CN113584000A - 一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种α‑L‑鼠李糖苷酶、其制备方法和应用，属于基因工程和生物催化领域。具体涉及一种新型α‑L‑鼠李糖苷酶氨基酸序列和编码基因、含有上述基因的重组载体和重组微生物、利用上述重组微生物发酵制备α‑L‑鼠李糖苷酶的方法以及所述α‑L‑鼠李糖苷酶在水解薯蓣皂苷制备薯蓣皂素中的应用。本发明提供的α‑L‑鼠李糖苷酶可以特异性水解植物黄姜中甾体皂苷C3位置外侧α‑L‑1,2‑鼠李糖苷键，具有催化效率高、热稳定性好、糖耐受性高等优点。此外，在所述α‑L‑鼠李糖苷酶和β‑D‑葡萄糖苷酶的共催化下，黄姜粗提物中的甾体皂苷几乎完全转化为薯蓣皂素，转化率高达98.5%，表明其在规模化皂素生产中具有良好的应用前景。

Description

一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物转化领域，具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用。
背景技术
鼠李糖苷酶属于水解酶大类，广泛存在于动物、植物以及微生物中，可用于水解α-1,2、α-1,3、α-1,4以及α-1,6等连接的鼠李糖苷键，在食品、医药以及化工行业有重要的应用潜力，其中高热稳定性、高催化效率以及高糖耐受性的酶对于工业酶催化应用至关重要。
盾叶薯蓣（Dioscores zingiberensis C.H. Wright，简写DZW），又名黄姜，可直接入药，具有清热解毒等功效。薯蓣皂素（Diosgenin）是黄姜中的重要活性成分，具有众多药理活性，如抗肿瘤、抗炎等。此外，薯蓣皂素更是甾体药物合成的重要前体，被誉为“药用黄金”和“激素之母”，市场应用前景广阔。但皂素在天然植物中主要以皂苷形式存在，游离皂素含量极少。
传统皂素生产工艺主要涉及皂苷的化学酸解，但大量高色度、高酸度以及高COD的废水的产生对生态环境污染严重。随着各国环保政策的收紧，大量中小皂素生产企业由于巨大的环保压力而被迫停产，制约了皂素产业的发展。
近些年来，生物转化已被广泛应用天然药物开发领域，如稀有天然化合物的制备以及新药的发现等。皂素的生物制备具有条件温和、污染小、成本低、副产物少等优点而被受关注。目前已有米曲霉、烟曲霉以及青霉等微生物被陆续报道用来转化薯蓣皂苷制备皂素，但转化效率低、周期长、规模生产潜力不足（中国专利申请公开号：107177662A、101012474B、103146795A等）。
此外，使用来源于米曲霉的鼠李糖苷酶以及新月弯胞霉的葡萄淀粉酶酶等催化水解甾体皂苷也被报道。但是现有的酶存在热稳定性差、活性低以及糖耐受性低等缺点，限制了皂素的规模酶法生产（中国专利申请公开号：105925559A、101857855B等）。
现有报道的甾体皂苷水解酶在活性、稳定性以及耐糖性方面均显不足，难以应用于皂素的工业化生产。因此，高活性、高稳定性、高耐糖性的新型糖苷酶是实现薯蓣皂素高效酶催化制备的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高活性、高稳定性、高耐糖性的新型α-L-鼠李糖苷酶，所述糖苷酶氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列、用于表达所述糖苷酶的表达载体、包含或整合所述表达载体的宿主细胞、以及上述α-L-鼠李糖苷酶在薯蓣皂素生产中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为将SEQ ID NO.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的有α--L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质，优选为与SEQ ID NO.1有60%以上的相似度。更优选为80%或90%以上。
一种核苷酸序列，编码所述的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列或为如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
一种重组载体，包含编码所述的α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列或者包含如SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列。
一种宿主细胞，包含所述的重组载体或者基因组中整合有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，采用所述的宿主细胞生产或者蓝状菌发酵生产。
通过篮状菌Talaromyces stollii固体发酵获得粗酶液，将所述粗酶液分别通过硫酸铵沉淀、Q-Berpharose FF纯化、DEAE-Berpharose FF纯化以及分子筛层析纯化得到α-L-鼠李糖苷酶。
所述α-L-鼠李糖苷酶特异性水解盾叶新苷、三角叶苷、薯蓣皂苷A、薯蓣皂苷以及重楼皂苷I的外侧α-1,2-L-鼠李糖苷键。
所述α-L-鼠李糖苷酶应用于生产薯蓣皂素。
本发明通过蛋白纯化以及蛋白质指纹质谱技术从篮状菌（TalaromycesStollii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.3.16013，保藏日期：2020.8.28）中成功挖掘出一种高活性、高稳定性和高糖耐受性的α-L-鼠李糖苷酶。
上述α-L-鼠李糖苷酶的发现是基于基因组测序技术以及蛋白质质谱鉴定技术，其过程如下：1、通过二代测序技术（illumina Hiseq）对Talaromyces stollii的全基因组进行测序(GenBank accession number: ASM1406522v1)，对获得的核苷酸序列进行拼接并注释相关基因功能；2、通过固体发酵Talaromyces stollii获得粗酶液，将所述粗酶液分别通过硫酸铵沉淀、Q-Berpharose FF纯化、DEAE-Berpharose FF纯化以及分子筛层析（SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL，GE Healthcare）纯化得到高纯度α-L-鼠李糖苷酶； 3、通过基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF/TOF）对纯化后的α-L-鼠李糖苷酶进行质谱鉴定，并将质谱鉴定结果与基因组中的基因注释信息进行搜索比对，从而确定α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列信息。
