CN113332325A - 超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法。其采用的试剂无挥发性和毒性，可高效环保的获得纯度较高的皂苷类物质。本发明的方法步骤为：1)对苦瓜进行清洗、切块、烘干、粉碎，然后过60目筛制成苦瓜粉；2)称取苦瓜粉，通过乙醇溶液进行超高压提取，获得苦瓜总皂苷提取液；3)将提取液离心，收集上清液，在40℃、转速90r/min的条件下旋转蒸发至无乙醇味，冷冻干燥后获得苦瓜总皂苷粉末；4)称取粗提苦瓜总皂苷粉末，按照料液比溶解于1‑丁基‑3‑甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中；5)充分搅拌，加入NaOH溶液，漩涡震荡至形成两相；6)在4℃、4000r/min的条件下离心至两相充分分离；7)收集富含皂苷的NaOH下相，用盐酸中和，冷冻干燥获得即可。
Description
技术领域
本发明属于食品医疗技术领域，涉及一种超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法。
背景技术
皂苷类物质是由异戊二烯衍生的苷元共价连接一个或多个糖基组成的一类化合物。由于皂苷中亲脂性皂苷元与亲水性糖侧链连接，导致皂苷具有亲脂性和亲水性，其水溶液在摇晃时会产生类似于肥皂的持续性泡沫，故而得名皂苷。大多数已知的皂苷是植物衍生的次生代谢物，但也有研究发现，在海洋动物海参和海星体内也存在几种皂苷。
苦瓜皂苷是一类苷元为三萜或甾体化合物的糖苷类化合物，由糖和苷元组成，每一种苦瓜皂苷类物质的区别在于含有不同的苷元结构。苦瓜皂苷根据其化学结构可分为三萜皂苷和甾体皂苷两大类。现有研究已从苦瓜及其提取物中分离纯化出苦瓜苷、苦瓜素等240多种葫芦烷型化合物。
皂苷类物质具有降血糖、抗炎、抗癌、改善便秘等多成功效。苦瓜中的生物活性成分有皂苷类、蛋白质、多糖、多酚类、固醇类等。其中皂苷类物质不仅能够通过调节机体细胞对葡萄糖的摄取，降低机体血糖水平，还可以通过多种途径起到缓解炎症的作用，除此之外，在抗癌、改善便秘等方面都发挥重要作用。
近年来已有多种技术应用到皂苷的提取中，包括超高压技术、溶剂浸提技术、超声波技术、微波技术、回流提取法等。其中溶剂浸提法所使用的多为有机溶剂，有较高的毒性和挥发性，且提取时间长、效率低下；超声波提取法和微波辅助提取法提取率低；回流提取法耗时长、操作复杂。与上述方法相比，超高压技术在生物活性成分提取方面具有操作简单、提取时间短、提取效率高等优点。
苦瓜提取物含有多种物质，是一个混合体系，因此皂苷类物质纯度较低不足以满足后续的研究，更不能满足工艺条件产业化的需求。为获得高纯度的皂苷，需要对苦瓜提取物进行纯化，以提高皂苷类物质的纯度。
皂苷纯化的方法主要有大孔树脂吸附法、双水相体系法、液液萃取法、膜分离法等，其中大孔树脂吸附法最为常见。然而苦瓜皂苷多为葫芦烷型三萜类化合物，具有较高的亲水性，且组分复杂与杂质分离困难，上述纯化皂苷的方法多用到有机溶剂，其挥发性和毒性对环境和人类健康不利，难以高效环保的获得纯度较高的皂苷类物质。近年来，双水相技术已被用于纯化多种材料中的皂苷类物质，具有操作简单、效率高、耗能小等优点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法，其采用的试剂无挥发性和毒性，可高效环保的获得纯度较高的皂苷类物质。
为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法，其特征在于：所述的方法步骤为：
步骤1)对苦瓜进行清洗、切块、烘干、粉碎，然后过60目筛制成苦瓜粉；
步骤2)称取苦瓜粉，通过乙醇溶液进行超高压提取，获得苦瓜总皂苷提取液；
步骤3)将提取液离心，收集上清液，在40℃、转速90r/min的条件下旋转蒸发至无乙醇味，冷冻干燥后获得苦瓜总皂苷粉末；
步骤4)称取适量粗提苦瓜总皂苷粉末，按照料液比溶解于1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中；
