CN113493757A

CN113493757A - 使用酶促转化由氨基酸制备伯胺的方法

Info

Publication number: CN113493757A
Application number: CN202110363391.3A
Authority: CN
Inventors: 李相烨; 金东仁; 蔡东彦
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2021-10-12
Also published as: US20210317486A1; KR102275630B1

Abstract

公开了一种制备伯胺的方法。更具体地，公开了一种用编码缬氨酸脱羧酶的基因转化的突变微生物和一种使用所述突变微生物由氨基酸制备伯胺的方法。所述方法具有如下效果，即使用微生物作为常规化学合成方法的替代方案以环境友好的方式合成作为药物和农用化学品的前体的伯胺。

Description

使用酶促转化由氨基酸制备伯胺的方法

技术领域

本发明涉及一种使用酶促转化由氨基酸制备伯胺的方法。更具体地，本发明涉及一种用编码缬氨酸脱羧酶的基因转化的突变微生物和一种使用所述突变微生物由氨基酸制备伯胺的方法。

背景技术

近年来，由于石油枯竭和环境问题，使用微生物可持续地制造各种增值化学产品一直受到极大的关注。在这些增值化合物中，还正在研究使用微生物产生用作药物和农用化学品的前体的伯胺。然而，迄今为止还没有使用突变微生物成功产生多种多样的伯胺的案例。

“伯胺”是指通过用烷基或芳基取代氨的一个氢原子而形成的胺，并且由通式RNH₂表示。迄今为止尚未报道过使用常规代谢工程化方法产生作为伯胺的前体的氨基酸的突变微生物。代表性例子包括产生L-丙氨酸、2-氨基丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-2-苯甘氨酸的已知突变微生物，所述氨基酸是伯胺(如乙胺、丙胺、丁胺、异丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲胺和苄胺)的前体氨基酸。

在产生L-丙氨酸的突变微生物和产生2-氨基丁酸的突变微生物的情况下，已经对使用基于大肠杆菌(Escherichia coli)的突变微生物的产生进行过研究(Zhang等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.77:355-366 2007；Zhang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.107:6234-6239,2010)。已经使用具有工程化代谢回路的大肠杆菌过度产生L-正缬氨酸和L-正亮氨酸(Sycheva等人,Microbiology 76:712-718,2007；Anderhuber等人,J.Biotechnol.235:100-111,2016)。作为构成蛋白质的支链氨基酸的L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸是使用大肠杆菌和棒状杆菌属(Corynebacterium)菌株的代谢回路产生的(Park和Lee.,Appl.Microbiol.Biotechnol.85:491-506,2010)。此外，也已经使用基于大肠杆菌的突变微生物产生L-2-苯甘氨酸(Liu等人,J.Biotechnol.186:91-97,2014)。

然而，尚未报道过使用氨基酸直接产生伯胺的突变微生物。

因此，作为广泛努力开发使用微生物制备伯胺的方法的结果，本发明人已经发现一种将多种氨基酸作为底物转化为伯胺的脱羧酶。本发明人发现，可以在体外以及在体内，也就是说，使用经所述酶或编码所述酶的基因转化的突变微生物由多种氨基酸来制备伯胺。基于该发现，完成了本发明。

发明内容

因此，已经鉴于上述问题进行了本发明，并且本发明的一个目的是提供一种能够由氨基酸产生伯胺的突变微生物。

本发明的另一个目的是提供一种使用能够由氨基酸产生伯胺的突变微生物制备伯胺的方法。

本发明的另一个目的是提供一种使用酶促反应制备伯胺的方法。

根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供能够由氨基酸产生伯胺的突变微生物来实现，所述突变微生物引入了编码缬氨酸脱羧酶的基因。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备伯胺的方法，其包括(a)培养所述突变微生物以产生伯胺，以及(b)收集所产生的伯胺。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备伯胺的方法，其包括(a)使缬氨酸脱羧酶与氨基酸反应以产生伯胺，以及(b)收集所产生的伯胺。

发明效果

本发明具有如下效果，即使用微生物代替常规化学合成方法以环境友好的方式合成作为药物和农用化学品的前体的伯胺。

附图说明

从以下具体实施方式结合附图将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，在所述附图中：

图1显示了使用缬氨酸羧化酶将多种氨基酸转化为伯胺的途径；

图2显示了pET22b his-vlmD过表达质粒，其中插入了用于纯化缬氨酸羧化酶的his标记的vlmD基因；

图3是显示含有经纯化的缬氨酸羧化酶的级分的SDS-PAGE结果的图像；

图4显示了缬氨酸羧化酶的酶活性分析结果和显示使用氨基酸作为底物产生多种伯胺的HPLC的结果；

图5显示了pTac15k_vlmD质粒，其中插入了用于使用突变微生物在体内产生伯胺的vlmD基因；

图6是显示使用经vlmD基因转化的突变微生物是否在体内由多种氨基酸产生多种伯胺的图；

图7显示了pTac15k_vlmD_alaD质粒，其中插入了用于使用突变微生物在体内由葡萄糖产生乙胺的vlmD和alaD基因；

图8显示了pTac15k_vlmD_pTac_leuABCD质粒，其中插入了用于使用突变微生物在体内由葡萄糖产生异戊胺的vlmD和leuABCD基因；

图9是显示使用经vlmD基因转化的突变微生物是否在体内由葡萄糖产生乙胺的图；

图10是显示使用经vlmD基因转化的突变微生物是否在体内由葡萄糖产生异丁胺的图；以及

图11是显示使用经vlmD基因转化的突变微生物是否在体内由葡萄糖产生异戊胺的图。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所涉及领域的技术人员所理解的含义相同的含义。通常，本文所用的命名法是本领域中熟知的，并且是通常使用的。

本发明首次鉴定出源自生绿链霉菌(Streptomyces viridifaciens)的缬氨酸脱羧酶具有通过脱羧将多种氨基酸转化为伯胺的活性。此外，产生了用编码所述缬氨酸脱羧酶的基因转化的突变微生物，并且发现所述突变微生物具有将氨基酸转化为伯胺的能力。

因此，在一个方面，本发明涉及能够由氨基酸产生伯胺的突变微生物，其中所述突变微生物中引入有编码缬氨酸脱羧酶的基因。

根据本发明，鉴定出除了作为天然氨基酸底物的L-缬氨酸之外，所述缬氨酸脱羧酶还使用多种氨基酸作为底物产生相应的伯胺，并且在此基础上建立了能够使用酶由氨基酸产生伯胺的系统。

根据本发明的一个实施方案，所述突变微生物使用若干种氨基酸作为底物产生乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺(图1)。

如本文所用，术语“缬氨酸脱羧酶”是指由源自生绿链霉菌的vlmD基因编码的酶以及任何与所述酶具有同源性的酶。

在本发明中，所述缬氨酸脱羧酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并且具有将氨基酸转化为伯胺的活性。

