CN113288934B - 泽兰提取物、其制备方法及用途 - Google Patents

泽兰提取物、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种泽兰提取物、其制备方法及用途。具体地，本发明涉及一种制备泽兰提取物的方法，包括下述步骤：(1)使用25％‑95％的乙醇溶液对泽兰进行提取，得到提取液；(2)将提取液进行浓缩，得到第一浓缩物。本发明还涉及该制备方法制得的泽兰提取物。本发明的泽兰提取物具有良好的抗骨质疏松效果。

Description

泽兰提取物、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种泽兰提取物、其制备方法及用途。具体地，本发明涉及泽兰提取物的医药用途。
背景技术
骨质疏松(osteoporosis,OP)是由多因素引起的一种以单位体积内骨量减少和骨组织微结构破坏为特征，从而导致骨脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢性疾病。美国国立卫生研究院定义骨质疏松是一种以骨强度受损，骨组织微结构退化(松质骨骨小梁变细、断裂、数目减少)和骨折危险性增加的骨骼疾病，骨强度是骨密度和骨质量的综合反映。骨质疏松可分为原发性OP和继发性OP两大类，绝经后OP 和老年性OP均属于原发性OP，骨质疏松患者一般无特殊临床表现, 但严重时常发生髋部、椎体或桡骨远端等处骨折。目前常用的OP治疗药物包括雌激素、骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和骨矿化物等。
对于绝经后骨质疏松症来说，激素替代治疗(hormone replacement therapy,HRT)是传统的作为绝经后妇女防治骨质疏松性骨折的“金标准”方法。HRT能够防止骨丢失，并且降低骨折的发生率。此外HRT还能改善绝经症状和预防结肠癌。但是，HRT长期使用时会导致雌激素样作用，主要表现为导致乳腺癌的危险性增加，在不添加孕激素的情况下子宫内膜癌的危险性增加。其它副作用还包括液体潴留、乳房胀痛、头痛及阴道不规则流血。在动物水平实验中，雌激素样作用最直接的证据是卵巢切除后，雌激素分泌大幅度减少，大鼠子宫应迅速萎缩，子宫指数降低，补充雌激素后子宫指数会大幅度提高。这些不良反应限制了HRT的应用。一般情况下中药引起的雌激素样作用远低于雌激素替代疗法，而且中药治疗骨质疏松症具有多年的历史依据，所以中药在预防和治疗骨质疏松中扮演着越来越重要的角色。
泽兰(Lycopi Herba)是唇形科植物毛叶地瓜儿苗(Lycopus lucidusTurcz.vat.hirtus Regel)的干燥地上部分(有时也指干燥全草)，分部于沼泽地、山野低洼地沟边潮湿处、溪流沿岸的灌木丛或高大草丛中。泽兰有增强子宫收缩、抗凝血、改善血瘀症等主要药理作用。临床上用于月经不调、经闭、痛经、产后瘀血腹疼、疮痈肿毒，水肿腹水。
目前，尚需要开发新的防治骨质疏松症的药物或手段。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，惊奇地发现，泽兰或者泽兰提取物(例如泽兰的乙醇提取物)具有良好的防治骨质疏松症特别是绝经后骨质疏松症的效果。本发明人还进一步发现，其用于防治骨质疏松症并不引起雌激素样作用。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种制备泽兰提取物的方法，包括下述步骤：
一种制备泽兰提取物的方法，包括下述步骤：
(1)使用25％-95％的乙醇溶液对泽兰进行浸泡、提取，得到提取液；
(2)将提取液进行浓缩，得到第一浓缩物；
优选地，还包括步骤(3)、(4)和(5)：
(3)将步骤(1)的提取液或者将步骤(2)的第一浓缩物用水稀释后离心，(得到上清液和沉淀物)，取上清液，上样大孔树脂柱(例如大孔树脂D101、D101-Ⅰ、DA201、DM301、HPD100或DM130)，
(4)使用水或者5％-60％的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(5)将洗脱液进行浓缩，得到第二浓缩物。
所述第一浓缩物或者第二浓缩物均可作为本发明的泽兰提取物。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的制备方法，其中，步骤(1)满足如下I.-VII.中的任意1种、任意2种、任意3种、任意 4种、任意5种、任意6种或者全部7种：
I.乙醇溶液的浓度为45％-75％、50％-75％、50％-70％、 55％-70％、55％-65％，例如55％、56％、57％、58％、59％、60％、 61％、62％、63％、64％、65％；特别优选为60％；
II.乙醇溶液的用量为泽兰的5-20倍量、8-15倍量或者10-12倍量；
III.泽兰为粉碎的或未经粉碎的泽兰；