应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据偏好性优化合适特定物种表达的密码子；因此，本发明的α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列还包括由 SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列经取代、缺失和／或增加得到编码具有α-L-鼠李糖苷酶活性的核苷酸序列。
本发明提供的重组载体，包含所述α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列；优选地，所述重组载体为所述重组载体为pPIC9k-Rhase-TS。（Rhase-TS表示本发明的α-L-鼠李糖苷酶）
本发明提供的宿主细胞，包含含有α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列的重组载体，或基因组中整合有α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌以及乳酸菌等；所述真核细胞为酵母细胞、丝状真菌细胞、植物细胞、动物细胞等；优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母。
所述α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，包括在上述的宿主细胞中生产；优选地，在毕赤酵母表达生产重组α-L-鼠李糖苷酶。
所述α-L-鼠李糖苷酶的最适温度均为60 ℃，最适pH为4.5。
所述α-L-鼠李糖苷酶70 ℃环境中放置1 h后还保持80%以上的活性，耐热性较之现有报道的薯蓣皂苷水解酶更好。
所述α-L-鼠李糖苷酶的鼠李糖耐受性高，Ki值高达0.5摩尔（即α-L-鼠李糖苷酶在0.5摩尔鼠李糖存在下仍保持50%的催化活性）
所述α-L-鼠李糖苷酶可以特异性水解盾叶新苷（S1，Zingiberensisnewsaponin）、三角叶苷（S2，Deltonin）、薯蓣皂苷A（S3，Prosapogenin A of dioscin）、薯蓣皂苷（Dioscin）以及重楼皂苷I（Polyphyllin Ⅰ）的外侧α-1,2-L-鼠李糖苷键。
所述α-L-鼠李糖苷酶酶活定义（U）：每小时水解1 μmol S3，所需要的酶量。
所述α-L-鼠李糖苷酶酶活测定方法：底物为S3（3 mM），加入α-L-鼠李糖苷酶（0.35mg/mL，10 μL），在pH 4.5和温度60 ℃条件下反应1 h，结束后离心去掉上清液，沉淀使用甲醇溶解并过膜后进行液相检测；经计算，纯化后的α-L-鼠李糖苷酶对S3的比酶活高达50~180 U/mg，是现有报道的薯蓣皂苷鼠李糖苷酶中活性最高的。
本发明还提供了耐热α-L-鼠李糖苷酶在生产薯蓣皂素中的应用，具体过程包括：以黄姜粗提物为底物，在上述耐热α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的共催化水解下得到薯蓣皂素，皂素得率高达98.5%。
上述α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的质量浓度比为1:5~1:30。
上述酶催化的反应条件为35~70 ℃，pH为 3.5~6.0，反应时间为5~48 h。
基于同源序列比对，选取了4种与α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列分别具有60.98%（序列号：GAQ40605.1）、70.71% （序列号：EDP53362.1）、86.98% （序列号：KAF3391473.1）以及92.63%（序列号：RAO69364.1）左右同源度的糖苷酶进行克隆表达以及催化功能研究，结果表明这4种酶均显示出与α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS类似的功能，即：可以高效催化水解甾体皂苷末端1,2-L-鼠李糖苷键。因此，本发明中应用于薯蓣皂素生产的鼠李糖苷酶还应包括与 SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列具有60%以上同源度的糖苷酶。
基于上述α-L-鼠李糖苷酶的发现过程以及应用事实，使用Talaromyces stollii直接发酵或发酵产酶应用以及使用含有上述α-L-鼠李糖苷酶的复合酶制剂用于皂素的生产对于本技术领域人员来说是显而易见的，它们都有被视为包括在本发明内。
本发明的有益效果：
本发明所提供的新型α-L-鼠李糖苷酶催化活性高、热稳定性好、鼠李糖耐受性高。在所述耐热α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的共催化下，黄姜粗提物中的甾体皂苷几乎被完全转化为薯蓣皂素，皂素得率高、步骤简单、催化剂种类少、无副产物、环境污染少，是一种温和环保的薯蓣皂素生产技术，适合工业化生产。
附图说明
图1是黄姜粗提物中所含皂苷以及皂素结构图。
图2是固体发酵菌体以及硫酸铵沉淀实物图。
图3是α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS纯化过程蛋白分析电泳图。
图4是α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS质谱数据与注释的蛋白基因组注释信息比对结果。
图5是纯化后以及去糖基化后重组α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS电泳图。
图6是α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的温度影响和温度稳定性。
图7是α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的pH影响和pH稳定性。
