture sorption balance）所测定的重量变化为0.05%至0.4%。在优选实施方案中，在0%至90%相对湿度的情况下，重量变化为大约0.2%。图3说明了(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的吸湿等温线。具体地说，图3说明了在相对湿度为10%至90%时的该一水合物盐的吸湿等温线。

此外，在高水活度、高相对湿度或高水活度并且高相对湿度的条件下，本发明的结晶一水合物是该盐的热力学稳定形式。具体地说，通常认为(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐具有0.05至0.20的临界水活度。在优选实施方案中，该柠檬酸二氢盐一水合物盐的临界水活度在0.10和0.15之间。因此，当本发明的结晶一水合物接触小于0.15的相对湿度水平时，或接触水活度为0.15的其它溶剂时，盐可以从一水合物形式转变为无水形式。如果结晶一水合物接触0.15或更大的相对湿度，或接触水活度大于0.15的溶剂，则本发明的结晶一水合物盐保持热力学稳定性，并且不会转变成该化合物的无水形式。相应地，在0.10或更小的相对湿度或水活度（water activity）条件下，本发明的固体转变成盐的无水形式，而在0.15和高于0.15的相对湿度或水活度（water activity）条件下，固体转变成盐的一水合物形式。因此，本发明组合物的结晶一水合物盐形式可以与水活度大于0.15的溶剂或其它药物载体以及相对湿度大于0.15的环境结合，并且该结晶一水合物不会转变成该化合物的无水形式，从而确保热力学稳定性。本文使用的术语“高湿度”或“高水活度”环境包括相对湿度或水活度为0.15或更大的所有环境。应注意，所有的水活度数据是在环境条件下测定的。对于本文讨论的水活度和所有其它参数，通常将环境条件定义为包括大约20℃的温度和大约一个大气压的压力。

图4说明了本发明化合物在各种水活度和相对湿度大于0.15的环境中的稳定性。具体地说，图4给出了具有不同水活度的各种悬浮体的粉末X射线衍射图。具体地说，图4说明了在水活度为0.10至0.15范围时一水合物盐向无水盐的转变。在实施例6中，更详细地解释了产生图4的方法。

对于本文使用的术语“基本上纯”，当用于(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐时，是指纯度大于大约90%的盐。(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的其它形式不含有大约10%以上的任何其它化合物，尤其是，不含有大约10%以上的任何其它形式，例如无定形形式、无水形式、溶剂化物形式、非溶剂化物形式、去溶剂化形式和对映体形式。

更优选，“基本上纯”的盐是指纯度大于大约95%的盐，其中(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的结晶一水合物盐不含有大约5%以上的任何其它化合物，尤其是，不含有大约5%以上的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的任何其它形式，例如无定形形式、无水形式、溶剂化物形式、非溶剂化物形式、去溶剂化形式和对映体形式。

甚至更加优选，“基本上纯”的盐是指纯度大于大约97%的盐，其中(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的结晶一水合物盐不含有大约3%以上的任何其它化合物，尤其是，不含有大约3%以上的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的任何其它形式，例如无定形形式、无水形式、溶剂化物形式、非溶剂化物形式、去溶剂化形式和对映体形式。

作为常规方案，本文包括化学和物理分析的各种方法。利用下面的方式，对样品进行粉末X射线衍射(PXRD)分析。如下制备X射线衍射分析的样品：将样品涂敷在样品架上，形成薄层，用显微镜载玻片将样品轻轻压平。例如，可以用研钵和研棒将样品碾磨成细粉末，或对于有限数量的样品，可以利用玻璃显微镜载玻片。利用下面三个结构之一来操作样品：环形支座、石英零背景板或热平台装配台(类似的安装到零背景板上)。

使用配备有入射光束锗单色仪的Inel G3000衍射仪(提供Cu-K_α ₁辐射)，收集衍射图。在40 kV的电压和30 mA的电流下，操作X射线发生器。Inel G3000安装有能够同时监测所有衍射数据的位置灵敏探测器。以1度间隔，在整个90度2θ范围内，收集七秒钟时间的衰减的直射光束，由此校正检测器。针对硅线位置参考标准(NIST 640c)来检测校准状况。将样品放置在铝样品座上，并与玻璃载玻片保持水平。

或者，可以使用Rigaku Miniflex衍射器(30 kV和15 mA；X射线源：Cu；范围：2.00-40.00°2θ；扫描速率：1-5度/分钟)或Scintag X1或X2衍射器(2千瓦正常聚焦X射线管，带有液氮或Peltier冷却的锗固态检测器；45 kV和40 mA；X射线源：Cu；范围：2.00-40.00°2θ；扫描速率：1-5度/分钟)进行粉末X射线衍射。

按照角位置(2θ)(可以允许±0.20°的变化)来报道特征粉末X射线衍射图峰位置。当比较两个粉末X射线衍射图时，希望使用±0.10°的变化。在实践中，如果一个图的衍射图峰指定了角位置(2θ)的范围(其是测定的峰位置±0.20°)、另一个图的衍射图峰指定了角位置(2θ)的范围(其是测定的峰位置±0.20°)，并且如果峰位置的那些范围重叠，则认为2个峰具有相同的角位置(2θ)。例如，如果测定一个图的衍射图峰具有5.20°的峰位置，为了对比的目的，允许的变化使得指定的峰的位置在5.00°-5.40°范围内。如果测定其它衍射图的对比峰具有5.35°的峰位置，并且允许的变化使得指定的峰的位置在5.15°-5.55°范围内，则认为所比较的2个峰具有相同的角位置(2θ)，这是因为在峰位置的两个范围之间存在重叠。

使用配备有Apex II CCD面积检测器的Bruker Apex II衍射仪(Bruker AXS，Madison，WI)，收集单晶X射线衍射数据。在50 kV和40 mA条件下，用钼阳极管(2.0 kW细焦)操作该衍射仪。入射束硅单色仪提供Mo-K_α ₁单色辐射。在冷氮气流条件下，在100 K，使用Kryoflex低温元件(Bruker AXS)，收集数据。数据收集的束直径是5 mm，检测器隔离是6 cm。使用球形2-二甲基亚硫酰（sufuranylidene）-1,3-茚满二酮(YLID)晶体，检测测角器的准线。使用BIS和Apex 2软件(Version 2008.5-0，Bruker AXS)，用电脑控制仪器。在-100℃收集数据。

利用下面的方式，对样品进行热解重量分析(TGA)。在配备有数据分析仪(Universal Analysis 2000，version 5.4A，TA Instruments)的热天平(Q-500，TA Instruments，New Castle，DE)上收集TGA痕量。在实验期间，用氮气(60 mL/min)吹扫加热炉，同时吹扫(40 mL/min)天平舱。使用镍铝合金和镍的居里点来校正TGA加热炉的温度。通常，实验参数包括：2-20 mg的样品重量，将样品放置在开口的铝盘中；加热速率每分钟10℃；将样品从25℃加热至200℃。

动态水分吸附平衡(DMSB)用于评价结晶一水合物化合物的吸湿性。使用配备有数据分析仪的动态水分吸附平衡(IGAsorp，Hiden Isochema)来评价吸湿性。使用20、50和100 mg的标准重量来校正天平。使用氯化锂、碳酸钾和氯化钠的标准盐溶液来校正RH探头。在实验期间，不同相对湿度下的氮气流速是250 mL/min。对于无水物质，首先将样品在50℃下用干燥氮气干燥两个小时。然后将温度调整到25℃，相对湿度以10%的间隔从0%改变至90%，并回到0%。对于水合样品，将温度调整到25℃，以10%的间隔将相对湿度从30%改变至90%，回到10%，然后达到90%。对于本文所描述的每个步骤，使用一个小时的平衡时间。

通过将不同比例的有机溶剂和水混合，可以测定一水合物盐的临界水活度。这些溶剂混合物的水活度分析与温度有关。临界水活度的测定典型地包括下列步骤：(1)制备具有一定范围水活度的溶剂混合物；(2)用一水合物盐使有机溶剂/水混合物饱和；(3)任选将该饱和溶液过滤；(4)向该饱和有机溶剂/水混合物中加入无水和水合相的1:1固体混合物(例如，25 mg/相)；(5)在研究的温度平衡(3-5天)；和(6)利用本领域技术人员了解的合适技术(例如，PXRD)，分析残留的固体，从而测定稳定相的同一性。

制备本发明化合物的方法

本发明还包括制备化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的方法。形成柠檬酸二氢盐的一水合物形式的方法可以使用(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷作为起始原料。或者，可以使用柠檬酸二氢盐无水化合物。正如在共同待定‘336公开中所详细讨论的那样，制备化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷游离碱和柠檬酸二氢盐无水化合物的各种方法是已知的，本文以引证的方式将它们结合。本领域技术人员可以理解，按照常规方法制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的游离碱和柠檬酸二氢盐无水形式的其它方法也在本发明范围内。