IV.浸泡的时间为至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少 10小时或者至少12小时；
V.所述提取为回流提取；
VI.提取次数为1次或多次，例如1-4次；优选地，合并每次提取得到的提取液；和
VII.每次提取的时间为至少0.2小时、至少0.5小时、至少1小时、1-24小时、1-10小时或者1-5小时。
本领域技术人员知悉，回流提取时，加热的温度为保持提取体系或乙醇溶液为沸腾状态。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的制备方法，其中，步骤(2)和/或步骤(5)中，
所述浓缩为减压浓缩；
浓缩的温度为40℃-60℃，优选50℃；
优选地，所述第一浓缩物和/或所述第二浓缩物为浸膏。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的制备方法，其中，步骤(3)中，
重复上样至少1次、1-10次、1-6次、1-3次或者1-2次；
和/或
稀释的倍数为2-10倍或者4-5倍。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的制备方法，其中，步骤(3)中，离心在2℃-30℃、5℃-25℃下进行。优选地，离心的转速为大于每分钟1000转、大于每分钟2000转、大于每分钟3000转、大于每分钟5000转或者2000-6000转/分钟。优选地，离心时间为至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少 15分钟、1-30分钟、5-20分钟或者10-20分钟。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的制备方法，其中，步骤(3)中，在25℃下以每分钟5000转的速度离心5分钟。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的制备方法，其中，步骤(4)中，
乙醇溶液的浓度为5％-45％、5％-35％、5％-25％或者5％-15％；
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的制备方法，其中，步骤(4)中，
水或乙醇溶液的用量为大于或等于1倍柱体积、大于或等于2倍柱体积、大于或等于3倍柱体积、1-10倍柱体积；优选为4-5倍柱体积。
本发明的另一方面一种泽兰提取物，其由本发明中任一项所述的制备方法制得。
在本发明的一些实施方式中，所述的泽兰提取物，其用于治疗和/ 或预防骨质疏松症；
优选地，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症或继发性骨质疏松症；
优选地，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症或老年性骨质疏松症；
优选地，所述治疗和/或预防骨质疏松症不引起雌激素样作用；
优选地，泽兰提取物的给药剂量为每千克体重每天 50mg-1000mg、50mg-500mg、100mg-1000mg、100mg-500mg、 150mg-400mg、100mg-300mg、120mg-300mg、130mg-300mg、130mg-280mg、150mg-300mg、150mg-250mg、200mg或者250mg；所述体重可以是哺乳动物(例如人)的体重。
本发明人惊奇地发现，泽兰的乙醇提取物，例如包括前面的步骤 (1)-(2)的制备方法所制得的泽兰提取物，具有显著的治疗和/或预防骨质疏松的作用，而泽兰的水提物并不具有防治骨质疏松的效果。如本发明的实验例3的结果所显示，泽兰水提物(提取物7)对大鼠股骨骨密度没有影响。这说明了泽兰中抗骨质疏松的有效成分 主要为采用乙醇溶液所得的提取物。
本发明人还进一步发现，泽兰乙醇提取物经过离心和大孔树脂水洗脱后得到的提取物，例如包括前面的步骤(1)-(5)的制备方法所制得的泽兰提取物，其治疗和/或预防骨质疏松的效果更为显著，如实验例2的实验结果所显示，其甚至优于未经离心和大孔树脂水洗脱的泽兰乙醇提取物。说明了泽兰提取物防治骨质疏松的主要有效成分为极性较大的提取组分。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的泽兰提取物；
可选地，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物组合物还包含选自如下药物中的一种或多种：
钙剂、维生素D、双磷酸盐、雌激素例如雌二醇、雌激素受体调节剂、降钙素、甲状旁腺激素和骨保护素；