图8是α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS对底物的水解液相图。
图9是α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS和β-D-葡萄糖苷酶对底物水解转化路径图。 图中：Rhase-TS表示本发明实施例中α-L-鼠李糖苷酶。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的目的、技术方案以及有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。下面实施例是对本发明所做的进一步解释和说明，不应当作为对本发明的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当修改基因序列、改变重组载体、更换重组细胞、改变培养基条件、改变产酶方式、改变催化条件、改进转化工艺路线，甚至直接通过Talaromyces stollii发酵应用于皂素的生产。所有类似的改动对于本技术领域人员来说是显而易见的，它们都有被视为包括在本发明内。本发明的实施例中所用材料、试剂若未做特殊说明皆可从商业途径获得。
实施例1：
制备α-L-鼠李糖苷酶并对其酶学性质进行研究：
1、Talaromyces stollii基因组测序以及基因功能注释
使用真菌基因组提取试剂盒提取Talaromyces stollii（保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 3.16013，保藏日期：2020.8.28）的基因组，随后使用Illumina Solexa GenomeAnalyzer二代测序仪对提取的基因组进行分析，获得Talaromyces stollii基因组的原始数据。使用FASTQC对所述测序产生的原始数据进行质量评估，并通过Trimmomatic对Illumina测序数据进行质量剪切，得到相对准确的有效数据，结果表明测得的原始数据质量良好，可以进行下一步的拼接注释。
使用SPAdes拼接二代测序数据，采用GapFiller对拼接得到的contig补GAP，并使用PrInSeS-G进行序列矫正，修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。采用NCBI的Blast功能将基因蛋白序列与CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多个数据库进行比对，得到基因功能注释信息。
、天然α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的纯化。
以Talaromyces stollii为发酵菌种，采用固体发酵模式进行发酵产酶，其中固体发酵培养基为：35 g麸皮、15 g黄姜粉以及营养盐离子（硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.2%，pH 5.5），基质湿度为70%，发酵温度为30 ℃，时间为5天，中间两次翻曲（图2a）。发酵结束后，加入1.2 L pH为6.0的磷酸缓冲溶液（20 mM）在40 ℃下洗曲1 h，后通过过滤得到粗酶液1 L。
向上述粗酶液中加入硫酸铵至75%饱和度，并在4 ℃下过夜沉淀（图2b），后在4 °C，10000 rpm条件下离心15分钟，去掉上清得到粗酶沉淀。再向上述粗酶沉淀中加入50 mL磷酸缓冲液（20 mM，pH 6.0）重新溶解蛋白，并通过0.22 μm滤膜过滤去掉不溶物。使用10kDa的超滤管（Millipore）在4000 rpm和4 °C下离心对蛋白粗酶液进行浓缩脱盐，得到15mL蛋白上样液（S0）。
使用Q-Berpharose FF柱（5mL，博尔西，北京）对上述S0进行纯化，上样缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH 6.0），上样体积为5 mL，上样流速为0.5 mL/min；上样结束后使用0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3和0.5 M NaCl溶液分别洗脱2，2，4，4，5，4和4个柱体积（CVs），收集鼠李糖苷酶活性组分样品，然后再使用10 kDa的超滤管（Millipore）在4000 rpm和4 °C下离心对上述活性蛋白样品进行浓缩脱盐，得到5 mL鼠李糖苷酶活性样品（Q1）。
使用DEAE-Sepharose FF柱（5mL，博尔西，北京）对Q-Berpharose FF柱纯化后的脱盐浓缩蛋白样品Q1进行纯化，其中上样缓冲液为20 mM磷酸缓冲液（pH 6.0），上样体积为5mL，上样流速为0.5 mL/min。上样结束后使用0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3和0.5 M NaCl溶液分别洗脱2，2，4，4，3，3和3个柱体积（CVs），并收集鼠李糖苷酶活性组分样品。使用10kDa的超滤管（Millipore）在4000 rpm和4 °C下离心对上述活性蛋白样品分别进行浓缩脱盐，得到1 mL鼠李糖苷酶样品（D1）。
最后使用分子筛（SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL，GE Healthcare）对上述D1进行进一步的纯化，其中上样体积为 0.5 mL，上样流速为0.1 mL/min，
上样缓冲液为pH 7.0磷酸缓冲液（50 mM磷酸盐和150 mM NaCl）。上样结束后使用pH 7.0磷酸缓冲液（50 mM磷酸盐和150 mM NaCl）以0.3 mL/min的流速洗脱蛋白，并收集活性蛋白组分，最终得到纯化的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（S1）。
将上述纯化步骤中的S0，Q1，D1，和S1进行10%SDS-PAGE蛋白电泳分析（图3）。由结果可知，纯化后的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的分子量约为130 kDa。
、α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列的鉴定