正如上面所提到的那样，在一个实施方案中，本发明包括由起始原料制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的方法，起始原料包括(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷。该方法包括下列步骤：将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐固体悬浮在溶剂中；将该悬浮液密封足够的时间，使形成晶体；从该悬浮液中收获或回收晶体。通常，在环境条件(室温)下进行该方法；然而，为了获得所需要的或其它结果，本领域技术人员可以根据需要来调节温度。通常，本发明的溶剂包括水和至少一种其它溶剂的组合物。水和至少一种其它溶剂的组合物典型地具有大于0.10的临界水活度。在该方法中，可以与水组合的合适溶剂包括但不局限于：脂肪醇(本文使用的“脂肪醇”是指低级烷基醇，对于短语“低级烷基”，参照C₁-C₆烷基。脂肪醇的例子包括但不局限于：甲醇，乙醇，2-丙醇(IPA，亦称异丙醇)，丁醇，等等)，丁醇乙腈(ACN)，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯(IPAc)，四氢呋喃(THF)，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚(MTBE)，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮(MEK)，二甲亚砜(DMSO)，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯，乙酸乙酯，甲酰胺/乙醇混合物(1:1)，甲酰胺/IPA混合物(1:1)，甲酰胺/ACN混合物(1:1)，甲酰胺/MEK混合物(1:1)，甲酰胺/乙酸乙酯混合物(1:1)，甲酰胺/THF混合物(1:1)，DMSO/甲烷混合物(1:1)，DMSO/IPA混合物(1:1)，DMSO/ACN混合物(1:1)，DMSO/MEK混合物(1:1)，DMSO/甲苯混合物(1:1)，DMSO/乙酸乙酯混合物(1:1)，DMSO/THF混合物(1:1)，DMSO/二氯甲烷混合物(1:1)，甲酰胺/乙醇混合物(1:3)，甲酰胺/ACN混合物(1:3)，甲酰胺/MEK混合物(1:3)，甲酰胺/乙酸乙酯混合物(1:3)，甲酰胺/THF混合物(1:3)，DMSO/硝基甲烷混合物(1:3)，DMSO/乙醇混合物(1:3)，DMSO/ACN混合物(1:3)，DMSO/MEK混合物(1:3)，DMSO/甲苯混合物(1:3)，DMSO/乙酸乙酯混合物(1:3)，DMSO/THF混合物(1:3)，DMSO/二氯甲烷混合物(1:3)，和其组合物。在进一步实施方案中，溶剂包括水与甲醇、乙醇、2-丙醇和丁醇的组合物。

在一个其它实施方案中，本发明包括制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐的方法，该方法包括下列步骤：(a)在大约65℃至大约85℃的温度范围内，将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷溶解在水和至少一种溶剂的组合物中；(b) 在大约30分钟至大约8小时期间内，将该溶液的温度调节到大约55℃至大约75℃的温度范围；(c)向该溶液中加入至少一种其它溶剂，混合大约30分钟至大约8小时时间；(d) 在大约30分钟至大约8小时期间内，将该溶液的温度调节到大约30℃至大约50℃的温度范围；(e) 在大约30分钟至大约8小时期间内，向该溶液中加入至少一种其它溶剂；(f) 在大约30℃至大约50℃的温度范围下，将该浆液保持大约30分钟至大约8小时的时间；(g) 将该浆液的温度调节到大约-5℃至大约15℃的温度范围；(h) 将该浆液混合大约30分钟至大约8小时时间；和(i) 提取(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐。

在该方法的步骤(a)中，本领域技术人员可以理解，该方法使用的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷可以是(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的粗品固体、纯的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷或基本上纯的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷。同样，在该方法的步骤(a)中，本领域技术人员可以理解，可以采用各种的溶剂和固体组合以溶解(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷。溶剂组分通常包括水与至少一种其它溶剂的组合物。水和至少一种其它溶剂的组合物典型地具有大于0.10的临界水活度。在该方法中，可以与水组合的合适的溶剂包括但不局限于：脂肪醇(例如，但不局限于：甲醇，乙醇，2-丙醇(IPA)，丁醇)，丁醇乙腈(ACN)，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺(DMF)，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯(IPAc)，四氢呋喃(THF)，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚(MTBE)，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮(MEK)，二甲亚砜(DMSO)，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯，乙酸乙酯，甲酰胺/乙醇混合物(1:1)，甲酰胺/IPA混合物(1:1)，甲酰胺/ACN混合物(1:1)，甲酰胺/MEK混合物(1:1)，甲酰胺/乙酸乙酯混合物(1:1)，甲酰胺/THF混合物(1:1)，DMSO/甲烷混合物(1:1)，DMSO/IPA混合物(1:1)，DMSO/ACN混合物(1:1)，DMSO/MEK混合物(1:1)，DMSO/甲苯混合物(1:1)，DMSO/乙酸乙酯混合物(1:1)，DMSO/THF混合物(1:1)，DMSO/二氯甲烷混合物(1:1)，甲酰胺/乙醇混合物(1:3)，甲酰胺/ACN混合物(1:3)，甲酰胺/MEK混合物(1:3)，甲酰胺/乙酸乙酯混合物(1:3)，甲酰胺/THF混合物(1:3)，DMSO/硝基甲烷混合物(1:3)，DMSO/乙醇混合物(1:3)，DMSO/ACN混合物(1:3)，DMSO/MEK混合物(1:3)，DMSO/甲苯混合物(1:3)，DMSO/乙酸乙酯混合物(1:3)，DMSO/THF混合物(1:3)，DMSO/二氯甲烷混合物(1:3)和其组合物。在另一个实施方案中，溶剂包括水与甲醇、乙醇、2-丙醇和丁醇的组合物。在进一步优选实施方案中，溶剂包括2-丙醇和水的混合物。至少一种其它溶剂和水的混合物通常分别包括大约20:1至大约1:10的比例。在一个优选实施方案中，至少一种其它溶剂和水的混合物分别包括大约1:1至大约7:1的比例。在更优选实施方案中，2-丙醇和水的混合物包括大约4:1的比例。进一步的，在另一个实施方案中，在大约70℃至大约80℃的温度范围内进行该方法的步骤(a)。在一个优选实施方案中，在大约74℃至大约76℃的温度范围内进行步骤(a)。

先前所描述的该方法的步骤(b)包括冷却该溶液的温度。在该方法的步骤(b)的一个优选实施方案中，在大约30分钟至大约8小时的期间内，将溶液的温度降低到大约60℃至大约70℃的温度范围。然而，本领域技术人员可以理解，在不背离本发明范围的条件下，时间长度可以修改到小于大约30分钟或大于大约8小时。在该方法的步骤(b)的一个更优选实施方案中，将溶液的温度降低到大约64℃至大约66℃的温度范围。

在该方法的步骤(c)中，本领域技术人员还可以理解，可以将各种溶剂(即，一种或一种以上的溶剂)结合进该溶液中。上面结合步骤(a)已经预先描述了可以结合进步骤(c)中的合适溶剂的例子，本文结合它们作为参考。在一个优选实施方案中，溶剂包括脂肪醇(例如，但不局限于：甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇)，水和其混合物。在进一步优选实施方案中，溶剂包括2-丙醇。相对于在步骤(a)期间加入的溶剂数量，在该方法的步骤(c)期间加入的溶剂数量通常在大约1个体积至大约10个体积的范围。在一个优选实施方案中，相对于在步骤(a)期间加入的溶剂数量，在该方法的步骤(c)期间加入的溶剂数量通常在大约2个体积至大约8个体积的范围。在最优选的实施方案中，相对于在步骤(a)期间加入的溶剂数量，在该方法的步骤(c)期间加入的溶剂数量通常在大约5个体积至大约7个体积的范围。

该方法的步骤(d)包括第二阶段，在该阶段中，在如步骤(c)所述混合其它溶剂之后，将该溶液冷却。在步骤(d)的一个优选实施方案中，在大约30分钟至大约8小时期间内，将溶液的温度降低到大约35℃至大约45℃的温度范围。本领域技术人员可以理解，在不背离本发明范围的条件下，时间长度可以修改到小于大约30分钟或大于大约8小时。在步骤(d)的一个更优选实施方案中，将溶液的温度降低到大约39℃至大约41℃的温度范围。

该方法的步骤(e)包括：经过大约30分钟至大约8小时的时间，向该溶液中加入至少一种溶剂。正如先前所陈述的那样，本领域技术人员可以理解，在不背离本发明范围的条件下，时间长度可以调节到小于大约30分钟或大于大约8小时。上面结合步骤(a)已经预先描述了可以结合进步骤(c)中的合适溶剂的例子，本文结合它们作为参考。在一个优选实施方案中，溶剂包括脂肪醇(例如，但不局限于：甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇)，水和其混合物。在进一步优选实施方案中，溶剂包括2-丙醇。相对于在步骤(a)期间加入的溶剂数量，在该方法的步骤(e)期间加入的溶剂数量通常在大约1个体积至大约10个体积的范围。在一个优选实施方案中，相对于在步骤(a)期间加入的溶剂数量，在该方法的步骤(e)期间结合的溶剂数量通常在大约2个体积至大约8个体积的范围。在最优选实施方案中，相对于在步骤(a)期间加入的溶剂数量，在该方法的步骤(e)期间结合的溶剂数量通常在大约4个体积至大约6个体积的范围。