优选地，所述药物组合物用于治疗和/或预防骨质疏松症。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物的单位剂量，以哺乳动物(例如人)的体重约70千克为例并按照本发明的泽兰提取物的重量计算，为3.5g-70g、3.5g-35g、7g-70g、7g-35g、10.5g-28g、7g-21g、8.4g-21g、9.1g-21g、9.1g-19.6g、10.5g-21g、10.5g-17.5g、14g或者17.5g。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其包含有效量的本发明的泽兰提取物。
本发明的再一方面涉及一种组合药物产品，其包含独立包装的第一产品和第二产品，
其中，
所述第一产品包含本发明的泽兰提取物；
所述第二产品包含选自如下药物中的一种或多种：
钙剂、维生素D、双磷酸盐、雌激素例如雌二醇、雌激素受体调节剂、降钙素、甲状旁腺激素和骨保护素；
优选地，所述第一产品和所述第二产品还独立地包含一种或多种药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述第一产品包含有效量的本发明的泽兰提取物。
在本发明的一些实施方式中，所述第一产品包含的本发明的泽兰提取物为3.5g-70g、3.5g-35g、7g-70g、7g-35g、10.5g-28g、7g-21g、 8.4g-21g、9.1g-21g、9.1g-19.6g、10.5g-21g、10.5g-17.5g、14g或者17.5g。
本发明的再一方面涉及泽兰或者泽兰乙醇提取物在制备治疗和/ 或预防骨质疏松症的药物中的用途；
优选地，所述泽兰乙醇提取物为本发明的泽兰提取物；
优选地，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症或继发性骨质疏松症；
优选地，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症或老年性骨质疏松症。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的用途，其中，所述治疗和/或预防骨质疏松症不引起雌激素样作用。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的用途，其中，泽兰乙醇提取物的给药剂量为每千克体重每天50mg-1000mg、50mg-500mg、 100mg-1000mg、100mg-500mg、150mg-400mg、100mg-300mg、 120mg-300mg、130mg-300mg、130mg-280mg、150mg-300mg、 150mg-250mg、200mg或者250mg；所述体重可以是哺乳动物(例如人)的体重。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防骨质疏松症的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的泽兰乙醇提取物例如本发明的泽兰提取物的步骤；
优选地，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症或继发性骨质疏松症；
优选地，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症或老年性骨质疏松症；
优选地，所述治疗和/或预防骨质疏松症的方法不引起雌激素样作用。
本发明中涉及的乙醇溶液，如果没有特别说明，均指乙醇的水溶液。
本发明中，如果没有特别说明，所述乙醇的浓度或乙醇溶液的浓度为体积百分比浓度(v/v)％。
通常本发明的药物组合物含有作为主药的0.1重量％－90重量％的本发明的泽兰提取物。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将主药与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
术语“辅料”在本申请中是指用以将主药给药的赋形剂或者媒介物，其包括但不限于稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、包衣材料等。辅料在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中被一般性描述。辅料的实例包括但不限于单硬脂酸铝、硬脂酸铝、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交聚维酮、异硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、羟基乙基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基硬脂酸羟基二十八酯、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、乳糖一水合物、硬脂酸镁、甘露醇、微晶纤维素等。
本发明的泽兰提取物可配制成药物制剂，包括适用于口服给药的剂型，适用于胃肠外注射(例如静脉注射、皮下注射)的剂型(例如作为溶液剂)，适用于表面给药的剂型(例如作为软膏剂、贴剂或者乳膏剂)，以及适用于直肠给药的剂型(例如作为栓剂)等。