根据本发明，编码缬氨酸脱羧酶的基因包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有90％或更高同源性的核苷酸序列。

在一个方面，本发明涉及使用缬氨酸脱羧酶由氨基酸制备多种伯胺的方法，所述伯胺包括乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺。

根据本发明，揭示出除了作为天然氨基酸底物的L-缬氨酸之外，所述酶即缬氨酸脱羧酶还接受多种氨基酸作为底物，并将其转化为相应的伯胺，并且在此基础上建立了能够使用所述酶由氨基酸产生多种伯胺的系统(图1)。

在本发明中，将所述氨基酸转化为所述伯胺的酶可以是源自生绿链霉菌的缬氨酸脱羧酶，但是可以不受任何限制地使用任何酶，只要它在其所引入的宿主细胞中表达并展现出相同的酶活性即可。

根据本发明，所述伯胺是通过用烷基或芳基取代氨的一个氢原子而形成的具有胺的特征的任何化学物质，并且其代表性伯胺包括乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺、苄胺等。

因此，所述伯胺选自乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺，但是不限于此。

在本发明中，所述氨基酸是特征在于具有胺和羧酸官能团二者的任何化学物质。

代表性氨基酸选自L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸和L-2-苯甘氨酸，但是不限于此。

根据本发明，所述微生物可以选自细菌、酵母和真菌，并且优选地，所述细菌选自属棒状杆菌属和大肠杆菌，并且更优选大肠杆菌，但是可以使用任何能够产生氨基酸作为前体或将其用作碳源的微生物，而对此没有特别限制。

在另一个方面，本发明涉及制备伯胺的方法，其包括(a)培养所述突变微生物以产生伯胺，以及(b)收集所产生的伯胺。

在本发明的实施方案中，为了确定使用突变微生物是否将氨基酸转化为多种伯胺，产生了pTac15k_vlmD载体，其中克隆了编码缬氨酸脱羧酶的基因vlmD(图5)，然后将所述载体插入大肠杆菌WL3110中(Lee等人,Mol.Syst.Biol.3:1,2007)。此外，为了将前体氨基酸供应到所述微生物中，将所述氨基酸与葡萄糖一起作为碳源进料。在本文添加的氨基酸是L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸或1-氨基环己烷羧酸。使所述突变微生物在上述培养条件下生长。结果显示，根据添加到微生物培养基中的氨基酸，检测到乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、异戊胺、甲基丁胺、环戊胺和环己胺(图6)。

此外，根据本发明的实施方案，发现根据本发明的经修饰的微生物将L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸或1-氨基环己烷羧酸转化为乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺和环己胺。然而，可由多种氨基酸产生的其他伯胺的例子包括甲胺、戊胺、苄胺等，并且本发明不限于此。

在本发明中，当培养所述突变微生物以产生所述伯胺时，可以通过添加氨基酸作为底物来进行培养，或者可以使用由所述突变微生物生物合成的氨基酸来产生所述伯胺。为了验证这一点，在本发明的一个实施方案中，产生了pTac15k_vlmD_alaD载体，其中克隆了编码缬氨酸脱羧酶的vlmD基因和编码L-丙氨酸脱氢酶的alaD基因(图7)，然后将所述载体引入大肠杆菌WL3110中。在仅存在葡萄糖作为碳源而没有氨基酸的情况下培养所述突变微生物，并且在培养基中检测到乙胺(图9)。在本发明的另一个实施方案中，构建了pTac15k_vlmD载体，其中克隆了编码缬氨酸脱羧酶的基因vlmD(图5)，然后将所述载体引入大肠杆菌Val(pKBRilvBNCED)中(Park等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.104:7797-7802,2007)。将所述突变微生物在仅含有葡萄糖作为碳源而没有氨基酸的培养基中培养。结果显示，在微生物培养基中检测到异丁胺(图10)。最后，构建了pTac15k_vlmD_pTac_leuABCD载体，其中克隆了编码缬氨酸脱羧酶的基因vlmD和编码L-亮氨酸生物合成代谢回路的leuABCD基因(图8)，然后将所述载体引入大肠杆菌Val(pKBRilvBNCED)中。将所述突变微生物在仅以葡萄糖作为碳源而没有氨基酸的情况下培养。结果显示，在微生物培养液中检测到异戊胺(图11)。

任何微生物都可以不受限制地用于本发明，只要它能够产生氨基酸即可，并且所述微生物可以是大肠杆菌、棒状杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus genus)、乳酸菌等。

关于本发明中产生氨基酸的微生物的例子，产生L-丙氨酸的微生物可以是大肠杆菌XZ132(Zhang等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.77:355-366 2007)等，产生L-2-氨基丁酸的微生物可以是大肠杆菌ATCC98082(pZElac_tdcB_GDH)(Zhang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.107:6234-6239,2010)，产生L-正缬氨酸的微生物可以是B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH(Sycheva等人,Microbiology 76:712-718,2007)，产生L-缬氨酸的微生物可以是大肠杆菌Val(pKBRilvBNCED)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)WCC003/pJYW-4-ilvBNC1-lrp1-brnFE(Chen等人,Metab.Eng.29:66-75,2015)等，产生L-正亮氨酸的微生物可以是大肠杆菌B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pBR-leuABCD(Sycheva等人,Microbiology 76:712-718,2007)、大肠杆菌BWEC14{pLEUfbr pOYE}(Anderhuber等人,J.Biotechnol.235:100-111,2016)等，产生L-亮氨酸的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌MV-LeuF2(Vogt等人,Metab.Eng.22:40-52,2014)、谷氨酸棒状杆菌MDLeu-19/pZ8-1/leuAr(Qingeng等人,African J.Biotechnol.16:1048-1060,2017)等，产生L-异亮氨酸的微生物可以是大肠杆菌ILE03(Park等人,ACS Synth.Biol.1:53 2-540)、谷氨酸棒状杆菌JHI3-156(Yin等人,Metab.Eng.14:542-550)等，并且产生L-2-苯甘氨酸的微生物可以是大肠杆菌BC(pBPSPT和pUCSOT)(Liu等人,J.Biotechnol.186:91-97,2014)等。

根据本发明，可以使用常规已知的培养方法进行培养所述突变微生物的过程，并且除了在本发明的实施方案中使用的特定培养基和特定培育方法之外，还可以使用糖化溶液如乳清或CSL(玉米浆)和其他培养基，并且可以使用多种方法如补料分批培养和连续培养(Lee等人,Bioprocess Biosyst.Eng.,26:63,2003；Lee等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,58:663,2002；Lee等人,Biotechnol.Lett.,25:111,2003；Lee等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,54:23,2000；Lee等人,Biotechnol.Bioeng.,72:41,2001)。