在步骤(e)中加入溶剂之后，该方法的步骤(f)涉及保持浆液的温度。本领域技术人员可以理解，在步骤(f)中保持的温度应该与步骤(d)中形成的温度一致。

该方法的步骤(g)包括：在大约30分钟至大约8小时期间内，将浆液制剂冷却到大约-5℃至大约15℃的温度范围内。然而，本领域技术人员可以理解，在不背离本发明范围的条件下，时间长度可以调节到小于大约30分钟或大于大约8小时。在步骤(g)的一个优选实施方案中，将溶液的温度降低到大约0℃至大约10℃的温度范围。在步骤(d)的一个更优选实施方案中，将溶液的温度降低到大约4℃至大约6℃的温度范围。

该方法的步骤(h)包括：将冷却的浆液混合大约30分钟至大约8小时时间。本领域技术人员可以理解，在不背离本发明范围的条件下，混合的时间周期可以根据反应条件而改变。本领域技术人员可以理解，可以使用本领域已知的任何混合方法，包括混合浆液的手动和自动形式。

最后，该方法的步骤(i)涉及从浆溶液中回收(例如，提取)(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐结晶一水合物盐。在一个优选实施方案中，回收方法(提取)包括额外的干燥和过滤步骤。技术人员可以理解，可以利用本领域已知的任何方法来进行干燥和过滤晶体的方法。通常，回收方法包括：在大约40℃至大约70℃的温度范围内，干燥时间为大约一个小时至大约二十四小时。

在进一步实施方案中，本发明包括：制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物盐的方法，该方法使用该化合物的无水形式作为起始原料。该方法包括下列步骤：(a) 在反应容器中，使无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐固体与溶剂接触，该溶剂包括水和至少一种其它溶剂的组合物，其中该组合物的水活度大于0.1；(b) 将该反应容器密封，避免该悬浮液在环境条件下接触光；和(c)回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的结晶一水合物盐。制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的无水产品的各种方法公开在待定美国公开No. 2008/0167336中，本文以引证的方式将它们全部结合。通常将该方法的步骤(a)使用的溶剂定义为能够溶解(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的无水盐的任何有机溶剂、水或其混合物。可以在要求的方法中使用的合适的溶剂例子包括但不局限于：脂肪醇(例如，但不局限于：甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，等等)，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯，水和其混合物。在优选实施方案中，溶剂包括水。在另一个优选实施方案中，溶剂包括有机溶剂和水的混合物，由此，有机溶剂可以包括先前引用的任何有机溶剂。

本领域技术人员可以理解，在上述方法中使用的无水固体数量根据技术人员所探索的确切参数而变化。相应地，与溶剂混合的无水溶剂的数量根据所选择的具体溶剂而变化。通常，每毫升溶剂，无水固体的数量可以在大约1 mg至大约1000 mg无水固体的范围。在一个优选实施方案中，每毫升溶剂，无水固体的数量可以在大约10 mg至大约500 mg无水固体的范围。在一个更优选的实施方案中，每毫升溶剂，无水固体的数量为大约90 mg。另外，为了在大约40℃至大约70℃高温下溶解无水固体，本方法使用5个体积的溶剂。然后，将该溶液冷却至环境温度，并将该溶液播晶种。随后，加入6个体积的逆溶剂(总共11个体积的溶剂)，再次冷却结晶浆液，并采集晶体。本领域技术人员可以理解，逆溶剂可以包括能够降低溶液溶解性、因此促进晶体形成的任何溶剂。

技术人员可以进一步理解，本发明可接受能够容纳反应混合物同时不影响反应的任何反应容器。进一步的，为了避免反应混合物在环境条件下接触光，可以利用本领域已知的任何方法来密封反应容器，包括石蜡膜。另外，技术人员可以理解，进行反应的时间的数量应该足以使无水形式转化为化合物的结晶一水合物形式。如前所述，通常将环境条件定义为大约20℃的温度和大约一个大气压的压力。

最后，本领域技术人员可以理解，可以利用本领域已知的任何方法，回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的一水合物晶体。回收方法的具体例子包括过滤和干燥法。过滤方法和干燥时间和干燥温度可以根据已知的方法而变化。

本发明的药物组合物

本发明还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物与可药用载体的联用形式。该组合物包含与一或多种无毒的可药用载体一起配制的本发明化合物。本领域技术人员可以理解，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的治疗有效量可以根据所设想的药物产品的应用类型来变化。然而，在优选实施方案中，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的浓度在组合物重量的大约0.1%至大约99%的范围。

本文使用的术语“可药用载体”是指任何类型的无毒的惰性固体、半固体或液体填料、稀释剂、密封材料或制剂助剂。可以充当可药用载体的物质的一些实例是，例如，乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄芪胶；麦芽；明胶；滑石粉；可可脂和栓剂石蜡；油，例如花生油，棉子油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格溶液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及其它无毒的相容的润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及根据制剂领域技术人员的判断，着色剂、防粘剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。

本发明的药物组合物可以给予人及其它哺乳动物，采用下列形式：口服，直肠给予，胃肠外给予，脑池内给予，阴道内给予，腹膜内给予，局部给予(利用粉剂、软膏剂或滴剂)，经颊给予或口腔或鼻喷入给予。本文使用的术语“胃肠外”是指给药模式，其包括静脉内给药、肌内给药、腹腔内给药、胸骨内给药、皮下给药、关节内注射和输液。

用于肠胃外注射的药物组合物包括可药用无菌水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂和重组为无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括：水，乙醇，多元醇(丙二醇，聚乙二醇，丙三醇，等等，和其合适混合物)，植物油(例如橄榄油)和注射用有机酯，例如油酸乙酯，或其合适混合物。可以保持组合物的合适流动性，例如，利用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下保持所需粒径，和利用表面活性剂。

这些组合物还可以包含佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。利用各种抗菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸、氯丁醇、酚、山梨酸等等，可以防止微生物的作用。还合乎需要的是，包含等渗试剂，例如糖、氯化钠等等。通过利用延迟吸收试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长吸收注射药物形式。

在某些情况下，为了延长药物效果，使皮下或肌肉注射的药物减缓吸收常常是合乎需要的。这种效果可以通过利用具有水溶解性差（poor water solubility）的晶体或非晶形物质的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率取决于它的溶解速度，溶解速度又可能取决于晶体大小和结晶形式。或者，胃肠外给药形式可以通过将药物溶解或悬浮在油性赋形剂中来给予。

除了活性化合物之外，混悬液还可以包含悬浮剂，例如乙氧基化的异十八烷醇，聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨醇酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂，黄芪胶和其混合物。

如果需要的话，并且为了更有效分布，可以将本发明的化合物合并到缓释或靶向递送系统中，例如聚合母体、脂质体和微球体。可以用下列方式将它们消毒：例如，通过保持细菌的过滤器进行过滤，或在无菌固体组合物形式中引入杀菌剂，该固体组合物可以在临用前很快溶于无菌水或其它无菌注射介质中。

注射长效（depot）形式是如下制备的：在可生物降解的聚合物例如聚交酯-聚乙交酯中形成药物的微囊密封的基质形式。根据药物与聚合物的比例和所使用具体聚合物的性质，可以控制药物释放的速度。其它可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物收集在脂质体或微乳状液(其与身体组织相容)中来制备长效注射制剂。

可以用下列方式将注射制剂消毒：例如，通过容纳细菌的过滤器进行过滤，或在无菌固体组合物形式中引入杀菌剂，该固体组合物可以在临用前很快溶于无菌水或其它无菌注射介质中。

可以按照本领域已知的方法，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制注射制剂，例如无菌注射的水或油混悬剂。无菌注射制剂还可以是在无毒、胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液剂、混悬剂或乳剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液剂。在可接受的载体和溶剂之中，可以使用水、林格溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，可以传统地使用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。对于这种目的，可以使用任何柔和的不挥发油，包括合成的单或二甘油脂。此外，也可以在注射制剂中使用脂肪酸例如油酸。

口服固体剂型可以包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，一或多种本发明的化合物与至少一种惰性可药用载体例如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或下列混合：a)填料或扩充剂，例如淀粉，乳糖，蔗糖，葡糖，甘露糖醇和水杨酸；b)粘合剂，例如，羧甲纤维素，海藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和阿拉伯胶；c)湿润剂，例如丙三醇；d)崩解剂，例如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐，和碳酸钠；e)溶解阻滞剂，例如石蜡烃；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)湿润剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，例如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。