步骤5)室温充分搅拌，加入NaOH溶液，漩涡震荡至形成两相；
步骤6)在4℃、4000r/min的条件下离心至两相充分分离；
步骤7)收集富含皂苷的NaOH下相，用盐酸中和，冷冻干燥获得纯化后的苦瓜总皂苷粉末。
进一步，步骤2)的提取压力为300-600MPa，保压时间为2-14min，乙醇浓度为55％-85％，苦瓜粉与乙醇溶液的料液比为1:15-45g/mL。
进一步，步骤4)的料液比为1:6-14，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的浓度为0.5-2.5mol/L。
进一步，步骤5)的NaOH浓度为6.0-14.0％。
与现有技术相比，本发明的优点和效果如下：
1)本发明采用超高压提取，具有提取温度低、提取时间短、提取效率高等优点，同时还避免了热效应对生物活性成分的破坏。
2)本发明提取技术操作简便，能够较大程度的保留苦瓜总皂苷的生理活性，满足消费者对产品功能性和疗效的需求，具有广阔的应用市场。
3)本发明的目的是通过研究提取压力、保压时间、乙醇浓度以及料液比对苦瓜总皂苷提取量的影响，进一步确定苦瓜总皂苷的最佳提取工艺参数，为超高压提取苦瓜中的皂苷类物质提供依据。
4)本发明所使用的试剂无挥发性和毒性，对环境和人类无害；
5)本发明所使用的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，具有低挥发性、高稳定性，它能够通过多种阳离子与阴离子的组合设计，达到提取苦瓜总皂苷的目的；
6)本发明利用NaOH进行萃取分层，可较好分离苦瓜总皂苷和溶剂，达到纯化的目的；
7)本发明使用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体对苦瓜总皂苷进行纯化，可获得较高纯度的苦瓜总皂苷；
8)本发明纯化后苦瓜总皂苷纯度为76.06％，提取方法苦瓜总皂苷提取量为127.890mg/g。
9)本发明以单因素试验为基础，利用Box-Behnken方法进行试验设计，以苦瓜总皂苷的提取量为响应值，得到最佳提取条件。
附图说明
图1为提取压力对苦瓜总皂苷提取量的影响；
图2为保压时间对苦瓜总皂苷提取量的影响；
图3为乙醇浓度对苦瓜总皂苷提取量的影响；
图4为料液比对苦瓜总皂苷提取量的影响；
图5a为处理压力与保压时间对苦瓜总皂苷提取量的响应面图；
图5b为处理压力与乙醇浓度对苦瓜总皂苷提取量的响应面图；
图5c为保压时间与乙醇浓度对苦瓜总皂苷提取量的响应面图。
图6为[C4MIM]BF4浓度对苦瓜总皂苷纯度的影响；
图7为料液比对苦瓜总皂苷纯度的影响；
图8为NaOH浓度对苦瓜总皂苷纯度的影响；
图9a为[C4MIM]BF4浓度和料液比对苦瓜总皂苷纯度的响应面图；
图9b为[C4MIM]BF4浓度和NaOH浓度对苦瓜总皂苷纯度的响应面图；
图9c为料液比和NaOH浓度对苦瓜总皂苷纯度的响应面图。
具体实施方式
为了使本发明专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明专利，并不用于限定本发明专利。
离子液体(ILs)是一种液体盐，具有低挥发性、高稳定性，它能够通过多种阳离子与阴离子的组合设计，达到提取不同目标化合物的目的。本发明选取1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C4MIM]BF4)作为离子液体，构建离子液体-碱性双水相体系，对苦瓜提取物中的总皂苷进行纯化。
本实施例提供一种超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法步骤为：
步骤1)对苦瓜进行清洗、切块、烘干、粉碎，然后过60目筛制成苦瓜粉；
步骤2)称取苦瓜粉，通过乙醇溶液进行超高压提取，获得苦瓜总皂苷提取液；
提取压力为300-600MPa，保压时间为2-14min，乙醇浓度为55％-85％,苦瓜粉与乙醇溶液的料液比为1:15-45g/mL。
