CN113621684A - 一种游离dna保存试剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种游离DNA保存试剂及制备方法，涉及医学技术领域。该一种游离DNA保存试剂及制备方法，包括游离DNA试剂保存时，添加适量的无固定剂防腐剂，防止DNA的交联，并在环境温度下保存25天，然后在36.7℃下保存8天，模拟血液中DNA的原生环境，利于更好的保存游离的DNA，得到游离DNA保存试剂。通过采用良好的游离DNA试剂制备方法，实际操作步骤简捷，且利于的得到完整稳定的游离DNA,实际制备的游离DNA试剂品质良好，此外通过采用良好的游离DNA试剂保存方法，可以使游离DNA试剂保存完整且保存稳定，且不易发生基因组DNA片段化，利于进行对比试验。
Description
技术领域
本发明涉及医学技术领域，具体为一种游离DNA保存试剂及制备方法。
背景技术
游离DNA，血中游离DNA简称循环核酸指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。游离DNA大部分都是双链DNA分子，血中游离DNA片段远小于基因组DNA，片段长度集中在0.18～21kb之间。用于疾病的早期诊断，预后，检测。
目前，现有游离DNA保存试剂及制备方法在于实际应用时，缺乏良好的游离DNA试剂制备方法，实际操作步骤繁琐，且不利于的得到完整稳定的游离DNA,实际制备的游离DNA试剂品质不佳，此外缺乏良好的游离DNA试剂保存方法，无法使游离DNA试剂保存完整且保存稳定，且极易发生基因组DNA片段化，不利于进行对比试验。
为此，我们研发出了新的一种游离DNA保存试剂及制备方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种游离DNA保存试剂及制备方法，解决了上述问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种游离DNA保存试剂及制备方法，包括以下具体步骤：
S1.选取适量的新鲜动植物血液样本，将其置入培养基，向其中加入适量的高浓度盐酸溶液，进而破坏血液中的红细胞细胞外壁，此时再将其放入至差速离心机中，分离血液中的红细胞与白细胞，离心分离完毕后，收集血液中的白细胞；
S2.提取后的细胞溶液中添加适量的十二烷基硫酸钠溶液，用于进行细胞溶液中白细胞的裂解，可溶解细胞膜、核膜上的脂质成分，且可使血球蛋白质变性，进而与血球蛋白结合成絮状复合物沉淀；
S3.此时需要添加适量的盐酸与氯化钠配比缓冲液，配比为1：1.5，用于保证白细胞提取溶液的PH相对稳定，此时可通过胶头滴管进行滴入添加，并用玻璃棒进行不断的缓速搅拌，防止溶液PH陡然变化；
S4.再抽提上层悬浮液于一个新的培养基，通过向其内投入适量的酒精，由于酒精的物理特性为可以和水进行任意比例的混溶，利于夺取DNA周围的水分子，进而使失去水分子的DNA利于聚合收集并形成沉淀；
S5.此时将DNA的聚合沉淀进行离心洗涤工作，并调节适量的二价金属螯合剂，配合十二烷基硫酸钠使DNA的聚合沉淀一直保持良好的活性，使DNA游离，且利于与DNA酶中的钙离子和镁离子相结合，促使DNA酶失去活性，进而提取完整的DNA,最终经过干燥溶解工序，完成游离DNA试剂制备。
优选的，所述DNA溶解时需要以弱碱性的Tris或者TE，避免金属离子的干扰，且再提取或保存DNA时，采用Tris-HCl系统，使缓冲液中的EDTA更能稳定，进而保证核酸一级结构的完整稳定。
优选的，所述游离DNA试剂保存时，添加适量的无固定剂防腐剂，防止DNA的交联，并在环境温度下保存25天，然后在36.7℃下保存8天，模拟血液中DNA的原生环境，利于更好的保存游离的DNA，得到游离DNA保存试剂。
优选的，所述游离DNA保存试剂应置于温热条件下保存10天，并用减震缓冲试剂瓶箱保存，保证保存或是运输后不发生血浆体积损失，且有效起到了防止溶血，可以更好地分离血浆作用，同时防止基因组DNA片段化，利于各试剂进行横向对比。
(三)有益效果
本发明提供了一种游离DNA保存试剂及制备方法。具备以下有益效果：
1、该一种游离DNA保存试剂及制备方法，通过采用良好的游离DNA试剂制备方法，实际操作步骤简捷，且利于的得到完整稳定的游离DNA,实际制备的游离DNA试剂品质良好。
2、该一种游离DNA保存试剂及制备方法，通过采用良好的游离DNA试剂保存方法，可以使游离DNA试剂保存完整且保存稳定，且不易发生基因组DNA片段化，利于进行对比试验。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明实施例提供一种游离DNA保存试剂及制备方法，包括以下具体步骤：