在软和硬明胶胶囊(使用乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇)中，还可以使用相似类型的固体组合物作为填料。

可以用包衣和壳（例如肠溶衣及药物配制领域熟知的其它包衣）来制备片剂、糖锭、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们还可以任选包含遮光剂，并且还可以只在或优先在肠道的某一部分以延迟方式释放活性组分的组合物。可用于延迟释放活性剂的物质的实例包括聚合物和石蜡。

对于直肠或阴道给予的组合物，优选栓剂，其可以如下制备：将本发明的化合物与合适的无刺激性载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂石蜡（其在环境温度是固体，但在体温下是液体，并因此在直肠或阴道]腔中融化，释放活性化合物）混合。

口服液体剂型包括可药用乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型还可以包含本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)，丙三醇，四氢呋喃基醇，聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，和其混合物。

除惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包含佐剂，例如湿润剂，乳化和悬浮剂，甜味剂，调味剂和芳香剂。

用于局部或透皮给予本发明化合物的剂型包括软膏剂，糊剂，乳膏剂，洗剂，凝胶剂，粉剂，溶液剂，喷雾剂，吸入剂或贴片。可以按照需要，在无菌条件下，将本发明的目标化合物与可药用载体和任何需要的防腐剂或缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂、眼膏、粉剂和溶液剂也包括在本发明范围之内。

除了本发明的活性化合物之外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可以包含动物和植物脂肪，油类，石蜡，石蜡烃，淀粉，黄芪胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅氧烷，膨润土，硅酸，滑石粉和氧化锌，或其混合物。

除了本发明的化合物之外，粉剂和喷雾剂还可以包含乳糖，滑石粉，硅酸，氢氧化铝，硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有常规发射剂，例如氯氟烃。

本发明的化合物还可以以脂质体形式给予。正如本领域已知的那样，脂质体通常衍生自磷脂或其它脂质物质。脂质体是由分散在水介质中的单或多层水合的液晶形成的。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学容许的和可代谢的脂质。除了本发明的化合物之外，脂质体形式的本组合物还可以含有稳定剂、防腐剂，等等。优选的脂质是单独或一起使用的天然和合成磷脂和磷脂酰胆碱 (卵磷脂)。

形成脂质体的方法在本领域是已知的。参见，例如，Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N. Y.,(1976), p 33 et seq。

用于局部给予本发明化合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂和吸入剂。在无菌条件下，将活性化合物与可药用载体和任何必要的防腐剂、缓冲剂或发射剂混合。预期眼用制剂、眼膏、粉剂和溶液剂也包括在本发明范围之内。还特别有用的是本发明的含水液体组合物。

本文使用的术语“可药用前体药物”或“前体药物”表示本发明化合物的那些前体药物，在可靠的医学判断范围内，其适合与人和低等动物的组织接触，没有过分的毒性、刺激性、变态反应等等，与合理的益处/危险比例相称（compensate），并且对于它们的目标用途是有效的。本发明的前体药物可以快速地体内转变为(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的母体化合物，例如，在血液中水解。详尽的讨论提供于下列中：T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, V. 14 of the A.C.S. Symposium Series和Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press(1987)。

本发明还预期包括下述可药用化合物，当给予需要的患者这种化合物时，其可以通过体内生物转化作用而转变为式(I)的化合物。

生物活性的测定

为了测定(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物作为α7 nAChRs的配体的效果，按照[³H]-甲基牛扁亭(MLA)结合试验或[³H]-DPPB结合试验来评价本发明的化合物。为了测定代表性的本发明化合物作为α4β2 nAChRs的配体的效果，按照如下所述进行的[³H]-野靛碱结合试验来评价本发明的化合物。

[³H]- 野靛碱结合

利用Pabreza LA，Dhawan，S，Kellar KJ，[³H]-Cytisine Binding to Nicotinic Cholinergic Receptors in Brain，Mol. Pharm. 39：9-12，1991所描述方法，按照对其改变的条件，测定与α4β2 nAChR亚型的结合。在4℃，将大鼠脑(去掉小脑)的膜富集部分(ABS Inc., Wilmington，DE)慢慢地解冻，洗涤，并再悬浮在30个体积的BSS-Tris缓冲液(120 mM NaCl/5 mM KCl/2 mM CaCl₂/2 mM MgCl₂/50 mM Tris-Cl，pH7.4，4℃)中。将含有100-200µg蛋白和0.75 nM[³H]-野靛碱(30 C_i/mmol；Perkin Elmer/NEN Life Science Products，Boston，MA)的样品在500µL最终体积中、在4℃培养75分钟。试验每个化合物的七个对数-稀释浓度(一式两份)。在10µM(-)-烟碱的存在下，测定非特异性的结合。如下分离所结合的放射性：使用96孔过滤装置(Packard Instruments，Meriden，CT)，真空过滤到预先湿润的玻璃纤维过滤板(Millipore，Bedford，MA)上，然后快速地用2 mL冰冷的BSS缓冲液(120 mM NaCl/5 mM KCl/2 mM CaCl₂/2 mM MgCl₂)冲洗。将Packard MicroScint-20^®闪烁混合物(40μL)加入到每个孔中，并使用Packard TopCount^®仪器测定放射性。利用Microsoft Excel^®软件，通过非线性回归来测定IC₅₀值。使用Cheng-Prusoff方程式，由IC₅₀值计算K_i值，其中Ki=IC₅₀值/(1+[配体]/K_D)。

[³H]- 甲基牛扁亭 (MLA) 结合

按照与[³H]-野靛碱结合试验所使用条件相似的条件，测定与α7 nAChR亚型的结合。在4℃，将大鼠脑(去掉小脑)的膜富集部分(ABS Inc., Wilmington，DE)慢慢地解冻，洗涤，并再悬浮在30个体积的BSS-Tris缓冲液(120 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl₂，2 mM MgCl₂和50 mM Tris-Cl，pH7.4，22℃)中。将含有100-200µg蛋白、5 nM[³H]-MLA(25 C_i/mmol；Perkin Elmer/NEN Life Science Products，Boston，MA)和0.1%牛血清白蛋白(BSA，Millipore，Bedford，MA)的样品在500µL的最终体积中、在22℃培养60分钟。试验每个化合物的七个对数稀释浓度(一式两份)。在10µM MLA的存在下，测定非特异性的结合。如下分离结合的放射性：使用96孔过滤装置(Packard Instruments，Meriden，CT)，真空过滤到预先用2% BSA湿润的玻璃纤维过滤板上，然后快速地用2 mL冰冷的BSS冲洗。将Packard MicroScint-20^®闪烁混合物(40μL)加入到每个孔中，并使用Packard TopCount^®仪器测定放射性。利用Microsoft Excel^®软件，通过非线性回归来测定IC₅₀值。使用Cheng-Prusoff方程式，由IC₅₀值计算K_i值，其中K_i=IC₅₀值/(1+[配体]/K_D)。

[³H]-DPPB 结合

使用大鼠脑(去掉小脑)或人脑皮层的膜富集部分(ABS Inc.，Wilmington，DE)，测定与α7 nAChR亚型结合的[³H]-DPPB([³H]-(S,S)-2,2-二甲基-5-(6-苯基-哒嗪-3-基)-5-氮杂-2-氮鎓-二环[2.2.1]庚烷碘化物)。将颗粒在4℃解冻，洗涤，并用Polytron(设定7)再悬浮在30个体积的BSS-Tris缓冲剂(120 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl₂，2 mM MgCl₂和50 mM Tris-Cl，pH7.4，22℃)中。将含有100-200µg蛋白和0.5 nM[³H]-DPPB(62.8 C_i/mmol；R46V，Abbott Labs)的七个对数稀释浓度的试验化合物在500µl的最终体积中、在4℃培养75分钟(一式两份)。在10µM甲基牛扁亭的存在下，测定非特异性的结合。使用Packard细胞收集器，将结合的放射性收集在预先用0.3% PEI浸渍的Millipore MultiScreen®采集板FB上，用2.5 ml冰冷的缓冲剂洗涤，并使用Packard TopCount Microplate β计数管来测定放射性。利用Microsoft® Excel或Assay Explorer，通过非线性回归来测定IC₅₀值。使用Cheng-Prusoff方程式，由IC₅₀值来计算K_i值，其中K_i=IC₅₀值/(1+[配体]/K_D)。按照如下所述的制备方法，获得[³H]-DPPB。

[ 甲基 -³H]2,2- 二甲基 -5-(6- 苯基 - 哒嗪 -3- 基 )-5- 氮杂 -2- 氮鎓 - 二环 [2.2.1] 庚烷；碘化物制备

按照下列方法，制备上面[3H]-DPPB结合试验中使用的[甲基-³H]2,2-二甲基-5-(6-苯基-哒嗪-3-基)-5-氮杂-2-氮鎓-二环[2.2.1]庚烷；碘化物。