将上述纯化后的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS对应的SDS-PAGE条带切下（图3），利用胰蛋白酶对目标蛋白进行消解后，通过ABI 5800 MALDI-TOF/TOF串联质谱仪对目标蛋白的肽段进行质谱分析，并将得到的数据与上述基因组注释信息进行比对，从而确定α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的基因信息（图4）。
其中α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，理论分子量为85432 Da，预测等电点pI为4.83。
、重组载体的构建以及转化
基于氨基酸序列信息反推出蛋白序列编码基因，并对其进行（毕赤酵母）密码子优化，优化后的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据优化后的糖苷酶核苷酸序列，通过基因全合成方式获得α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的核苷酸序列。
合成序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4共2条引物序列，其中引物序列SEQID NO. 3的5'端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3'端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以合成的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS核苷酸序列为模板进行PCR扩增，其中PCR反应体系为50 μL，反应条件为：95 ℃预变性5min，94 ℃变性2min，58 ℃退火，72℃延伸270 s，共30个循环，然后72 ℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，得到α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS回收片段H1。
使用EcoRI和NotI两种限制性内切酶对回收片段H1和pPIC9k载体分别进行双酶切，然后通过T4连接酶将酶切后的基因序列分别和酶切后的pPIC9k载体进行连接，获得重组载体pPIC9k-Rhase-TS。
、α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS表达以及纯化
使用SalI限制性内切酶对上述获得的pPIC9k-Rhase-TS重组载体进行单酶切线性化，然后将两种线性化的重组载体分别电转化到活化的毕赤酵母GS115中得到产酶宿主细胞GS115-Rhase-TS。
将上述宿主细胞GS115-Rhase-TS接入BMMG培养基中于220 rpm、30 ℃条件下培养12 h；然后收集菌体并用无菌水清洗2遍，并接入BMMY培养基中在220 rpm、30 ℃条件下培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导。培养5天后，通过离心和过滤去除菌体得到发酵液，再使用镍柱对上述发酵液进行纯化，最终获得纯化的重组α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS，其分子量约为140 kDa（图5）；使用BCA蛋白浓度试剂盒对纯化后的蛋白浓度进行测定，其中纯化后的重组α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的蛋白浓度分别为0.35 mg/mL。
上述重组蛋白的分子量与理论分子量相差巨大的原因主要是蛋白表达过程中被过度糖基化，使用去糖基化酶PNGase F（NEB，New England Biolabs）处理后，蛋白的分子量恢复正常（图5）。
、α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS酶学性质的研究
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS酶活的测定：底物为S3（3 mM），加入10 μLα-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS，在pH 4.5和温度60 ℃条件下反应1 h，结束后离心去掉上清液，沉淀使用甲醇溶解并过膜后进行液相检测，计算酶活；α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS酶活定义（U）：每小时水解1 μmol S3所需要的酶量。
最适温度的研究：底物为S3（3 mM），加入10 μLα-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS，在温度分别为5 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的条件下，测定α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的酶活。结果显示（图6）α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的最适温度为60 ℃。
热稳定性的研究：将α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS置于10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃中放置，1 h后测定残余酶活。结果显示（图6），α-L-鼠李糖苷酶Rhase-T在70 ℃以下能维持80%以上的活性。
最适pH的考察：底物为S3（3 mM），加入10 μLα-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS，在pH分别为2、3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11的条件下测定α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的酶活，结果显示（图7）α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS的最适pH为4.5.