S1.选取适量的新鲜动植物血液样本，将其置入培养基，向其中加入适量的高浓度盐酸溶液，进而破坏血液中的红细胞细胞外壁，此时再将其放入至差速离心机中，分离血液中的红细胞与白细胞，离心分离完毕后，收集血液中的白细胞；
S2.提取后的细胞溶液中添加适量的十二烷基硫酸钠溶液，用于进行细胞溶液中白细胞的裂解，可溶解细胞膜、核膜上的脂质成分，且可使血球蛋白质变性，进而与血球蛋白结合成絮状复合物沉淀；
S3.此时需要添加适量的盐酸与氯化钠配比缓冲液，配比为1：1.5，用于保证白细胞提取溶液的PH相对稳定，此时可通过胶头滴管进行滴入添加，并用玻璃棒进行不断的缓速搅拌，防止溶液PH陡然变化；
S4.再抽提上层悬浮液于一个新的培养基，通过向其内投入适量的酒精，由于酒精的物理特性为可以和水进行任意比例的混溶，利于夺取DNA周围的水分子，进而使失去水分子的DNA利于聚合收集并形成沉淀；
S5.此时将DNA的聚合沉淀进行离心洗涤工作，并调节适量的二价金属螯合剂，配合十二烷基硫酸钠使DNA的聚合沉淀一直保持良好的活性，使DNA游离，且利于与DNA酶中的钙离子和镁离子相结合，促使DNA酶失去活性，进而提取完整的DNA,最终经过干燥溶解工序，完成游离DNA试剂制备。
实施例二：
本实施例与实施例一的不同之处在于：DNA溶解时需要以弱碱性的Tris或者TE，避免金属离子的干扰，且再提取或保存DNA时，采用Tris-HCl系统，使缓冲液中的EDTA更能稳定，进而保证核酸一级结构的完整稳定，游离DNA试剂保存时，添加适量的无固定剂防腐剂，防止DNA的交联，并在环境温度下保存25天，然后在36.7℃下保存8天，模拟血液中DNA的原生环境，利于更好的保存游离的DNA，得到游离DNA保存试剂，游离DNA保存试剂应置于温热条件下保存10天，并用减震缓冲试剂瓶箱保存，保证保存或是运输后不发生血浆体积损失，且有效起到了防止溶血，可以更好地分离血浆作用，同时防止基因组DNA片段化，利于各试剂进行横向对比。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种游离DNA保存试剂及制备方法，其特征在于：包括以下具体步骤：
S1.选取适量的新鲜动植物血液样本，将其置入培养基，向其中加入适量的高浓度盐酸溶液，进而破坏血液中的红细胞细胞外壁，此时再将其放入至差速离心机中，分离血液中的红细胞与白细胞，离心分离完毕后，收集血液中的白细胞；
S2.提取后的细胞溶液中添加适量的十二烷基硫酸钠溶液，用于进行细胞溶液中白细胞的裂解，可溶解细胞膜、核膜上的脂质成分，且可使血球蛋白质变性，进而与血球蛋白结合成絮状复合物沉淀；
S3.此时需要添加适量的盐酸与氯化钠配比缓冲液，配比为1：1.5，用于保证白细胞提取溶液的PH相对稳定，此时可通过胶头滴管进行滴入添加，并用玻璃棒进行不断的缓速搅拌，防止溶液PH陡然变化；
S4.再抽提上层悬浮液于一个新的培养基，通过向其内投入适量的酒精，由于酒精的物理特性为可以和水进行任意比例的混溶，利于夺取DNA周围的水分子，进而使失去水分子的DNA利于聚合收集并形成沉淀；
S5.此时将DNA的聚合沉淀进行离心洗涤工作，并调节适量的二价金属螯合剂，配合十二烷基硫酸钠使DNA的聚合沉淀一直保持良好的活性，使DNA游离，且利于与DNA酶中的钙离子和镁离子相结合，促使DNA酶失去活性，进而提取完整的DNA,最终经过干燥溶解工序，完成游离DNA试剂制备。
2.根据权利要求1所述的一种游离DNA保存试剂及制备方法，其特征在于：所述DNA溶解时需要以弱碱性的Tris或者TE，避免金属离子的干扰，且再提取或保存DNA时，采用Tris-HCl系统，使缓冲液中的EDTA更能稳定，进而保证核酸一级结构的完整稳定。
3.根据权利要求1所述的一种游离DNA保存试剂及制备方法，其特征在于：所述游离DNA试剂保存时，添加适量的无固定剂防腐剂，防止DNA的交联，并在环境温度下保存25天，然后在36.7℃下保存8天，模拟血液中DNA的原生环境，利于更好的保存游离的DNA，得到游离DNA保存试剂。
4.根据权利要求1所述的一种游离DNA保存试剂及制备方法，其特征在于：所述游离DNA保存试剂应置于温热条件下保存10天，并用减震缓冲试剂瓶箱保存，保证保存或是运输后不发生血浆体积损失，且有效起到了防止溶血，可以更好地分离血浆作用，同时防止基因组DNA片段化，利于各试剂进行横向对比。
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| CN109913447A (zh) * | 2019-04-04 | 2019-06-21 | 深圳市南科征途有限公司 | 游离dna提取富集试剂盒及游离dna提取方法 |
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