步骤 1 ：制备 (S,S)-5-(6- 苯基 - 哒嗪 -3- 基 )-2,5- 二氮杂 - 二环 [2.2.1] 庚烷 -2- 甲酸叔丁基酯

将三乙胺(20 mL)加入到(S,S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁基酯(3.43 g，17.3 mmol，Aldrich Chemical Company)和3-氯-6-苯基哒嗪(3.30 g，17.3 mmol，Aldrich Chemical Company)的甲苯(50 mL)悬浮液中，并将该混合物在氮气氛围中、在100℃下加热7天。将该黑色混合物冷却至室温，并过滤分离得到的沉淀，用甲苯(15 mL)洗涤，真空干燥，提供标题化合物类白色固体(3.00 g)。浓缩滤液，并将残余物用硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯洗脱，提供副产物(0.41 g，总产率3.41 g，56%)：MS(DCI/NH₃)m/z 353(M+H)⁺。

步骤 2 ：制备 (S,S)-2- 甲基 5-(6- 苯基 - 哒嗪 -3- 基 )-2,5- 二氮杂 - 二环 [2.2.1] 庚烷

将步骤1获得的产物(3.41 g，9.7 mmol)溶于甲酸(20 mL)中，并用福尔马林(37%重量，1.0 g，12.3 mmol)处理。将该混合物在100℃下加热1小时，并将该褐色溶液冷却至室温，真空浓缩。用硅胶柱色谱纯化残余物，用CH₂Cl₂-CH₃OH-NH₄OH(95:5:1)洗脱，提供标题化合物的类白色固体(2.50 g，96%)： MS(DCI/NH₃)m/z 267(M+H)⁺。

步骤 3 ：制备 [³H]-(S,S)-2,2- 二甲基 -5-(6- 苯基 - 哒嗪 -3- 基 )-5- 氮杂 -2- 氮鎓 - 二环 [2.2.1] 庚烷碘化物 ([³H]-DPPB)

将[³H]甲基碘/甲苯(250 mCi，0.1 mL，85 Ci/mmol，American Radiolabeled Chemicals, Inc.)与步骤2获得的产物的二氯甲烷(0.788 mg，2.96 μmole，0.45 mL)溶液混合。封盖该管瓶，并使该混合物在室温下反应过夜。加入甲醇，并将溶剂蒸发，得到42 mCi。将产物吸收在甲醇中，用于HPLC纯化。

步骤 4 ：高效液相色谱 (HPLC) 纯化

将大约7 mCi的[3H]-DPPB蒸干，并将残余物溶于总计大约4.5 mL的乙腈：水：TFA(15:85:0.1)中。使用Agilent HPLC系统，在Phenomenex Luna C18(2)柱(5微米，250 mm x 4.6 mm ID)上，每次注射大约0.9 mL。用10% B至20% B的梯度移动相用20分钟洗脱[³H]-DPPB ，其中移动相A=0.1%三氟乙酸/水，移动相B=0.1%三氟乙酸/乙腈，流速大约1 mL/min。用Agilent可变波长UV检测器(设置在275 nm)，获得峰值检测和色谱图。使用Agilent级分收集器，在大约14分钟时，收集含有[³H]-DPPB的级分。将级分合并，并将溶剂真空蒸发。将残余物溶于200 合乎标准的（proof）乙醇(2 mL)中，得到0.7 mCi。

步骤 5 ：测定纯度和比活性

使用Agilent 1100系列HPLC系统(由四元泵、自动进样器和光电二极管阵列UV检测器组成)，检验[³H]-DPPB。将Packard Radiomatic A 500放射性检测器连接到HPLC系统上。为了放射检测（radiodetection），对于HPLC移动相使用500μL流动池和3:1比例的Ultima-Flo M闪烁混合物。使用Phenomenex Luna C18(2)柱(5微米，250 mm x 4.6 mm ID)进行分析。移动相由下列组成：梯度起点10% B，用20分钟匀变至20% B，而后用1分钟匀变至90% B，保持90% B 9分钟，其中移动相A=0.1%三氟乙酸/水，移动相B=0.1%三氟乙酸/乙腈。流速设置在大约1 mL/min，UV检测设置在275 nm。

当利用[³H]-MLA试验进行检测时，优选的本发明化合物具有大约0.1纳摩尔至大约10微摩尔的K_i值，许多具有小于1微摩尔的K_i值。其它优选的化合物显示了本发明化合物的[³H]-野靛碱结合值在大约0.1纳摩尔至至少10微摩尔的范围。相比于α4β2受体，一些优选的化合物对α7受体显示了更大的效能。考虑到[³H]-野靛碱结合所测定的K_i值，测定这种优选化合物典型地研究MLA试验所测定的K_i值，使得在式D=K_i ³ _H- _野靛碱/K_iMLA中，D大于大约50。或者，可以使用[³H]-DPPB试验所测定的K_i值来代替K_{i
MLA}，使得在式D’=K_i ³ _H- _野靛碱/K_i[_3H]-DPPB中，D’大于大约50。

本发明的化合物是α7 nAChRs配体和/或α4β2配体，它们通过改变受体或信号的活性，来调节α7 nAChRs和/或α4β2配体的功能。该化合物可以是抑制受体的基础活性的反向激动剂，或完全阻断受体活化激动剂的作用的拮抗剂。该化合物还可以是部分地阻断或部分地活化α7 nAChR受体的部分激动剂，或活化受体的激动剂。与α7烟碱样受体结合还引发关键信号过程，包括各种激酶和磷酸酶和蛋白-蛋白相互作用，这对于记忆、细胞保护、基因转录和疾病改善具有重要效果。

本发明的方法

本发明的化合物和组合物可有效用于调节nAChRs的效果，且更尤其是α7 nAChRs的效果。尤其是，可以使用本发明的化合物和组合物来治疗或预防α7 nAChRs调节的病症。典型地，在哺乳动物中，这种病症可以通过选择性调节α7 nAChRs而得到改善，优选，给予本发明的化合物或组合物，既可以单独给予、也可以与其它活性剂联合给予，例如，作为治疗方案的一部分。

此外，本发明涉及治疗或预防α7烟碱样乙酰胆碱受体、α4β2烟碱样乙酰胆碱受体或α7和α4β2烟碱样乙酰胆碱受体两者所调节的病症、障碍或缺陷的方法，其中病症、障碍或缺陷选自记忆障碍，认知障碍，神经变性，或神经元发育障碍或其组合形式，该方法包括：给予式(I)的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的结晶盐。

其中该盐包括具有式(II)的柠檬酸二氢盐

。

本发明还包括治疗或预防α7烟碱样乙酰胆碱受体所调节的病症或障碍的方法，该方法包括给予化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的步骤，其中病症或障碍选自记忆障碍、认知障碍、神经变性和神经元发育障碍。

本发明还包括治疗或预防α7烟碱样乙酰胆碱受体所调节的病症或障碍的方法，该方法包括给予化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的步骤，其中病症或障碍选自：注意力缺陷障碍，注意缺陷多动障碍(ADHD)，阿尔海默氏疾病(AD)，轻微认知损害，精神分裂症，老年痴呆，AIDS痴呆，皮克氏病，与Lewy体相关的痴呆，与唐氏综合征（Down’s syndrome）相关的痴呆，肌萎缩性侧索硬化，Huntington's疾病，与外伤性脑损伤相关的CNS功能削弱，急性疼痛，手术后疼痛，慢性疼痛和炎症性疼痛。

本发明还包括治疗或预防α7烟碱样乙酰胆碱受体所调节的病症或障碍的方法，该方法包括给予化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的步骤，其中病症或障碍是精神分裂症。

本发明还包括治疗或预防α7烟碱样乙酰胆碱受体所调节的病症或障碍的方法，该方法包括给予化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物与非典型性的抗精神病药的联用药的步骤。

本发明还包括治疗或预防α7烟碱样乙酰胆碱受体所调节的病症或障碍的方法，该方法包括给予化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的步骤，其中病症或障碍是：不孕，循环缺乏，与创伤愈合相关的新血管生长的需要，更尤其是血管闭塞周围的循环，与皮肤移植的血管形成相关的新血管生长的需要，缺血，炎症，尤其是与类风湿性关节炎相关的炎症，创伤愈合，及其它与糖尿病相关的并发症。

本发明还包括治疗或预防α7和α4β2烟碱样乙酰胆碱受体两者所调节的病症或障碍的方法，该方法包括给予化合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的步骤，其中病症或障碍选自α7和α4β2烟碱样受体两者所涉及的一组障碍。这些包括：注意力缺陷障碍，注意缺陷多动障碍(ADHD)，阿尔海默氏疾病(AD)，轻微认知损害，精神分裂症，老年痴呆，AIDS痴呆，皮克氏病，与Lewy体相关的痴呆，与唐氏综合征（Down’s syndrome）相关的痴呆，肌萎缩性侧索硬化，Huntington's疾病，炎症，各种类型的关节炎，戒烟，戒除烟碱的综合症，外伤性脑损伤，急性疼痛，手术后疼痛，骨关节炎疼痛，神经性和炎症性的慢性疼痛状态。