步骤3)提取后的溶液离心，收集上清液，在40℃、转速90r/min的条件下旋转蒸发至无乙醇味，冷冻干燥后获得苦瓜总皂苷粉末；
步骤4)称取适量粗提苦瓜总皂苷粉末，按照料液比为1:6-14溶解于1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C4MIM]BF4)溶液；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的浓度为0.5-2.5mol/L；
步骤5)室温充分搅拌，加入适量浓度为6.0-14.0％的NaOH溶液，漩涡震荡至形成两相；
步骤6)在4℃、4000r/min的条件下离心至两相充分分离；
步骤7)收集富含皂苷的NaOH下相，用适量盐酸中和，冷冻干燥获得纯化后的苦瓜总皂苷粉末。
本发明采用以下方法测定苦瓜总皂苷含量，并计算苦瓜总皂苷提取量：
将步骤3)获得的冻干粉用乙醇复溶至10mL得粗苦瓜总皂苷溶液；
标准曲线的配置：称取20mg薯蓣皂苷标品，用乙醇定容至50mL。用乙醇稀释溶液分别配制浓度为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL的薯蓣皂苷标品溶液。按照梯度浓度吸取250μL标准品，加入250μL香草醛溶液，充分涡旋震荡后加入2.5mL 72％的浓硫酸，60℃水浴反应10min，冷却后用酶标仪于544nm处测定吸光值并绘制标准曲线。
苦瓜总皂苷提取量(mg/g)＝C/m
其中C是提取物中苦瓜总皂苷的含量，m代表苦瓜粉的重量。
1、单因素试验：
选取四个主要影响苦瓜总皂苷提取量的因素，即：处理压力、保压时间、乙醇浓度及料液比进行单因素试验；称取1.0g苦瓜粉末，以提取量为响应值，选取处理压力300、350、400、450、500、550、600MPa，保压时间2、4、6、8、10、12、14min，乙醇溶液浓度55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％以及料液比1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40及1:45条件下得到提取液，分别考察各因素对苦瓜总皂苷提取量的影响；
2、响应面优化试验：
在上述单因素试验的基础上，利用响应面分析法对提取条件进行进一步优化，根据Box-Behnken试验设计原理，选取处理压力(A)、保压时间(B)、乙醇浓度(C)及料液比(D)等4个因素为自变量，以苦瓜总皂苷提取量为响应值(Y)，进行四因素三水平的响应面试验分析，得到适宜工艺参数。试验因素与水平设计见表1：
表1 响应面试验设计因素与水平
3、单因素试验结果：
A：处理压力对苦瓜总皂苷提取量的影响
苦瓜总皂苷含量随压力变化为先增加后减少，在500MPa时，苦瓜总皂苷含量达到最大值，如图1所示。因此500MPa为苦瓜总皂苷提取的最佳压力条件。随着压力增大，苦瓜总皂苷含量增加，这是由于在超高压作用下，样品组织细胞破裂，苦瓜皂苷溶解更完全。当处理压力超过500MPa时，苦瓜总皂苷含量下降，这可能是由于处理压力过高时，组织细胞内外渗透压差过大，其他大分子物质溶出，皂苷浸出受到影响。
B：保压时间对苦瓜总皂苷提取量的影响
结果表明：苦瓜总皂苷含量随保压时间变化为先增加后减少，在保压时间为8min时，苦瓜总皂苷含量达到最大值，如图2所示。因此8min为苦瓜总皂苷提取的最佳保压时间。随着保压时间增长，苦瓜总皂苷含量增加，这是由于溶剂与苦瓜皂苷接触更为充分，当保压时间过长，组织中的其他成分浸出，皂苷类成分的溶出传质阻力增加。
C：乙醇浓度对苦瓜总皂苷提取量的影响
结果表明：当乙醇浓度为70％时，苦瓜总皂苷含量达到最大值，如图3所示。因此70％为苦瓜总皂苷提取的最佳乙醇浓度。当乙醇浓度过低时，溶液极性较大，苦瓜皂苷溶解不完全；当乙醇浓度继续增大时，由于溶液的介电常数与极性发生变化，组织细胞内蛋白质等大分子物质变性，产生凝聚，使得溶剂与苦瓜皂苷接触不充分。