pH稳定性研究：将α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS置于pH为2、3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11中放置，3 h后测定糖苷酶的残余酶活。结果显示（图7）α-L-鼠李糖苷酶Rhase-T在pH为3.0~10.0范围内能保持90%以上的活性。
、α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS对甾体皂苷的水解功能
分别以S1、S2、S3、薯蓣皂苷（dioscin）以及重楼皂苷I（polyphyllin Ⅰ）为底物，底物浓度为2 mM，添加α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（10 μL，0.35 mg/mL, 比酶活：141.3 U/mg），在60 ℃，pH 4.5条件下反应1小时，反应结束后液相检测（图8）；结果显示，底物中的α-L-1,2-鼠李糖苷键被水解，底物的转化路径如图9所示。
实施例2
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS二重突变体（P155A/L348N）的表达以及纯化
通过定点突变将序列SEQ ID NO. 1中的氨基酸残基Pro155和Leu348分别突变为Ala155和Asn348，突变后的氨基酸序列如 SEQ ID NO.5 所示。合成序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，其中引物序列SEQ ID NO. 3的5' 端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3' 端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以突变后的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS核苷酸序列为模板进行PCR扩增。使用EcoRI 和 NotI两种限制性内切酶将扩增后得到的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS核苷酸突变序列与pPIC9k载体同时进行双酶切反应，并通过T4连接酶将酶切后的基因序列和载体连接，获得重组载体α-L-鼠李糖苷酶pPIC9k-Rhase-TS-1。使用SalI限制性内切酶对上述获得的pPIC9k-Rhase-TS-1重组载体进行单酶切线性化，然后将两种线性化的重组载体分别电转化到活化的毕赤酵母GS115中得到产酶宿主细胞。
将上述宿主细胞接入BMMG培养基中于220 rpm、30 ℃条件下培养12 h；然后收集菌体并用无菌水清洗2遍，并接入BMMY培养基中在220 rpm、30 ℃条件下培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导。培养5天后，通过离心和过滤去除菌体得到发酵液，再使用镍柱对上述发酵液进行纯化，最终获得纯化的重组α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS二重突变体（P155A/L348N）。
实施例3
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS三重突变体（T100S/L348N/A700D）的表达以及纯化
通过定点突变将序列SEQ ID NO. 1中的氨基酸残基Thr100, Leu348和Ala700分别突变为Ser100，Asn348,和Asp700，突变后的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6 所示。合成序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，其中引物序列SEQ ID NO. 3的5' 端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3' 端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以突变后的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS核苷酸序列为模板进行PCR扩增。使用EcoRI 和NotI两种限制性内切酶将扩增后得到的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS核苷酸突变序列与pPIC9k载体同时进行双酶切反应，并通过T4连接酶将酶切后的基因序列和载体连接，获得重组载体α-L-鼠李糖苷酶pPIC9k-Rhase-TS-2。使用SalI限制性内切酶对上述获得的pPIC9k-Rhase-TS-2重组载体进行单酶切线性化，然后将两种线性化的重组载体分别电转化到活化的毕赤酵母GS115中得到产酶宿主细胞。
将上述宿主细胞接入BMMG培养基中于220 rpm、30 ℃条件下培养12 h；然后收集菌体并用无菌水清洗2遍，并接入BMMY培养基中在220 rpm、30 ℃条件下培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导。培养5天后，通过离心和过滤去除菌体得到发酵液，再使用镍柱对上述发酵液进行纯化，最终获得纯化的重组α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS三重突变体（T100S/L348N/A700D）。
实施例4
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
本实施例使用实施例1中制备的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS。
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、20微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（0.35 mg/mL）以及26微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在60℃条件下反应48 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.78 mg皂素，皂素得率为90.4%。
实施例5
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
本实施例使用实施例1中制备的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS。
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、20微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（0.35 mg/mL）以及50微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在60℃条件下反应24 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.82 mg皂素，皂素得率为96.8%。
实施例6
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
本实施例使用实施例1中制备的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS。
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、20微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（0.35 mg/mL）以及150微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在60℃条件下反应5 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.85 mg皂素，皂素得率为98.5%。
实施例7
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
本实施例使用实施例1中制备的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS。
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、20微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（0.35 mg/mL）以及100微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在45℃条件下反应24 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.8 mg皂素，皂素得率为95.7%。