在另一个方面，本发明涉及制备伯胺的方法，其包括(a)使缬氨酸脱羧酶与氨基酸反应以产生伯胺，以及(b)收集所产生的伯胺。

在本发明的实施方案中，进行酶活性测定以确定除了作为天然底物的L-缬氨酸，缬氨酸脱羧酶是否作用于氨基酸，如L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、L-正缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸和L-2-苯甘氨酸。

首先，为了获得经纯化的酶，克隆编码his标记的缬氨酸脱羧酶的his-vlmD基因以构建pET22b_his_vlmD载体(图2)，并且纯化his标记的缬氨酸脱羧酶(图3)。使用经纯化的蛋白质、磷酸吡哆醛(PLP)、以及L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸或L-2-苯甘氨酸进行酶测定。作为结果，HPLC显示产生了伯胺，如乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺或苄胺(图4)。

此外，在本发明的实施方案中，发现根据本发明使用缬氨酸脱羧酶产生了乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺，但是可使用多种其他氨基酸作为底物产生的伯胺的例子可以包括甲胺、己胺等。

如本文所用，术语“载体”意指如下DNA产物，其含有与能够在合适宿主中表达DNA的控制序列可操作地连接的DNA序列。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在基因组插入物。一旦用适当的宿主转化了所述载体，它可以独立于宿主的基因组进行复制并起作用，或者常常可以与基因组本身整合。由于质粒是最常用的载体类型，因此术语“质粒”和“载体”可以在本发明的整个说明书中可互换使用。然而，本发明包括与本领域已知或将要已知的那些具有相同的功能的其他形式的载体。用于哺乳动物细胞培养物表达的典型表达载体是基于例如pRK5(EP 307,247)、pSV16B(WO91/08291)和pVL1392(Pharmingen)。

如本文所用，术语“表达控制序列”意指对于与特定宿主生物可操作地连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。这种控制序列包括用于进行转录的启动子、用于控制这种转录的操纵基因序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及用于控制转录和翻译的终止的序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。真核细胞包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。对所述质粒中基因表达水平具有最大影响的因子是启动子。优选地使用SRα启动子、巨细胞病毒来源的启动子等作为高表达的启动子。

可以将多种多样的表达控制序列中的任何一种用于所述载体以便表达本发明的DNA序列。有用的表达控制序列包括例如SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他乙二醇裂解酶的启动子、磷酸酶的启动子(如Pho5)、酵母α-交配系统的启动子、以及具有已知控制其原核或真核细胞或病毒的基因表达的配置和诱导的其他序列及其多种组合。T7 RNA聚合酶启动子Φ10可用于在大肠杆菌中表达蛋白质。

当核酸序列基于功能性关系与另一个核酸序列对齐时，所述核酸序列被称为与其“可操作地连接”。这可以是以如下方式连接的一个或多个基因和一个或多个控制序列，所述连接方式使得当合适的分子(例如，转录激活因子蛋白)与所述一个或多个控制序列连接时实现基因表达。例如，当作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，前序列或分泌前导序列的DNA与所述多肽的DNA可操作地连接；当启动子或增强子影响序列的转录时，其与编码序列可操作地连接；当核糖体结合位点影响序列的转录时，其与编码序列可操作地连接；或者当被定位以促进翻译时，核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列与其接触，或者意指分泌前导序列与其接触并存在于阅读框中。然而，所述增强子不需要与其接触。这些序列通过在便利的限制酶切位点处的连接(ligation/linkage)进行连接。当不存在这种位点时，根据常规方法使用合成寡核苷酸衔接子或接头。

如本文所用，术语“表达载体”通常是指其中插入了异源DNA片段的重组载体，并且通常意指双链DNA片段。在本文中，所述异源DNA是在宿主细胞中非天然存在的外源DNA。一旦表达载体存在于宿主细胞中，它就可以独立于宿主染色体DNA进行复制，并且可以产生载体和其插入的(异源)DNA的若干个拷贝。

如本领域所熟知的，为了增加转基因在宿主细胞中的表达水平，所述基因应当与在选择的表达宿主中起作用的转录/翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，所述表达控制序列和相应的基因被包括在一个含有细菌选择标记和复制起点二者的重组载体中。当所述表达宿主是真核细胞时，所述重组载体应当还包括在所述真核表达宿主中有用的表达标记。

多种多样的表达宿主/载体组合可以用于表达本发明的主题蛋白质的DNA序列。用于真核宿主的合适的表达载体包括例如源自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒和逆转录病毒的表达控制序列。可用于细菌宿主的表达载体包括细菌质粒，例如从大肠杆菌获得的那些(如pBlueScript、pGEX2T、pUC载体、col E1、pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)；具有广泛宿主范围的质粒，如RP4；噬菌体DNA，例如多种多样的噬菌体λ衍生物(如λgt10、λgt11和NM989)；以及其他DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。可用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。可用于昆虫细胞的载体是pVL 941。

用上述重组载体转染或转化的宿主细胞构成了本发明的另一个方面。如本文所用，术语“转染”意指将DNA引入宿主中并使所述DNA可通过染色体外因子或染色体整合进行复制。如本文所用，术语“转化”意指表达载体被宿主细胞容纳，而不论是否实际表达了任何编码序列。

本发明的宿主细胞可以是原核或真核细胞。此外，通常使用具有高的DNA引入效率和高的所引入DNA的表达效率的宿主。可使用的宿主细胞的例子包括熟知的真核和原核宿主，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属、链霉菌属、真菌和酵母、昆虫细胞(如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9))、动物细胞(如CHO和小鼠细胞、非洲绿猴细胞(如COS1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BMT 10)和组织培养的人细胞)。当克隆编码本发明的蛋白质的cDNA时，优选使用动物细胞作为宿主。在本发明中，例示了源自鱼的CHSE-214、FHM、RTG-2和EPC，但是本发明不限于此。当使用COS细胞时，SV40大T抗原在所述COS细胞中表达。因此，具有SV40复制起点的质粒在所述细胞中以多个附加体拷贝存在，因此可以预期更高的表达。所引入的DNA序列可以从与所述宿主细胞相同的物种获得，可以是与所述宿主细胞不同的物种，或者可以是包括任何异源或同源DNA的杂合DNA序列。