D：料液比对苦瓜总皂苷提取量的影响
结果表明：随着料液比的增大，苦瓜总皂苷含量总体呈上升趋势，如图4所示。当料液比增加为1:30时，苦瓜总皂苷含量显著性增加，这是由于料液比增大，组织细胞内的苦瓜皂苷从固液表面扩散进入液相主体过程的速率不断增加；当料液比继续增加时，苦瓜总皂苷含量变化不明显，这可能是由于组织细胞内外皂苷的扩散速率达到平衡，料液比的继续增大会造成提取溶剂的浪费，因此确定超高压提取苦瓜总皂苷的适宜料液比为1:30。
4、响应面优化结果
表2 Box-Behnken响应面试验设计及结果
根据Box-Behnken原理设计试验，将苦瓜总皂苷提取量作为响应值，按照单因素试验结果，选择处理压力、保压时间、乙醇浓度及料液比等4个因素进行响应面优化，试验结果见表2；对试验数据进行回归分析后，拟合了响应值苦瓜总皂苷提取量(Y)与处理压力((A)、保压时间((B)乙醇浓度(C)及料液比(D)的数学回归模型，可用以下的函数来表示：
Y＝124.59+1.56A+0.77B-8.51C-2.46D-5.55AB-5.22AC-0.42AD-6.18BC+0.62BD+0.75CD-7.33A2-6.98B2-14.33C2-4.80D2
表3 回归模型的方差分析
**表示极显著；*表示显著；
采用ANOVA对模型进行统计分析，由表3可知模型回归极显著(P<0.01)；失拟项不显著(P>0.05)，R2＝0.9209，Adj R2＝0.8418，说明该模型能够拟合真实水平，可以用其进行响应面优化试验。处理压力(A)、保压时间(B)乙醇浓度(C)及料液比(D)的交互作用的响应面三维图见附图5(a-c)；各因素对苦瓜总皂苷提取量的影响大小顺序为C>A>B>D，且A、B、C的P值均小于0.01，说明其对苦瓜总皂苷提取量的影响均极显著。
5、验证试验
根据所得到的模型，分析得出在试验范围内苦瓜总皂苷最佳提取工艺条件为：处理压力为509.86MPa，保压时间为8.25min，乙醇浓度为68.16％、料液比为1:33.57，在此条件下苦瓜总皂苷理论提取量为126.712mg/g。为了验证响应面法的可行性，参考模型给出的最佳条件，结合实际生产可操作性等因素，将最佳提取工艺调整为处理压力510MPa，保压时间8min，乙醇浓度68％、料液比1:35。在此条件下进行验证试验，结果显示，苦瓜总皂苷提取量为127.890mg/g，与理论预测值相比误差为0.929％。
本发明采用以下方法苦瓜总皂苷纯度：
称取一定量步骤7)纯化后的苦瓜总皂苷粉末，用乙醇复溶至100mL，准确吸取5μL测定苦瓜总皂苷含量；
标准曲线的配置：称取20mg薯蓣皂苷标品，用乙醇定容至50mL。用乙醇稀释溶液分别配制浓度为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL的薯蓣皂苷标品溶液。按照梯度浓度吸取250μL标准品，加入250μL香草醛溶液，充分涡旋震荡后加入2.5mL 72％的浓硫酸，60℃水浴反应10min，冷却后用酶标仪于544nm处测定吸光值并绘制标准曲线。
苦瓜总皂苷提取量(mg/g)＝提取物中苦瓜总皂苷的含量/苦瓜粉的重量；
苦瓜总皂苷纯度(％)＝(纯化后苦瓜总皂苷含量测定值/冻干粉重量)×100。
本发明所述的方法，其中响应面法优化离子液体-碱性双水相体系纯化试验；
以单因素试验为基础，利用Box-Behnken方法进行试验设计，以苦瓜总皂苷纯度为响应值，得到最佳纯化条件；
1、单因素试验：
选取三个主要影响苦瓜总皂苷纯度的因素，即：[C4MIM]BF4浓度、料液比和NaOH浓度进行单因素试验；称取0.5g苦瓜总皂苷粗提取物，以苦瓜总皂苷纯度为响应值，选取[C4MIM]BF4浓度0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mol/L，料液比1:6、1:8、1:10、1:12和1:14，NaOH浓度6.0％、8.0％、10.0％、12.0％和14.0％条件下得到纯化苦瓜总皂苷粉末，测定其中苦瓜总皂苷的含量并计算纯度，分别考察各因素对苦瓜总皂苷纯度的影响；