实施例8
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS二重突变体（P155A/L348N）在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
本实施例使用实施例2中制备的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS二重突变体。
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、20微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS二重突变体（P155A/L348N）（0.4 mg/mL）以及100微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35mg/mL），在45℃条件下反应24 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.79 mg皂素，皂素得率为95.5%。
实施例9
α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS三重突变体（T100S/L348N/A700D）在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
本实施例使用实施例3中制备的α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS三重突变体。
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、20微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS三重突变体（T100S/L348N/A700D）（0.3 mg/mL）以及150微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在60℃条件下反应5 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.80 mg皂素，皂素得率为95.7%。
实施例10
α-L-鼠李糖苷酶（序列号：GAQ40605.1，与SED ID NO.1的形似度为60.98%）在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、20微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（0.55 mg/mL）以及100微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在50 ℃条件下反应24 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.81 mg皂素，皂素得率为96.3%。
实施例11
α-L-鼠李糖苷酶（序列号：EDP53362.1，与SED ID NO.1的形似度为70.71%）在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、30微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（0.25 mg/mL）以及100微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在55 ℃条件下反应20 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.75 mg皂素，皂素得率为93.1%。
实施例12
α-L-鼠李糖苷酶（序列号：KAF3391473.1，与SED ID NO.1的形似度为86.98%）在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、10微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（1.25 mg/mL）以及100微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在50 ℃条件下反应24 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.78 mg皂素，皂素得率为96.7%。
实施例13
α-L-鼠李糖苷酶（序列号：RAO69364.1，与SED ID NO.1的形似度为93.63%）在转化薯蓣皂苷制备皂素中的应用
向2 毫升50mM（pH=4.5）磷酸缓冲液中加入10 mg黄姜粗提物、20微升α-L-鼠李糖苷酶Rhase-TS（0.8 mg/mL）以及100微升β-D-葡萄糖苷酶（1.35 mg/mL），在55 ℃条件下反应40 h，反应结束后过滤得到反应产物，将反应产物溶于2 mL甲醇并进行液相检测，结果显示得到1.75 mg皂素，皂素得率为93.1%。
上述参照具体实施方式是对α-L-鼠李糖苷酶的来源、氨基酸序列信息获取方式，编码基因信息、载体构建、酶表达和纯化、酶学性质表征以及α-L-鼠李糖苷酶在薯蓣皂素制备中的应用所进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例；因此，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修饰，在不脱离本发明总体构思下的变化和修改同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0002887749940000011
Figure IDA0002887749940000021
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Claims (10)

1.一种α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为将SEQID NO.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的有α-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的一种α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，或为将SEQ ID NO.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的与SEQ ID NO.1氨基酸序列至少有60%序列相似性有α-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质。
3.一种核苷酸序列，其特征在于，编码权利要求1~2中任意一项所述的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列或为如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的核苷酸序列或者包含如SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组载体或者基因组中整合有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
6.一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于，采用权利要求5所述的宿主细胞生产。
7.权利要求1~2中任意一项所述的α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于：由蓝状菌发酵生产。
8.根据权利要求7所述的α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于，通过篮状菌Talaromyces stollii固体发酵获得粗酶液，将所述粗酶液分别通过硫酸铵沉淀、Q-Berpharose FF纯化、DEAE-Berpharose FF纯化以及分子筛层析纯化得到α-L-鼠李糖苷酶。
9.权利要求1~2中任意一项所述的α-L-鼠李糖苷酶的应用，其特征在于：应用于所述α-L-鼠李糖苷酶特异性水解盾叶新苷、三角叶苷、薯蓣皂苷A、薯蓣皂苷以及重楼皂苷I的外侧α-1,2-L-鼠李糖苷键。
10.权利要求1~2中任意一项所述的α-L-鼠李糖苷酶应用，其特征在于：应用于生产薯蓣皂素。
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