应当理解，并非所有载体在表达本发明的DNA序列时都同样地起作用。同样，并非所有宿主对同一表达系统都同样地起作用。然而，本领域技术人员将能够在没有过多的实验负担和不脱离本发明的范围的情况下从多种载体、表达控制序列和宿主进行适当的选择。例如，对载体的选择应当在考虑宿主的情况下进行，因为所述载体应当在其中复制。还应当考虑载体的复制数、控制复制数的能力和由相应载体编码的其他蛋白的表达(如抗生素标记的表达)。在选择所述表达控制序列时，应当考虑许多因素。例如，特别是关于可能的二级结构，应当考虑序列的相对强度、可控性和与本发明的DNA序列的相容性。可以鉴于诸如以下因素来选择单细胞宿主：选择的载体、由本发明的DNA序列编码的产物的毒性、分泌特征、准确折叠蛋白质的能力、培养和发酵因素、以及易于纯化由根据本发明的DNA序列编码的产物。在这些因素的范围内，本领域技术人员可以选择能够在发酵或大型动物培养中表达本发明的DNA序列的多种载体/表达控制序列/宿主组合。作为用于通过表达克隆来克隆蛋白质的cDNA的筛选方法，可以应用结合方法、淘选方法、膜乳液方法等。

在下文中，将参考以下实施例更加详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员而言将明显的是，以下实施例仅提供用于说明本发明，并且不应当解释为限制本发明的范围。

特别地，在以下实施例中，大肠杆菌WL3110或Val(pKBRilvBNCED)用作宿主微生物。然而，对于本领域技术人员而言将明显的是，也可以不受特别限制地使用其他大肠杆菌、细菌、酵母和真菌，只要它们本身能够产生前体氨基酸或将其用作碳源即可。此外，对于本领域技术人员而言也将明显的是，尽管在以下实施例中仅例示了源自特定菌株的基因作为待引入的基因，但可以不受特别限制地使用任何基因，只要它们在其所引入的宿主细胞中表达并展现出相同的活性即可。

[实施例1]

缬氨酸脱羧酶的纯化

1-1：pET22b_his_vlmD载体的产生

使用线性DNA作为模板以及SEQ ID NO:4和5的引物进行PCR，以获得编码在N末端具有his标记的缬氨酸脱羧酶的his_vlmD基因片段，所述线性DNA具有经密码子优化的vlmD基因(SEQ ID NO:3)，其被合成以促进源自生绿链霉菌菌株(Cosmogenetech，韩国首尔)的vlmD基因(SEQ ID NO:2)在大肠杆菌中的表达。

[SEQ ID NO:4]vlmD_opt_His6(NdeI,F)：

5′-AGACAGCATATGCATCATCACCATCACCACAGTACCAGCTCTGCCAGTTCC-3′

[SEQ ID NO:5]vlmD_opt_His6(EcoRI,R)：

5′-AGACAGGAATTCTTAGCTGCCACCGCCATC-3′

接下来，用限制酶(NdeI和EcoRI)处理由于T7启动子而显示出强基因表达的pET22b(+)质粒，然后将其用所获得的his_vlmD片段和T4 DNA连接酶处理，接着连接以产生重组质粒pET22b_his_vlmD(图2)。

1-2：缬氨酸脱羧酶的纯化

为了纯化缬氨酸脱羧酶，将实施例1-1中获得的质粒pET22b_his_vlmD引入大肠杆菌BL21(DE3)(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)，一种携带T7RNA聚合酶基因的原噬菌体)中。(New England Biolabs，美国)。将经转化的菌株接种于10mL含25mg/L卡那霉素的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/L NaCl)中，并且在37℃下以200rpm连续振荡进行初始培养。然后，将1％的菌株接种于200mL的相同培养基中，并且在37℃下以200rpm连续振荡进行培养。

然后，用分光光度计在600nm的波长下测量培养液的O.D.，并且当O.D.为0.4时，以1mM添加IPTG来诱导his_vlmD表达并再次进行培养。诱导表达后4小时，将培养液以3,000rpm且在4℃下离心10分钟，之后分离微生物并去除上清液。然后，将所分离的微生物悬浮于40mL平衡缓冲液(50mM Na₃PO₄、300mM NaCl，pH 7.0)中，然后通过以下方法将微生物破坏2小时：使用细胞超声发生器以30％强度施加脉冲5秒，然后使其静置5秒。然后，在4℃下以13,200rpm进行10分钟离心，以去除细胞碎片，从而获得细胞裂解物。将细胞裂解物通过0.45μm过滤器进行过滤以去除杂质，然后使用Talon树脂从中分离his标记的缬氨酸脱羧酶。首先，用含有7.5mM咪唑的平衡缓冲液进行洗涤，以去除附着在Talon树脂上的杂质。然后，使用含有150mM咪唑的平衡缓冲液通过分级来分离缬氨酸脱羧酶。然后，将全细胞裂解物、已通过talon树脂的蛋白质溶液和用每种浓度的咪唑获得的蛋白质溶液全部与5xLaemmli样品缓冲液混合，接着使用12％SDS-PAGE分离并用考马斯亮蓝R250(Bio-Rad，美国)溶液染色(图3)。作为结果，以120mM的最高纯度纯化的缬氨酸脱羧酶用作酶溶液，然后将其用于酶活性测定。

[实施例2]

缬氨酸脱羧酶的酶活性测定

使用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)进行酶活性测定，并且将测定所用的底物和酶按以下量添加到酶反应溶液中。

以1mM的浓度使用用作底物的氨基酸，并且本文使用的氨基酸是L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸和L-2-苯甘氨酸。添加0.1mM磷酸吡哆醛(PLP)和150μg经纯化的缬氨酸脱羧酶，接着在37℃下进行2小时反应，并且通过HPLC分析反应后的样品以鉴定伯胺。

从图4可以看出，使用L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸和L-2-苯甘氨酸作为底物进行的HPLC分析的结果显示，检测到对应于乙胺、正丙胺、异丙胺、正丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、正戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺的峰(图4)。

使用HPLC(1100系列HPLC；Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉)分析伯胺产生。在使用邻苯二甲醛(OPA；Sigma，密苏里州圣路易斯)试剂分析之前，以自动方式进行用于分析的伯胺衍生化。通过以下方法制备用于衍生化的OPA试剂：将0.20g OPA试剂溶解于9.0mL甲醇中，然后向其中添加1.0mL 0.40M(pH 9.0)硼酸盐缓冲液和160μL 2-巯基乙醇。为了进行衍生化，将1μL样品与5μL 0.40M(pH 9.0)硼酸盐缓冲液混合。然后，向其中添加1μL上述制备的用于衍生化的OPA试剂，接着进行HPLC分析。在25℃下使用Eclipseplus C18柱(4.6x 150mm；Agilent Technologies)进行分析。通过以下方法制备用于分析的溶剂A：将1.4g/L Na₂HPO₄和3.8g/LNa₂B₄O₇·10H₂O与8mg/L NaN₃混合，并且使用HCl将所得混合物的最终pH调节至7.2。通过将基于体积％的45％乙腈和45％甲醇与10％H₂O混合来制备溶剂B。将所述溶剂以2mL/min的速度进料。将溶剂A和B每次以如下速率进料：将溶剂A在0-0.5分钟时以100％的速率进料；溶剂B的流量在0.5-18分钟时从0％至57％线性增加；溶剂B的流量在18-26分钟时从57％至100％线性增加；溶剂B在26-29分钟时以100％的速度流动；最后，溶剂B的流量在29-30分钟时从100％至0％线性减少。可以通过使用可变波长检测器(G1314A；Agilent Technologies)检测波长为230nm的光来分析衍生化的仲胺。