2、响应面优化试验：
在上述单因素试验的基础上，利用响应面分析法对纯化条件进行进一步优化，根据Box-Behnken试验设计原理，选取[C4MIM]BF4浓度((A)、料液比((B)及NaOH浓度(C)等3个因素为自变量，以苦瓜总皂苷纯度为响应值(Y)，进行三因素三水平的响应面试验分析，得到适宜工艺参数。试验因素与水平设计见表4：
表4 响应面试验设计因素与水平
3、单因素试验结果：
A：[C4MIM]BF4浓度对苦瓜总皂苷纯度的影响
[C4MIM]BF4浓度对苦瓜总皂苷纯度的影响如图6示。当[C4MIM]BF4浓度从0.5mol/L增加至2.0mol/L时，苦瓜总皂苷的纯度呈现逐渐增加的趋势(P<0.05)，当浓度为2.0mol/L时，达到最大值71.49％。这是由于[C4MIM]BF4具有很强的破坏细胞壁和溶解目标化合物的能力，随着其浓度的升高，样品组织细胞壁破裂，大量皂苷溶出与溶液中的NaOH发生中和反应质子化，从而富集到NaOH下相中，苦瓜总皂苷纯度升高。当[C4MIM]BF4浓度继续增加到2.5mol/L时，苦瓜总皂苷的纯度反而下降(P<0.05)，这是由于当[C4MIM]BF4浓度太高时(>2.0mol/L)，不利于双水相体系的形成，导致部分皂苷溶解在离子液体的上相中，没有与溶液中的NaOH发生中和反应富集到下相，因此导致苦瓜总皂苷纯度下降。
B：料液比对苦瓜总皂苷纯度的影响
料液比对苦瓜总皂苷纯度的影响如图7示。当料液比从1：6:增加至1：10时，苦瓜总皂苷的纯度逐渐增加(P<0.05)，当料液比1：10时，达到最大值72.95％。这是由于随着料液比的增加离子液体与样品组织细胞接触更完全，组织细胞壁破裂增加，大量皂苷溶出而富集在下相，导致苦瓜总皂苷纯度增加。当料液比继续增加时，苦瓜总皂苷的纯度反而降低(P<0.05)，这是由于料液比过大会使溶出的皂苷类物质浓度偏低，影响其与NaOH的中和反应，从而导致苦瓜总皂苷纯度下降。
C：NaOH浓度对苦瓜总皂苷纯度的影响
NaOH浓度对苦瓜总皂苷纯度的影响如图8示。当NaOH浓度从6.0％增加至10％时，苦瓜总皂苷的纯度呈现逐渐增加的趋势(P<0.05)，当NaOH浓度为10％时，达到最大值74.30％。这是由于随着NaOH浓度的增加，溶出的皂苷充分富集到下相，导致苦瓜总皂苷的纯度增加。当NaOH浓度继续增加时，苦瓜总皂苷的纯度变化趋于稳定，NaOH浓度为12％、14％时与10％时相比，苦瓜总皂苷纯度略有下降，但差异性不显著(P>0.05)。这是由于当NaOH浓度增加到一定值(10.0％)时，样品组织中溶出的皂苷类物质基本被完全质子化，因此随着NaOH浓度的继续增加苦瓜总皂苷纯度变化并不显著。
4、响应面优化结果
表5 Box-Behnken响应面试验设计及结果
根据Box-Behnken原理设计试验，将苦瓜总皂苷提取量作为响应值，按照单因素试验结果，选择[C4MIM]BF4浓度、料液比及NaOH浓度等3个因素进行响应面优化，试验结果见表5；[C4MIM]BF4浓度(A)、料液比(B)NaOH浓度(C)的交互作用的响应面三维图见附图9(a-c)。对试验数据进行回归分析后，拟合了响应值苦瓜总皂苷提取量(Y)与[C4MIM]BF4浓度(A)、料液比(B)及NaOH浓度(C)的数学回归模型，可用以下的函数来表示：
Y＝74.94+6.41A+4.72B-0.51C+0.50AB+0.57AC-1.32BC-10.69A2-10.00B2-6.67C2
表6 回归模型的方差分析
**表示极显著；*表示显著；
采用ANOVA对模型进行统计分析，由表6可知模型回归极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，R2＝0.9819，Adj R2＝0.9586，说明该模型能够拟合真实水平，可以用其进行响应面优化试验。