取决于待治疗的疾病和患者以及给药途径，本发明的药物制剂可以以不同剂量每日一次或者多次给药。给药剂量取决于许多因素，例如所要治疗或辅助治疗的骨质疏松症的严重程度，患者的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三、四个剂量形式给药。
可改变本发明药物组合物中各主药的实际剂量水平，以便能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
在本发明的一些实施方式中，泽兰提取物的给药剂量为按照哺乳动物(例如人)的每千克体重每天50mg-1000mg、50mg-500mg、 100mg-1000mg、100mg-500mg、150mg-400mg、100mg-300mg、 120mg-300mg、130mg-300mg、130mg-280mg、150mg-300mg、 150mg-250mg、200mg或者250mg。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。在本发明的一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物，优选为人。
发明的有益效果
本发明制得的泽兰提取物具有如下技术效果中的任意一项或者多项：
(1)提高骨骼例如股骨和/或胫骨的骨密度；
(2)增加骨骼例如股骨和/或胫骨的骨钙含量；
(3)改善骨骼例如股骨和/或胫骨的骨组织微结构；
(4)不引起雌激素样作用；
(5)具有明显的预防和/或治疗骨质疏松的效果。
附图说明
图1A-图1H：股骨micro-CT图，其中图1A-图1D为股骨远心端的纵切面，图1E-图1H为股骨远心端的横切面。其中：
图1A为假手术组(SHAM)股骨的横切面图；
图1B为模型组(OVX)股骨的横切面图；
图1C为雌二醇组股骨的横切面图；
图1D为泽兰提取物1组股骨的横切面图；
图1E为假手术组(SHAM)股骨的纵切面图；
图1F为模型组(OVX)股骨的纵切面图；
图1G为雌二醇组股骨的纵切面图；
图1H为泽兰提取物1组股骨的纵切面图。
图2A-图2D：股骨远心端石蜡切片图。其中：
图2A为假手术组(SHAM)股骨远心端石蜡切片图；
图2B为模型组(OVX)股骨远心端石蜡切片图；
图2C为雌二醇组股骨远心端石蜡切片图；
图2D为泽兰提取物1组股骨远心端石蜡切片图。
图3A-图3H：破骨细胞分化图。其中：
图3A为提取的单核-巨噬细胞前体细胞经M-CSF(50ng/mL) 处理10天后的形态图；
图3B为提取的单核-巨噬细胞前体细胞经M-CSF(50ng/mL) 处理3天，然后经M-CSF(50ng/mL)和RANKL(50ng/mL)共处理7天后的形态图；图中框内为多核融合的破骨细胞；
图3C为提取的单核-巨噬细胞前体细胞经M-CSF(50ng/mL) 处理3天，然后经M-CSF(50ng/mL)，RANKL(50ng/mL)和泽兰 20％乙醇提取物(25μg/mL)共处理7天后的形态图；图中框内为多核融合的破骨细胞；
图3D为提取的单核-巨噬细胞前体细胞经M-CSF(50ng/mL) 处理3天，然后经M-CSF(50ng/mL)，RANKL(50ng/mL)和泽兰 40％乙醇提取物(25μg/mL)共处理7天后的形态图；图中框内为多核融合的破骨细胞；
图3E为提取的单核-巨噬细胞前体细胞经M-CSF(50ng/mL) 处理3天，然后经M-CSF(50ng/mL)，RANKL(50ng/mL)和泽兰 60％乙醇提取物(25μg/mL)共处理7天后的形态图；图中框内为多核融合的破骨细胞；
图3F为提取的单核-巨噬细胞前体细胞经M-CSF(50ng/mL) 处理3天，然后经M-CSF(50ng/mL)，RANKL(50ng/mL)和泽兰 80％乙醇提取物(25μg/mL)共处理7天后的形态图；图中框内为多核融合的破骨细胞；
图3G为提取的单核-巨噬细胞前体细胞经M-CSF(50ng/mL) 处理3天，然后经M-CSF(50ng/mL)，RANKL(50ng/mL)和泽兰 95％乙醇提取物(25μg/mL)共处理7天后的形态图；图中框内为多核融合的破骨细胞；
图3H为图3A-3G中破骨细胞数量的统计分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
制备例1：泽兰提取物1的制备
1.原料、试剂和仪器
泽兰中药饮片，60％(v/v)乙醇溶液。
2.泽兰提取物1制备步骤：
(1)将4kg泽兰中药饮片使用10-12倍重量的60％(v/v)乙醇溶液浸泡约12小时，加热回流提取，提取4次，每次回流1小时；
(2)将步骤(1)得到的产物合并，过滤，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液在40℃-60℃的温度下进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰提取物1。