上述结果显示，实施例1中获得的缬氨酸脱羧酶成功地将L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸和L-2-苯甘氨酸分别转化为乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺。

[实施例3]

pTac15k_vlmD载体的产生

使用线性DNA(Cosmogenetech，韩国首尔)作为模板以及SEQ ID NO:6和7的引物进行PCR，以获得编码缬氨酸脱羧酶的vlmD基因，所述线性DNA具有经密码子优化的vlmD基因(SEQ ID NO:3)，其被合成以促进在大肠杆菌中的表达。

[SEQ ID NO:6]vlmD_opt(EcoR1,F1)：

5′-AGACAGGAATTCATGTCAACTTCCTCCGCTTCTTCCG-3′

[SEQ ID NO:7]vlmD_opt(KpnI,R1)：

5′-AGACAGGGTACCTCAGCTCCCGCCGCCGT-3′

然后，用限制酶(EcoRI和KpnI)处理由于tac启动子而强表达所述基因的pTac15k(Hiszczyńska-Sawicka和Kur,1997)质粒，然后使用T4 DNA连接酶将其与所获得的vlmD片段连接以产生重组质粒pTac15k_vlmD(图5)。

[实施例4]

鉴定使用表达编码脱羧酶的vlmD基因的突变微生物由氨基酸产生多种类型的伯胺

通过将实施例3中产生的pTac15k_vlmD(即含有编码脱羧酶的vlmD基因的质粒)引入大肠杆菌WL3110中来构建突变微生物，并且鉴定所述突变微生物是否由氨基酸产生伯胺。

将引入了作为空白载体的pTac15k的大肠杆菌WL3110用作对照。

在补充有25mg/L卡那霉素的LB平板培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl)中选择突变微生物。将经转化的菌株接种于10mL LB培养基中，接着在37℃下预培养8小时。然后，将1.5mL经预培养的培养液接种于350mL烧瓶中的50mL改良MR培养基中，接着进行培养。

所述改良MR培养基是由10g葡萄糖、6.67g KH₂PO₄、4g(NH₄)₂HPO₄、0.8g MgSO₄·7H₂O、0.8g柠檬酸和5ml微量金属溶液(相对于1升蒸馏水)组成的培养基。所述微量金属溶液由10g FeSO₄·7H₂O、2g CaCl₂、2.2gZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02g Na₂B₄O₇·10H₂O(相对于1升蒸馏水)组成。

此外，将分别用作伯胺的前体的氨基酸以2g/L的浓度添加，并且本文使用的氨基酸是L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸和1-氨基环己烷羧酸。

在37℃下以200rpm振荡进行36小时培养。培养完成后，将培养液以13,200rpm离心10分钟，仅收集上清液，并且以与实施例2中相同的方式进行HPLC分析以鉴定伯胺的产生。

从图6可以看出，根据本发明的突变微生物产生了乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺和环己胺。

[实施例5]

pTac15k_vlmD alaD载体的产生

使用线性DNA(Cosmogenetech，韩国首尔)作为模板以及SEQ ID NO:9和10的引物进行PCR，以获得编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因片段，所述线性DNA具有源自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的编码L-丙氨酸脱氢酶的经密码子优化的alaD基因(SEQ ID NO:8)，其被合成以促进在大肠杆菌中的表达。

[SEQ ID NO:9]alaD_opt(Kpn1,F1)：

5′-AGACAGGGTACCTTTCACACAGGAAACAATGAAAATTGGTATACCGAAGGAA-3′

[SEQ ID NO:10]vlmD_opt(Pst1,R1)：

5′-AGACAGCTGCAGTCATCCTTGCAGAAGAGAATGGAAGCGAATTTTATCAGC-3′

然后，用限制酶(KpnI和PstI)处理实施例3中产生的pTac15k-vlmD质粒，然后使用T4 DNA连接酶将其与所获得的alaD片段连接以产生重组质粒pTac15k_vlmD_alaD。(图7)。

[实施例6]

pTac15k_vlmD_pTac_leuABCD载体的产生

使用大肠杆菌菌株(Coli Genetic Stock Center)的染色体DNA作为模板以及SEQID NO:11和12的引物进行PCR，并且用这样获得的线性DNA作为模板以及SEQ ID NO:13和14的引物再次进行PCR，以获得具有tac启动子和编码亮氨酸生物合成代谢回路的leuABCD基因二者的DNA片段。

[SEQ ID NO:11]leuABCD(Pst1,F1)：

5′-GCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAATGAGCCAGCAAGTCATTATTTT-3′

[SEQ ID NO:12]leuABCD(Pst1,R1)：

5′-TTAATTCATAAACGCAGGTTGTTT-3′

[SEQ ID NO:13]leuABCD(Pst1,F2)：

5′-AGACAGCTGCAGGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTG-3′

[SEQ ID NO:14]leuABCD(Pst1,R2)：

5′-AGACAGCTGCAGTTAATTCATAAACGCAGGTTGTTTTGTCCGAGCCGGAAGAG-3′

然后，用限制酶(PstI)处理实施例3中产生的pTac15k-vlmD质粒，然后使用T4 DNA连接酶将其与所获得的pTac_leuABCD片段连接以产生重组质粒pTac15k_vlmD_pTac-leuABCD(图8)。

[实施例7]

鉴定使用表达编码脱羧酶的vlmD基因的突变微生物由葡萄糖产生多种类型的伯胺

7-1：鉴定使用表达编码脱羧酶的vlmD基因的突变微生物由葡萄糖产生乙胺

通过将实施例5中产生的pTac15k_vlmD_alaD(即含有编码脱羧酶的vlmD基因和编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的质粒)引入大肠杆菌WL3110中来构建突变微生物，并且鉴定所述突变微生物是否由葡萄糖产生伯胺。

将引入了作为空白载体的pTac15k的大肠杆菌WL3110用作对照。

所述改良MR培养基是由20g葡萄糖、6.67g KH₂PO₄、4g(NH₄)₂HPO₄、0.8g MgSO₄·7H₂O、0.8g柠檬酸和5ml微量金属溶液(相对于1升蒸馏水)组成的培养基。所述微量金属溶液由10g FeSO₄·7H₂O、2g CaCl₂、2.2gZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02g Na₂B₄O₇·10H₂O(相对于1升蒸馏水)组成。