通过比较F值可以判断，各单因素对纯度的影响大小顺序为A>B>C，且A、B的P值均小于0.01，说明A和B对苦瓜总皂苷纯度的影响极显著，C的P值大于0.05，说明C对苦瓜总皂苷纯度的影响不显著；各因素的二次项影响大小为A2>B2>C2，且A2、B2、C2的P值小于0.01，说明对苦瓜总皂苷纯度的影响均极显著；
5、验证试验
根据所得到的模型，分析得出在试验范围内苦瓜总皂苷最佳纯化工艺条件为：[C4MIM]BF4浓度2.15mol/L，料液比1:10.49，NaOH浓度9.90％，在此条件下苦瓜总皂苷纯度为76.52％。考虑到实际操作和仪器可调参数的局限性，将试验参数进行调整为：[C4MIM]BF4浓度2.15mol/L，料液比1:10.5，NaOH浓度9.90％。在此条件下进行验证试验，结果显示苦瓜总皂苷纯度为76.06％，与理论预测值的相对误差为0.60％。
6、苦瓜总皂苷的组成鉴定
本发明根据LC-MS的试验结果对质谱数据进行分析，将苦瓜提取物中检测到化合物的理论质荷数与其试验质荷数之间进行比较，计算Δppm值，以评价化合物的准确性。如果Δppm值误差在±50ppm之间，则认为该化合物为正匹配。
LC-MS结果如表4所示。质谱检测表明在12.5-27.78min内能够发现大量m/z为437.30的皂苷基础骨架，这说明苦瓜提取物中含有皂苷类化合物，且皂苷类物质出峰时间集中在12.5-27.78min；苦瓜提取物中存在苦瓜苷A(m/z为657.41)、苦瓜苷L(m/z为658.45)、苦瓜素B(m/z为457.36)、苦瓜素J(m/z为455.34)四种葫芦烷型三萜类化合物。
表7 苦瓜提取物中的葫芦烷型三萜类化合物
本发明方法是一种新颖、高效的方法，通过单因素和响应面试验优化出的最佳纯化工艺，为苦瓜总皂苷的纯化研究提供了一定的参考性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
Claims (4)
1.超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法，其特征在于：所述的方法步骤为：
步骤1)对苦瓜进行清洗、切块、烘干、粉碎，然后过60目筛制成苦瓜粉；
步骤2)称取苦瓜粉，通过乙醇溶液进行超高压提取，获得苦瓜总皂苷提取液；
步骤3)将提取液离心，收集上清液，在40℃、转速90r/min的条件下旋转蒸发至无乙醇味，冷冻干燥后获得苦瓜总皂苷粉末；
步骤4)称取适量粗提苦瓜总皂苷粉末，按照料液比溶解于1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中；
步骤5)室温充分搅拌，加入NaOH溶液，漩涡震荡至形成两相；
步骤6)在4℃、4000r/min的条件下离心至两相充分分离；
步骤7)收集富含皂苷的NaOH下相，用盐酸中和，冷冻干燥获得纯化后的苦瓜总皂苷粉末。
2.根据权利要求1所述的超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法，其特征在于：所述的步骤2)的提取压力为300-600MPa，保压时间为2-14min，乙醇浓度为55％-85％，苦瓜粉与乙醇溶液的料液比为1:15-45g/mL。
3.根据权利要求1或2所述的超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法，其特征在于：所述的步骤4)的料液比为1:6-14，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的浓度为0.5-2.5mol/L。
4.根据权利要求3所述的超高压辅助法制备苦瓜总皂苷及其纯化方法，其特征在于：所述的步骤5)的NaOH浓度为6.0-14.0％。
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| 冯靖，等: "离子液体在提取天然产物活性物质中的应用", 《应用化工》 * |
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