用于本发明方法的化合物(包括但不局限于实施例中所列举的那些化合物或具体命名的化合物)可以调节nAChRs，并且通常对于nAChRs具有亲合性，且更尤其是α7 nAChRs。作为α7 nAChRs配体，本发明的化合物可有效用于治疗或防止许多α7 nAChR介导的疾病或病症。某些本发明的化合物除了对于α7 nAChRs具有亲合性之外，还对于α4β2 nAChRs具有亲合性。

例如，已经证明，α7 nAChRs在提高认知功能方面起到显著的作用，包括学习、记忆和注意力方面(Levin, E.D., J. Neurobiol. 53: 633-640, 2002)。因此，α7配体适合于治疗与记忆和/或认知相关的病症和障碍，包括，例如，注意力缺陷障碍，注意缺陷多动障碍(ADHD)，阿尔海默氏疾病(AD)，轻微认知损害，老年痴呆，AIDS痴呆，皮克氏病，与Lewy体相关的痴呆和与唐氏综合征（Down’s syndrome）相关的痴呆，以及与精神分裂症相关的认知缺陷。

此外，已经证明，含有α7的nAChRs涉及体外(Jonnala，R.B.and Buccafusco，J. J., J. Neurosci. Res. 66：565-572，2001)和体内(Shimohama，S.等人，Brain Res. 779：359-363，1998)烟碱的细胞保护效果。更尤其是，神经变性构成一些渐进性CNS障碍的基础，包括但不限于：阿尔海默氏疾病，帕金森氏症，肌萎缩性侧索硬化，Huntington's疾病，与Lewy体相关的痴呆，以及由外伤性脑损伤引起的CNS功能削弱。例如，由于β-淀粉样蛋白肽造成的α7 nAChRs的功能削弱(与阿尔茨海默氏病有关)已指出是形成与疾病相关的认知缺陷的主要因素(Liu, Q.-S., Kawai, H., Berg, D. K., PNAS 98: 4734-4739, 2001)。α7选择性配体可以影响能够导致tau蛋白的磷酸化降低的神经保护途径，在各种tau相关的病变(例如阿尔海默氏疾病和各种其它痴呆)中，形成神经纤维缠结需要tau蛋白的过磷酸化(Bitner等人，Soc. Neuroscience, 2006 abst 325.6)。已经证明，α7 nAChRs的活化可以阻断这种神经毒性(Kihara, T.等人，J. Biol. Chem. 276: 13541-13546, 2001)。因此，能够提高α7活性的选择性配体可以对抗阿尔海默氏及其它神经变性疾病的缺陷。

α7 nAChRs还涉及神经发育方面，例如，脑的神经形成(Falk, L.等人，Developmental Brain Research 142:151-160, 2003; Tsuneki, H.,等人，J. Physiol.(London)547:169-179, 2003; Adams, C.E.,等人，Developmental Brain Research 139:175-187, 2002)。因此，α7 nAChRs可有效用于预防或治疗与神经发育削弱相关的病症或障碍，例如精神分裂症(Sawa A., Mol. Med. 9:3-9, 2003)。

已经证明，对于α4β2神经元烟碱样受体(NNRs)具有高亲合性的一些化合物，在与注意力缺陷多动障碍(attention-deficit/hyperactivity disorder)(ADHD)、以机能亢进的核心症状为特征的疾病、疏忽和冲动行为有关的临床前模型中，可以改善注意和认知行为。例如，ABT-418(α4β2 NNRs的完全激动剂)在各种临床前认知模型中是有效的。通常，在32个成人的可控临床试验中，透皮给予的ABT-418表明可有效治疗ADHD，尤其是注意力/认知缺陷(Wilens, T.E.; Biederman, J.; Spencer, T.J.; Bostic, J.; Prince, J.; Monuteaux, M.C.; Soriano, J.; Fince, C.; Abrams, A.; Rater, M.; Polisner, D. The American Journal of Psychiatry(1999)156(12), 1931-1937.)。同样，ABT-418在前期阿尔海默氏疾病实验中显示出效果信号。已经表明，ABT-089(α4β2选择性部分激动剂)在啮齿类动物和灵长类动物模型中可改善注意力、学习和记忆缺陷。 ABT-089和另一个α4β2激动剂ispronicline在临床前期实验中已经显示了效果。除了认知能力之外，与α4β2 nAChRs相互作用的化合物例如ABT-594等等，在疼痛的临床前和临床模型中也是有效的。因此，在疾病状态中，例如，涉及认知和注意缺陷、疼痛、神经变性疾病等等的那些疾病状态，调节α7和α4β2两者的活性的配体可以具有广谱治疗效能。

精神分裂症是以感觉、认知能力和情感异常为特征的复杂的疾病。大量证据表明α7 nAChRs与这种疾病有关，包括这些受体在事后患者中测定的缺陷(Sawa A., Mol. Med. 9:3-9, 2003; Leonard, S. Eur. J. Pharmacol. 393: 237-242, 2000)。感官处理(门控)缺陷是精神分裂症的标志之一。可以通过对α7 nAChR起作用的烟碱样配体来使这些缺陷正常(Adler L. E.等人，Schizophrenia Bull. 24: 189-202, 1998; Stevens, K. E.等人，Psychopharmacology 136: 320-327, 1998)。最近的研究表明，α4β2烟碱样受体刺激还可以在感官门控的DBA/2小鼠模型中促进烟碱的效果(Radek等人，Psychopharmacology(Berl). 2006 187:47-55)。由此，α7和α7/α4β2配体显示了治疗精神分裂症的潜力。

在有益的系统功能，例如创伤愈合，皮肤移植的血管形成，和增加循环(例如，提高血管闭塞周围的循环)方面，血管生成(新血管生长所涉及的过程)是重要的过程。已经表明，非选择性的nAChR激动剂例如烟碱可以刺激血管生成(Heeschen, C.等人，Nature Medicine 7: 833-839, 2001)。已经表明，血管生成改善与α7 nAChR的活化有关(Heeschen, C.等人，J. Clin. Invest. 110: 527-536, 2002)。例如，与炎症、缺血、心脏缺血和创伤愈合相关的病症(例如，糖尿病人)的改善与α7 nAChR活性有关(Jacobi, J.,等人，Am. J. Pathol. 161:97-104, 2002)。因此，对于α7亚型具有选择性的nAChR配体提供改善的刺激血管生成的潜力，同时改善副作用特性。

脊髓中的α7或α4β2 nAChRs种群可以调节与烟碱样化合物的疼痛减轻效果相关的神经传递(Cordero-Erausquin, M. and Changeux, J.-P. PNAS 98:2803-2807, 2001)。α7 nAChR和/或α7/α4β2配体显示了治疗疼痛状态的治疗潜力，包括急性疼痛、手术后疼痛以及慢性疼痛状态，包括炎症性疼痛和神经性疼痛。此外，α7 nAChRs在主要巨噬细胞的表面上表达，这种巨噬细胞涉及炎症响应，并且α7受体的活化可以抑制引发炎症响应的TNF及其它细胞素的释放(Wang, H.等人Nature 421: 384-388, 2003)。因此，选择性的α7配体显示出治疗与炎症有关的病症的潜力，包括与各种形式关节炎相关的那些炎症。

哺乳动物精子顶体反应是胞吐过程，这种过程对于精子使卵细胞受精是重要的过程。已经证明，α7 nAChR对精细胞的活化对于顶体反应来说是必要的(Son, J.H. and Meizel, S. Biol. Reproduct. 68: 1348-1353 2003)。因此，选择性的α7药剂显示出治疗生育障碍的应用性。

本发明的化合物尤其可用于治疗和预防影响记忆、认知能力、神经变性、神经发育和精神分裂症的病症或障碍。

与精神分裂症相关的认知损害通常限制患者正常发挥功能的能力，这种症状是由于没有适当地利用普通现有治疗进行治疗所造成的，例如，用非典型的抗精神病药治疗(Rowley, M.等人，J. Med. Chem. 44: 477-501, 2001)。这种认知缺陷与烟碱样胆碱能系统的功能障碍有关，特别是与α7受体的活性降低有关(Friedman, J. I.等人，Biol Psychiatry, 51: 349-357, 2002)。由此，α7受体的活化剂可以在用非典型抗精神病药治疗的精神分裂症患者中为提高认知功能提供有用的治疗。相应地，α7 nAChR配体和非典型抗精神病药的联用药可提供改善的治疗应用性。合适的非典型抗精神病药的具体例子包括但不局限于：氯氮平，利培酮，奥氮平，喹硫平，齐拉西酮，佐替平，伊潘立酮(iloperidone)，等等。