在37℃下以200rpm振荡进行36小时培养。培养完成后，将培养液以13,200rpm离心10分钟，仅收集上清液，并且以与实施例2中相同的方式进行HPLC分析以鉴定乙胺的产生。

从图9可以看出，作为对照的用空白载体转化的突变微生物不产生乙胺，而根据本发明的突变微生物由葡萄糖产生了76.28mg/L乙胺。

7-2：鉴定使用表达编码脱羧酶的vlmD基因的突变微生物由葡萄糖产生异丁胺

通过将实施例3中产生的pTac15k_vlmD(即含有编码脱羧酶的vlmD基因的质粒)引入大肠杆菌Val(pKBRilvBNCED)中来构建突变微生物，并且鉴定所述突变微生物是否由葡萄糖产生异丁胺。

将引入了作为空白载体的pTac15k的大肠杆菌Val(pKBRilvBNCED)用作对照。

在补充有25mg/L卡那霉素的LB平板培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl)中选择突变微生物。将经转化的菌株接种于10mL LB培养基中，接着在37℃下预培养8小时。然后，将1.5mL经预培养的培养液接种于350mL烧瓶中的50mL NM2培养基中，接着进行培养。

所述NM2培养基由50g葡萄糖、30g CaCO₃、12.5g(NH₄)₂SO₄、4.0gKH₂PO₄、2.0gMgSO₄·7H₂O、2.0g酵母提取物、0.262g L-异亮氨酸、0.262gL-亮氨酸、0.425mg D-泛酸钠和5ml微量金属溶液(相对于1升蒸馏水)组成。所述微量金属溶液由10g FeSO₄·7H₂O、2gCaCl₂、2.2g ZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02gNa₂B₄O₇·10H₂O(相对于1升蒸馏水)组成。

在30℃下以200rpm振荡进行48小时培养。培养完成后，将培养液以13,200rpm离心10分钟，仅收集上清液，并且以与实施例2中相同的方式进行HPLC分析以鉴定异丁胺的产生。

从图10可以看出，作为对照的用空白载体转化的突变微生物不产生异丁胺，而根据本发明的突变微生物由葡萄糖产生了1155.74mg/L异丁胺。

7-3：鉴定使用表达编码脱羧酶的vlmD基因的突变微生物由葡萄糖产生异戊胺

通过将实施例5-2中产生的pTac15k_vlmD_pTac_leuABCD(即含有编码脱羧酶的vlmD基因和编码L-亮氨酸生物合成代谢回路的leuABCD基因的质粒)引入大肠杆菌Val(pKBRilvBNCED)中来构建突变微生物，并且鉴定所述突变微生物是否由葡萄糖产生异戊胺。

所述改良NM2培养基由50g葡萄糖、30g CaCO₃、12.5g(NH₄)₂SO₄、4.0g KH₂PO₄、2.0gMgSO₄·7H₂O、2.0g酵母提取物、0.262g L-异亮氨酸、0.262g L-亮氨酸、0.425mg D-泛酸钠和5ml微量金属溶液(相对于1升蒸馏水)组成。所述微量金属溶液由10g FeSO₄·7H₂O、2gCaCl₂、2.2g ZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02gNa₂B₄O₇·10H₂O(相对于1升蒸馏水)组成。

在30℃下以200rpm振荡进行48小时培养。培养完成后，将培养液以13,200rpm离心10分钟，仅收集上清液，并且以与实施例2中相同的方式进行HPLC分析以鉴定异戊胺的产生。

从图11可以看出，作为对照的用空白载体转化的突变微生物不产生异戊胺，而根据本发明的突变微生物由葡萄糖产生了92.23mg/L异戊胺。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选实施方案，并且不应当解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 韩国科学技术院

<120> 使用酶促转化由氨基酸制备伯胺的方法

<130> PF-B2532

<150> KR 10-2020-0042756

<151> 2020-04-08

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 594

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生绿链霉菌的缬氨酸脱羧酶 (valine decarboxylase of Streptomycesviridifaciens)

<400> 1

Met Ser Thr Ser Ser Ala Ser Ser Gly Pro Asp Leu Pro Phe Gly Pro

1 5 10 15

Glu Asp Thr Pro Trp Gln Lys Ala Phe Ser Arg Leu Arg Ala Val Asp

20 25 30

Gly Val Pro Arg Val Thr Ala Pro Ser Ser Asp Pro Arg Glu Val Tyr

35 40 45

Met Asp Ile Pro Glu Ile Pro Phe Ser Lys Val Gln Ile Pro Pro Asp

50 55 60

Gly Met Asp Glu Gln Gln Tyr Ala Glu Ala Glu Ser Leu Phe Arg Arg

65 70 75 80

Tyr Val Asp Ala Gln Thr Arg Asn Phe Ala Gly Tyr Gln Val Thr Ser

85 90 95

Asp Leu Asp Tyr Gln His Leu Ser His Tyr Leu Asn Arg His Leu Asn

100 105 110

Asn Val Gly Asp Pro Tyr Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Leu Asn Ser Lys

115 120 125

Val Leu Glu Arg Ala Val Leu Asp Tyr Phe Ala Ser Leu Trp Asn Ala

130 135 140

Lys Trp Pro His Asp Ala Ser Asp Pro Glu Thr Tyr Trp Gly Tyr Val

145 150 155 160

Leu Thr Met Gly Ser Ser Glu Gly Asn Leu Tyr Gly Leu Trp Asn Ala

165 170 175

Arg Asp Tyr Leu Ser Gly Lys Leu Leu Arg Arg Gln His Arg Glu Ala

180 185 190

Gly Gly Asp Lys Ala Ser Val Val Tyr Thr Gln Ala Leu Arg His Glu

195 200 205

Gly Gln Ser Pro His Ala Tyr Glu Pro Val Ala Phe Phe Ser Gln Asp

210 215 220

Thr His Tyr Ser Leu Thr Lys Ala Val Arg Val Leu Gly Ile Asp Thr

225 230 235 240

Phe His Ser Ile Gly Ser Ser Arg Tyr Pro Asp Glu Asn Pro Leu Gly

245 250 255

Pro Gly Thr Pro Trp Pro Thr Glu Val Pro Ser Val Asp Gly Ala Ile

260 265 270

Asp Val Asp Lys Leu Ala Ser Leu Val Arg Phe Phe Ala Ser Lys Gly

275 280 285

Tyr Pro Ile Leu Val Ser Leu Asn Tyr Gly Ser Thr Phe Lys Gly Ala

290 295 300

Tyr Asp Asp Val Pro Ala Val Ala Gln Ala Val Arg Asp Ile Cys Thr

305 310 315 320

Glu Tyr Gly Leu Asp Arg Arg Arg Val Tyr His Asp Arg Ser Lys Asp

325 330 335

Ser Asp Phe Asp Glu Arg Ser Gly Phe Trp Ile His Ile Asp Ala Ala

340 345 350

Leu Gly Ala Gly Tyr Ala Pro Tyr Leu Gln Met Ala Arg Asp Ala Gly

355 360 365

Met Val Glu Glu Ala Pro Pro Val Phe Asp Phe Arg Leu Pro Glu Val

370 375 380

His Ser Leu Thr Met Ser Gly His Lys Trp Met Gly Thr Pro Trp Ala

385 390 395 400

Cys Gly Val Tyr Met Thr Arg Thr Gly Leu Gln Met Thr Pro Pro Lys

405 410 415

Ser Ser Glu Tyr Ile Gly Ala Ala Asp Thr Thr Phe Ala Gly Ser Arg

420 425 430

Asn Gly Phe Ser Ser Leu Leu Leu Trp Asp Tyr Leu Ser Arg His Ser

435 440 445

Tyr Asp Asp Leu Val Arg Leu Ala Ala Asp Cys Asp Arg Leu Ala Gly

450 455 460

Tyr Ala His Asp Arg Leu Leu Thr Leu Gln Asp Lys Leu Gly Met Asp

465 470 475 480

Leu Trp Val Ala Arg Ser Pro Gln Ser Leu Thr Val Arg Phe Arg Gln

485 490 495

Pro Cys Ala Asp Ile Val Arg Lys Tyr Ser Leu Ser Cys Glu Thr Val

500 505 510

Tyr Glu Asp Asn Glu Gln Arg Thr Tyr Val His Leu Tyr Ala Val Pro

515 520 525

His Leu Thr Arg Glu Leu Val Asp Glu Leu Val Arg Asp Leu Arg Gln

530 535 540

Pro Gly Ala Phe Thr Asn Ala Gly Ala Leu Glu Gly Glu Ala Trp Ala

545 550 555 560

Gly Val Ile Asp Ala Leu Gly Arg Pro Asp Pro Asp Gly Thr Tyr Ala

565 570 575

Gly Ala Leu Ser Ala Pro Ala Ser Gly Pro Arg Ser Glu Asp Gly Gly

580 585 590

Gly Ser

<210> 2

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 生绿链霉菌的缬氨酸脱羧酶(valine decarboxylase of Streptomycesviridifaciens)

<400> 2

gtgtcaactt cctccgcttc ttccgggccg gacctcccct tcgggcccga ggacacgcca 60

tggcagaagg ccttcagcag gctgcgggcg gtggatggcg tgccgcgcgt caccgcgccg 120

tccagtgatc cgcgtgaggt ctacatggac atcccggaga tccccttctc caaggtccag 180

atccccccgg acggaatgga cgagcagcag tacgcagagg ccgagagcct cttccgccgc 240

tacgtagacg cccagacccg caacttcgcg ggataccagg tcaccagcga cctcgactac 300

cagcacctca gtcactatct caaccggcat ctgaacaacg tcggcgatcc ctatgagtcc 360

agctcctaca cgctgaactc caaggtcctt gagcgagccg ttctcgacta cttcgcctcc 420

ctgtggaacg ccaagtggcc ccatgacgca agcgatccgg aaacgtactg gggttacgtg 480

ctgaccatgg gctccagcga aggcaacctg tacgggttgt ggaacgcacg ggactatctg 540

tcgggcaagc tgctgcggcg ccagcaccgg gaggccggcg gcgacaaggc ctcggtcgtc 600

tacacgcaag cgctgcgaca cgaagggcag agtccgcatg cctacgagcc ggtggcgttc 660

ttctcgcagg acacgcacta ctcgctcacg aaggccgtgc gggttctggg catcgacacc 720

ttccacagca tcggcagcag tcggtatccg gacgagaacc cgctgggccc cggcactccg 780

tggccgaccg aagtgccctc ggttgacggt gccatcgatg tcgacaaact cgcctcgttg 840

gtccgcttct tcgccagcaa gggctacccg atactggtca gcctcaacta cgggtcaacg 900

ttcaagggcg cctacgacga cgtcccggcc gtggcacagg ccgtgcggga catctgcacg 960

gaatacggtc tggatcggcg gcgggtatac cacgaccgca gtaaggacag tgacttcgac 1020

gagcgcagcg gcttctggat ccacatcgat gccgccctgg gggcgggcta cgctccctac 1080

ctgcagatgg cccgggatgc cggcatggtc gaggaggcgc cgcccgtttt cgacttccgg 1140

ctcccggagg tgcactcgct gaccatgagc ggccacaagt ggatgggaac accgtgggca 1200

tgcggtgtct acatgacacg gaccgggctg cagatgaccc cgccgaagtc gtccgagtac 1260

atcggggcgg ccgacaccac cttcgcgggc tcccgcaacg gcttctcgtc actgctgctg 1320

tgggactacc tgtcccggca ttcgtatgac gatctggtgc gcctggccgc cgactgcgac 1380

cggctggccg gctacgccca cgaccggttg ctgaccttgc aggacaaact cggcatggat 1440

ctgtgggtcg cccgcagccc gcagtccctc acggtgcgct tccgtcagcc atgtgcagac 1500

atcgtccgca agtactcgct gtcgtgtgag acggtctacg aagacaacga gcaacggacc 1560

tacgtacatc tctacgccgt tccccacctc actcgggaac tcgtggatga gctcgtgcgc 1620

gatctgcgcc agcccggagc cttcaccaac gctggtgcac tggaggggga ggcctgggcc 1680

ggggtgatcg atgccctcgg ccgcccggac cccgacggaa cctatgccgg cgccttgagc 1740

gctccggctt ccggcccccg ctccgaggac ggcggcggga gctga 1785

<210> 3

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的缬氨酸脱羧酶(codon optimized valine decarboxylase)