在本发明的药物组合物中，活性组分的实际剂量水平可以变化，以便获得对具体患者、组合物和给药模式可有效实现目标治疗应答的活性组分的量。所选择的剂量水平将取决于具体化合物的活性、给药途径、所治疗病症的严重程度和所治疗患者的状况和先前的医疗史。然而，在本领域技术范围之内，使化合物的剂量从低于实现目标治疗效果所需要的水平开始，并且逐渐增加剂量，直到实现所期望的效果为止。

当在上述或其它治疗中使用时，可以使用可药用盐、酯、酰胺或前体药物形式的治疗有效量的本发明的一种化合物。或者，可以在与一或多种可药用载体的组合中，以含有感兴趣化合物的药物组合物形式给予该化合物。短语本发明化合物的“治疗有效量”是指：在可应用于任何医疗的合理益处/危险比例条件下，治疗障碍所需的化合物的足够数量。然而应该理解，在可靠的医学判断范围内，本发明化合物和组合物的总的日用量取决于主治医师。对于任何具体患者的具体治疗有效剂量水平取决于各种因素，包括：所治疗的障碍和障碍的严重程度；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、通常健康情况、性别和饮食；所使用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄速度；治疗持续时间；与所使用的具体化合物联用或同时使用的药物；和医学领域熟知的类似因素。例如，在本领域技术范围之内，使化合物的起始剂量低于获得目标治疗效果所需要的水平，并且逐渐增加剂量，直到获得所期望的效果为止。

给予人或低等动物的本发明化合物的总的日剂量在大约0.10 μg/kg体重至大约10 mg/kg体重的范围。更优选的剂量可以在大约0.10 μg/kg体重至大约1 mg/kg体重范围之内。如果需要的话，为了给药起见，可以将有效日剂量分成多个剂量。因此，单剂量组合物可以含有组成日剂量的这种数量或其约量（submultiples）。

例如(但不限制于这些)，现在给出本发明的实施例。

实施例1

(4s)-4-(5- 苯基 -1,3,4- 噻二唑 -2- 基氧基 )-1- 氮杂三环 [3.3.1.1^3,7] 癸烷游离碱

为了制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷游离碱单晶体，将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷游离碱(13 mg)溶于1.0 mL的2-丙醇中。慢慢地蒸发溶剂。随着时间的推移，形成(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷游离碱。

实施例2

(4s)-4-(5- 苯基 -1,3,4- 噻二唑 -2- 基氧基 )-1- 氮杂三环 [3.3.1.1^3,7] 癸烷柠檬酸二氢盐

为了制备结晶一水合物形式，重要的是，首先形成化合物的无水盐形式。因此，该实施例涉及形成无水柠檬酸二氢盐的方法。将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷游离碱(63 mg，0.2 mmol)溶于1.0 mL甲醇中。将柠檬酸(41 mg，0.21 mmol)溶于0.5 mL甲醇中。将该柠檬酸溶液加入到(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷游离碱溶液中，同时搅拌。加入之后，从搅拌平皿中移开管瓶，并慢慢地蒸发溶剂。随着时间的推移，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐结晶。

为了制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐单晶体，在50℃，将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐(20 mg)溶于0.8 mL水/2-丙醇(1:6，v/v)中。将该溶液用(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐固体播种，并在密封的管瓶中冷却至环境的温度。随着时间的推移，形成单晶体。

实施例 3

(4s)-4-(5- 苯基 -1,3,4- 噻二唑 -2- 基氧基 )-1- 氮杂三环 [3.3.1.1^3,7] 癸烷柠檬酸二氢盐一水合物

可以按照下列方法，形成一水合物盐。首先，在75℃温度，将无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐溶于4个体积的2-丙醇和1个体积的水中。然后，在不少于30分钟的时间内，将得到的溶剂的温度调节至65℃。一旦所得到的溶液达到65℃，将6个体积的2-丙醇加入到该溶液中，混合至少30分钟。一旦混合，该溶液出现自发核化现象，在2小时以上的期间内，将得到的浆液的温度慢慢地降低至40℃。浆液达到40℃的温度之后，在至少3小时的期间内，将5个体积的2-丙醇加入到该浆液中。向浆液中加入2-丙醇之后，将得到的浆液在40℃的温度保持至少1小时。随后，将该浆液的温度慢慢地调节至5℃，并在5℃混合至少1小时。完成这些步骤之后，通过过滤，收集一水合物固体。

实施例 4

形成 (4s)-4-(5- 苯基 -1,3,4- 噻二唑 -2- 基氧基 )-1- 氮杂三环 [3.3.1.1^3,7] 癸烷柠檬酸二氢盐一水合物

按照下列方法，发明人制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物晶体。首先，将200 mg的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐无水固体悬浮在大约1.0 mL水中。随后，用石蜡膜密封该悬浮液，在环境条件下、在避光保存条件下，在橱柜中保存足够的时间，使其结晶。晶体形成之后，本发明人利用单晶体X射线衍射检测了该晶体，确定该结晶产物是(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物。

实施例 5

按照下列方法，发明人制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物晶体。将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的无水固体悬浮在有机溶剂(例如，甲醇，乙醇，乙腈，等等)和水的混合物中。将该悬浮液在环境条件下平衡之后，该无水化合物转变为化合物一水合物。随后，本发明人过滤提取了化合物一水合物，并利用X射线衍射证明了该一水合物结构。

实施例 6

测定 (4s)-4-(5- 苯基 -1,3,4- 噻二唑 -2- 基氧基 )-1- 氮杂三环 [3.3.1.1^3,7] 癸烷柠檬酸二氢盐形成水合物的临界水活度

本发明人在环境温度测定了(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐一水合物的临界水活度。具体地说，本发明人使结晶产物在甲醇和水的混合物中形成悬浮液，水活度为0.20、0.15、0.10和0.05，对每个悬浮液分别进行粉末X射线衍射图。本发明人还结合了基本上纯的结晶一水合物盐和基本上纯的结晶无水盐的粉末X射线衍射图，并且将所有粉末X射线衍射数据结合到单叠加图上。本发明人将数据结合到单图上，测定无水形式转变成一水合物形式时的水活度点(或点的范围)。

图4(a)-4(f)说明了六个不同制剂的X射线粉末衍射数据。图4(a)说明了由基本上纯的结晶一水合物(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐组成的制剂的X射线粉末衍射图。图4(b)说明了从水活度为0.20的悬浮液中回收的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐固体的X射线粉末衍射图。图4(c)说明了从水活度为0.15的悬浮液中回收的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐固体的X射线粉末衍射图。图4(d)说明了从水活度为0.10的悬浮液中回收的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐固体的X射线粉末衍射图。图4(e)说明了从水活度为0.05的悬浮液中回收的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐固体的X射线粉末衍射图。图4(f)说明了由基本上纯的结晶无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐组成的制剂的X射线粉末衍射图。

对比图4(c)和4(d)，表明了在一水合物的X射线衍射图指征中，相对于无水形式的X射线衍射图指征，有位移。图4(c)和4(d)所列举的图代表从水活度分别为0.15和0.10的悬浮液中收集的固体。因此，本领域技术人员可以理解，当结晶(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐所使用的溶剂的水活度是0.15或更大时，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐将会以一水合物盐的形态存在。然而，如果溶剂包括0.10或更小的水活度，则(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐将会以无水形态存在。

可以理解，上述详细说明和附有的实施例仅仅是说明性的，不应该将其作为本发明范围的限制，本发明只通过附加的权利要求和其等效内容来加以定义。对所公开实施方案的各种改变和修饰对本领域技术人员来说是显而易见的。在不背离本发明的精神和范围的条件下，可以进行这种改变和修饰，包括但不限于与下列有关的那些：化学结构，取代基，衍生物，中间体，合成，制剂和/或本发明的使用方法。

Claims

1.(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物，其中(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷由式(I)代表

其中柠檬酸二氢基团由式(II)代表

。

2.权利要求1的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物，其中该一水合物包含纯度为至少90%的一水合物形式和不高于10%的非一水合物形式。

3.权利要求1的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物，其中该一水合物包含纯度为至少95%的一水合物形式和不高于5%的非一水合物形式。

4.权利要求1的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物，其中该一水合物包含纯度为至少97%的一水合物形式和不高于3%的非一水合物形式。

5.权利要求1的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物，其在粉末X射线衍射图中、在下列2θ度数值处显示至少一个特征峰：8.4 ± 0.20, 11.3 ± 0.20, 14.2 ± 0.20, 15.5 ± 0.20, 16.4 ± 0.20, 16.6 ± 0.20, 17.2 ± 0.20, 19.7 ± 0.20, 20.7 ± 0.20, 21.0 ± 0.20, 21.2 ± 0.20, 21.6 ± 0.20, 24.8 ± 0.20和26.9 ± 0.20。

6.权利要求1的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物，其具有单位晶胞参数，其中a大约为6.52 Å，b大约为20.99 Å，c大约为16.83 Å，α大约为90.0°，β大约为93.75°，γ大约为90.0°，体积大约为2297.52 Å³，Z大约为4。

7.权利要求1的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物，其中当利用动态水分吸收重量分析进行评价时，该一水合物显示了不吸湿的特性，从相对湿度0%至90%，失重小于大约0.2%。

8.治疗或预防由α7烟碱样乙酰胆碱受体、α4β2烟碱样乙酰胆碱受体或由α7和α4β2烟碱样乙酰胆碱受体两者调节的病症、障碍或缺陷的方法，其中病症、障碍或缺陷选自记忆障碍，认知障碍，神经变性和神经元发育障碍，该方法包括：给予治疗合适数量的权利要求1的结晶一水合物。

9.按照权利要求8的方法，其中病症或障碍选自：注意力缺陷障碍，注意缺陷多动障碍(ADHD)，阿尔海默氏疾病(AD)，轻微认知损害，精神分裂症，年龄相关的记忆损害(AAMI)，老年痴呆，AIDS痴呆，皮克氏病，与Lewy体相关的痴呆，与唐氏综合征（Down’s syndrome）相关的痴呆，肌萎缩性侧索硬化，Huntington's疾病，戒烟，烟碱戒除综合症，情感分裂性精神障碍，双相和躁狂障碍，与外伤性脑损伤相关的CNS功能削弱，急性疼痛，手术后疼痛，慢性疼痛，炎症性疼痛和神经性疼痛。

10.按照权利要求8的方法，其中病症或障碍是与注意力缺陷多动障碍相关的认知缺陷，精神分裂症，阿尔海默氏疾病，轻微认知损害，年龄相关的记忆损害和精神分裂症的认知缺陷。

11.按照权利要求8的方法，进一步包括给予含有权利要求1的结晶一水合物的化合物与非典型抗精神病药的联用药。

12.按照权利要求8的方法，其中病症或障碍选自：不孕，循环缺乏，与创伤愈合相关的新血管生长的需要，与皮肤移植的血管形成相关的新血管生长的需要，缺血，炎症，关节炎和相关障碍，创伤愈合和与糖尿病相关的并发症。

13.制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物的方法，该方法包括下列步骤：

(a) 在大约65℃至大约85℃的温度范围内，将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷溶解在至少一种溶剂中；

(b) 将该溶液的温度调节到大约55℃至大约75℃的温度范围；

(c) 向该溶液中加入至少一种其它溶剂，并混合；

(d) 将该溶液的温度调节到大约30℃至大约50℃的温度范围；

(e) 向该溶液中加入至少一种其它溶剂；

(f) 在大约30℃至大约50℃的温度范围下保持该浆液；

(g) 将该浆液的温度调节到大约-5℃至大约15℃的温度范围；

(h) 将该浆液混合至少一个小时；和

(i) 回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物。

14.权利要求13的方法，其中步骤(a)的溶剂包括水和至少一种其它有机溶剂的组合物，其中该组合物包括大于或等于0.15的临界水活度。

15.权利要求14的方法，其中至少一种其它溶剂选自：甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯和其混合物。

16.权利要求13的方法，其中步骤(a)的溶剂包括2-丙醇和水的混合物。

17.权利要求16的方法，其中至少一种其它溶剂和水的混合物包含的2-丙醇与水的比例范围为大约20:1至大约1:10。

18.权利要求16的方法，其中至少一种其它溶剂和水的混合物包含的2-丙醇与水的比例范围为大约1:1至大约7:1。

19.权利要求13的方法，其中步骤(a)的温度在大约70℃至大约80℃的范围。

20.权利要求13的方法，其中步骤(a)的温度在大约74℃至大约76℃的范围。

21.权利要求13的方法，其中步骤(b)包括：将溶液的温度调节到大约60℃至大约70℃温度。

22.权利要求13的方法，其中步骤(b)包括：将溶液的温度调节到大约64℃至大约66℃温度。

23.权利要求13的方法，其中步骤(c)的溶剂包括有机溶剂、水和其组合。

24.权利要求13的方法，其中步骤(c)的溶剂选自：甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯，水和其混合物。

25.权利要求13的方法，其中步骤(c)的溶剂包括2-丙醇。

26.权利要求25的方法，其中相比于步骤(a)使用的溶剂数量，步骤(c)使用的2-丙醇数量包括大约2个体积至大约10个体积。

27.权利要求25的方法，其中相比于步骤(a)使用的溶剂数量，步骤(c)使用的2-丙醇数量包括大约5个体积至大约7个体积。

28.权利要求13的方法，其中步骤(d)包括：将温度调节到大约35℃至大约45℃。

29.权利要求13的方法，其中步骤(d)包括：将温度调节到大约39℃至大约41℃。

30.权利要求13的方法，其中步骤(e)的溶剂包括有机溶剂、水和其组合。

31.权利要求13的方法，其中步骤(e)的溶剂选自：甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯，水和其混合物。

32.权利要求13的方法，其中步骤(e)的溶剂包括2-丙醇。

33.权利要求32的方法，其中相比于步骤(a)和(c)使用的溶剂数量，步骤(e)使用的2-丙醇数量包括大约1个体积至大约10个体积。

34.权利要求32的方法，其中相比于步骤(a)和(c)使用的溶剂数量，步骤(e)使用的2-丙醇数量包括大约4个体积至大约6个体积。

35.权利要求13的方法，其中步骤(f)包括：将温度调节到大约35℃至大约45℃。

36.权利要求13的方法，其中步骤(f)包括：将温度调节到大约39℃至大约41℃。

37.权利要求13的方法，其中步骤(g)包括：将浆液的温度调节到大约0℃至大约10℃的温度范围。

38.权利要求13的方法，其中步骤(g)包括：将浆液的温度调节到大约4℃至大约6℃的温度范围。

39.权利要求13的方法，其中步骤(i)包括：过滤回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物。

40.制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物的方法，该方法包括下列步骤：

(a) 在大约75℃温度，将(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷溶解在大约4个体积的2-丙醇和大约1个体积的水中；

(b) 将该溶液的温度调节到大约65℃的温度范围；

(c) 向该溶液中加入大约6个体积的2-丙醇，并混合；

(d) 将温度调节到大约40℃；

(e) 向该溶液中加入大约5个体积的2-丙醇；

(f) 将该浆液保持在大约40℃温度；

(g) 将该浆液的温度调节到大约5℃温度；

(h) 将该浆液混合；和

(i) 回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的结晶一水合物。

41.制备(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物的方法，该方法包括下列步骤：

(a) 在反应容器中，使无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐与溶剂接触；

(b) 将该反应容器密封，避免该悬浮液在环境条件下接触光；和

(c) 回收(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷的结晶一水合物。

42.权利要求41的方法，其中步骤(a)的溶剂包括水。

43.权利要求42的方法，其中无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的数量包括大约10 mg至大约500 mg，其中水的数量包括大约0.1 mL至大约2.0 mL。

44.权利要求42的方法，其中无水(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的数量包括大约50 mg至大约150 mg，其中水的数量包括大约0.8 mL至大约1.2 mL。

45.权利要求41的方法，其中步骤(a)的溶剂包括有机溶剂和水的混合物，其中该混合物包括大于或等于0.15的临界水活度。

46.权利要求45的方法，其中有机溶剂包括：甲醇，乙醇，2-丙醇，丁醇，丁醇乙腈，丙酮，甲酰胺，二甲基甲酰胺，甲苯，苯，苯甲醚，乙酸乙酯，乙酸异丙酯，四氢呋喃，1,4-二噁烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，己烷，正庚烷，2-丁酮，二甲亚砜，硝基甲烷，1-甲基-2-吡咯烷酮，三乙胺，三丁基胺，三氟甲苯和其混合物。

47.药物组合物，其包含作为活性组分的(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物和可药用载体、稀释剂或赋形剂。

48.权利要求47的药物组合物，其中基于该组合物的总重量，(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物的存在数量范围为大约0.1%至大约99.9%重量。

49.权利要求47的药物组合物，其中(4s)-4-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基氧基)-1-氮杂三环[3.3.1.1^3,7]癸烷柠檬酸二氢盐的结晶一水合物在粉末X射线衍射图中、在下列2θ度数值处显示至少一个特征峰：8.4 ± 0.20, 11.3 ± 0.20, 14.2 ± 0.20, 15.5 ± 0.20, 16.4 ± 0.20, 16.6 ± 0.20, 17.2 ± 0.20, 19.7 ± 0.20, 20.7 ± 0.20, 21.0 ± 0.20, 21.2 ± 0.20, 21.6 ± 0.20, 24.8 ± 0.20和26.9 ± 0.20。