<400> 3

atgagtacca gctctgccag ttccggtccg gacctgccgt ttggtccgga agatacgccg 60

tggcaaaaag ctttctcccg tctgcgtgcc gttgatggcg tcccgcgtgt gaccgccccg 120

tcatcggacc cgcgtgaagt ttacatggat attccggaaa tcccgtttag caaagtccag 180

attccgccgg acggtatgga tgaacagcaa tacgcagaag ctgaatctct gtttcgtcgc 240

tatgtggatg cccagacccg caacttcgca ggctatcaag ttacgagcga tctggactat 300

cagcatctgt ctcactacct gaatcgtcat ctgaacaatg ttggtgatcc gtatgaaagc 360

tctagttaca ccctgaacag caaagttctg gaacgcgccg tcctggatta ttttgccagt 420

ctgtggaatg caaaatggcc gcacgacgca tccgatccgg aaacctattg gggctacgtg 480

ctgacgatgg gttcctcaga aggcaacctg tatggtctgt ggaatgcccg cgactacctg 540

agcggtaaac tgctgcgtcg ccaacatcgt gaagctggcg gtgataaagc gtcagtggtt 600

tatacccagg cactgcgtca tgaaggccaa tcgccgcacg cctacgaacc ggttgcattt 660

ttcagtcagg atacccatta ttccctgacg aaagcggtcc gcgtgctggg cattgacacc 720

tttcactcta tcggttcgag ccgttatccg gatgaaaacc cgctgggtcc gggcaccccg 780

tggccgacgg aagttccgag cgtcgatggc gctattgatg ttgacaaact ggcgtcactg 840

gtccgctttt tcgcctcgaa aggttatccg atcctggtta gcctgaatta cggctctacc 900

ttcaagggtg cgtatgatga tgtgccggcg gttgcacagg cagtccgtga tatttgcacg 960

gaatacggcc tggaccgtcg ccgtgtgtat catgatcgct ctaaagatag tgactttgat 1020

gaacgtagtg gtttctggat tcacattgat gccgcactgg gtgctggtta tgccccgtat 1080

ctgcaaatgg cccgcgacgc aggcatggtc gaagaagcac cgccggtgtt tgatttccgt 1140

ctgccggaag ttcattctct gaccatgagt ggccacaaat ggatgggtac gccgtgggcc 1200

tgtggtgtgt acatgacccg taccggtctg caaatgaccc cgccgaaatc tagtgaatat 1260

atcggtgcag ctgacaccac gtttgccggc agccgcaacg gtttctcctc actgctgctg 1320

tgggattatc tgtcccgtca ttcatacgat gacctggttc gcctggcggc cgactgtgat 1380

cgtctggctg gctatgcgca cgatcgcctg ctgaccctgc aagacaaact gggtatggat 1440

ctgtgggtgg cacgttcgcc gcaaagcctg acggttcgct ttcgtcagcc gtgcgctgac 1500

attgtccgta aatactcgct gagctgtgaa accgtgtatg aagataacga acaacgcacg 1560

tatgtgcatc tgtacgcggt tccgcacctg acccgtgaac tggtcgacga actggttcgt 1620

gatctgcgtc agccgggtgc cttcaccaat gctggcgcgc tggaaggtga agcatgggca 1680

ggcgtgattg atgcgctggg tcgtccggac ccggatggca cctatgctgg tgcgctgtcc 1740

gcaccggcat caggtccgcg tagcgaagat ggcggtggca gctaa 1785

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

agacagcata tgcatcatca ccatcaccac agtaccagct ctgccagttc c 51

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

agacaggaat tcttagctgc caccgccatc 30

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

agacaggaat tcatgtcaac ttcctccgct tcttccg 37

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

agacagggta cctcagctcc cgccgccgt 29

<210> 8

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的alaD(codon optimized alaD)

<400> 8

atgaaaattg gtataccgaa ggaaattaaa aataatgaaa accgcgttgc cattacacct 60

gccggtgtga tgactttagt caaggccggg cacgacgtgt atgtcgaaac cgaagcaggg 120

gcgggcagcg gcttttccga ttcggaatat gaaaaagcag gagcagttat agttactaag 180

gccgaagacg cctgggcggc tgaaatggtt ttgaaagtaa aggagcccct ggcagaggaa 240

tttcggtact ttagaccggg acttatatta tttacctacc ttcatttagc ggcggccgag 300

gcgttgacga aggccctggt ggaacagaaa gttgtaggta tcgcctacga gacggtccaa 360

ctggccaacg gaagccttcc gttattaacc cctatgtccg aagtggccgg gcggatgtcc 420

gtccaggtcg gagcacagtt tttagaaaag ccacacggtg ggaagggcat tttattggga 480

ggggttccgg gggtacggcg tggaaaagtt acgattattg gggggggaac tgctggcact 540

aacgctgcca agatagcggt ggggttgggg gctgacgtca cgatacttga tataaacgcg 600

gaacgcctga gagagttaga cgatttgttc ggagatcaag ttaccacgtt gatgagcaat 660

tcatatcaca ttgcagaatg cgttagagaa agtgacctgg tagtgggtgc tgtgctgatc 720

cccggggcaa aggccccaaa gttagtaacc gaggagatgg tccgtagcat gacgccaggt 780

agtgtcttag tcgatgtcgc cattgaccag ggtggaatct tcgaaacaac cgaccgtgtc 840

acgacccatg acgaccccac ctatgtcaaa cacggtgtcg tacactatgc ggtcgcgaac 900

atgccaggag ctgtacctcg caccagcacg tttgcgctta ccaatgtgac catcccgtat 960

gccttgcaga tcgccaacaa gggataccgt gctgcctgtt tagataatcc agcgttgtta 1020

aagggtatca acaccttgga tggacatatc gtttacgagg ccgttgccgc agcacataat 1080

atgccatata ccgatgtcca ttctcttctg caaggatga 1119

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

agacagggta cctttcacac aggaaacaat gaaaattggt ataccgaagg aa 52

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

agacagctgc agtcatcctt gcagaagaga atggaagcga attttatcag c 51

<210> 11

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa caatgagcca 60

gcaagtcatt atttt 75

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

ttaattcata aacgcaggtt gttt 24

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

agacagctgc aggctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtg 57

<210> 14

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

agacagctgc agttaattca taaacgcagg ttgttttgtc cgagccggaa gag 53

Claims

1.一种能够由氨基酸产生伯胺的突变微生物，其中所述突变微生物中引入有编码缬氨酸脱羧酶的基因。

2.根据权利要求1所述的突变微生物，其中所述缬氨酸脱羧酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的突变微生物，其中编码所述缬氨酸脱羧酶的基因包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的序列。

4.根据权利要求1所述的突变微生物，其中所述伯胺选自乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺。

5.根据权利要求1所述的突变微生物，其中所述氨基酸选自L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸和L-2-苯甘氨酸。

6.根据权利要求1所述的突变微生物，其中所述微生物选自细菌、酵母和真菌。

7.一种制备伯胺的方法，其包括：

(a)培养根据权利要求1至6中任一项所述的突变微生物以产生伯胺；以及

(b)收集所产生的伯胺。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述伯胺选自乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺。

9.一种制备伯胺的方法，其包括：

(a)使缬氨酸脱羧酶与氨基酸反应以产生伯胺；以及

(b)收集所产生的伯胺。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述缬氨酸脱羧酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述氨基酸选自L-丙氨酸、L-2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、L-正缬氨酸、L-缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸和L-2-苯甘氨酸。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述伯胺选自乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、(R)-仲丁胺、戊胺、异戊胺、2-甲基丁胺、环戊胺、环己胺和苄胺。