制备例2-6：泽兰提取物2-6的制备
1.原料、试剂和仪器
泽兰中药饮片，60％(v/v)乙醇溶液，25％(v/v)乙醇溶液，50％ (v/v)乙醇溶液，75％(v/v)乙醇溶液，95％(v/v)乙醇溶液，大孔树脂D101(粒径：0.3-1.25mm，平均孔径：
Figure BDA0002992380220000111
)，大孔树脂柱(柱长×内径：150cm×15cm)，高速离心机(Beckman)。
2.泽兰提取物2-6制备步骤：
(1)将20kg泽兰中药饮片使用10-12倍重量的60％(v/v)乙醇溶液浸泡约12小时，加热回流提取，提取4次，每次回流1小时；
(2)将步骤(1)得到的产物合并，过滤，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液在40℃-60℃的温度下进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰总提取物(重量约为4.1kg)。
(4)将步骤(3)得到的泽兰总提取物(重量约为4.1kg)加20 L水稀释，使用高速离心机在25℃以每分钟5000转的速度离心5分钟，取上清，得到泽兰总提取物的水溶液上清液，留下沉淀；
(5)使用大孔树脂D101进行分段分离，首先将10kg的大孔树脂D101装入大孔树脂柱中，使用95％(v/v)乙醇溶液浸泡大孔树脂 D101，浸泡约12小时，使其充分溶胀，接着用水冲洗大孔树脂柱，替换其中的乙醇；之后将步骤(4)中得到的泽兰总提取物的水溶液上清液反复上样6次，目的是使大孔树脂D101充分吸附泽兰总提取物的水溶液上清液；
(6)使用100L水对大孔树脂D101进行洗脱，洗脱液在40℃ -60℃进行减压浓缩，得到泽兰提取物2；
(7)使用10L 25％(v/v)乙醇溶液溶解步骤(4)中的沉淀，使用高速离心机在25℃以每分钟5000转的速度离心5分钟，取上清液，留下沉淀，将上清液加入步骤(6)中已使用水洗脱过的大孔树脂 D101中继续吸附，接着使用100L 25％(v/v)乙醇溶液对大孔树脂 D101进行洗脱，洗脱液在40℃-60℃进行减压浓缩，得到泽兰提取物 3；
(8)使用10L 50％(v/v)乙醇溶液溶解步骤(7)中的沉淀，使用高速离心机在25℃以每分钟5000转的速度离心5分钟，取上清液，留下沉淀，将上清液加入步骤(7)中已使用25％(v/v)乙醇溶液洗脱过的大孔树脂D101中继续吸附，接着使用100L 50％(v/v) 乙醇溶液对大孔树脂D101进行洗脱，洗脱液在40℃-60℃进行减压浓缩，得到泽兰提取物4；
(9)使用10L 75％(v/v)乙醇溶液溶解步骤(8)中的沉淀，使用高速离心机在25℃以每分钟5000转的速度离心5分钟，取上清液，留下沉淀，将上清液加入步骤(8)中已使用50％(v/v)乙醇溶液洗脱过的大孔树脂D101中继续吸附，接着使用100L 75％(v/v) 乙醇溶液对大孔树脂D101进行洗脱，洗脱液在40℃-60℃进行减压浓缩，得到泽兰提取物5；
(10)使用10L 95％(v/v)乙醇溶液溶解步骤(9)中的沉淀，使用高速离心机在25℃以每分钟5000转的速度离心5分钟，取上清液，留下沉淀，将上清液加入步骤(9)中已使用75％(v/v)乙醇溶液洗脱过的大孔树脂D101中继续吸附，接着使用100L 95％(v/v) 乙醇溶液对大孔树脂D101进行洗脱，洗脱液在40℃-60℃进行减压浓缩，得到泽兰提取物6；
最终得到的泽兰提取物2占泽兰总提取物的比例为27.68％、泽兰提取物3的比例为14.76％、泽兰提取物4的比例为10.64％、泽兰提取物5的比例为3.49％、泽兰提取物6的比例为4.71％(说明：计算这个比例主要是为了确定下一步动物灌胃的剂量，为了让进一步大孔树脂分离得到的样品的灌胃剂量与总提取物相应成分灌胃的剂量相同)。
上述提取物2-6均为浸膏。
制备例7：泽兰提取物7的制备
1.原料、试剂和仪器
泽兰中药饮片，布氏漏斗，抽滤瓶。
2.泽兰提取物7制备步骤：
(1)将500g泽兰中药饮片使用10-12倍重量的水浸泡约12个小时，加热回流提取，回流2小时，提取1次；
(2)将步骤(1)得到的产物合并，纱布过滤，再用布氏漏斗抽滤，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液在40℃-60℃进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰提取物7。
制备例8-9：泽兰提取物8-9的制备
1.原料、试剂和仪器
泽兰中药饮片，60％(v/v)乙醇溶液，95％(v/v)乙醇溶液，大孔树脂D101(粒径：0.3-1.25mm，平均孔径：
Figure BDA0002992380220000141
)，大孔树脂柱(柱长×内径：120cm×9.5cm)，高速离心机(Beckman)。
2.泽兰提取物8-9制备步骤：
(1)将5kg泽兰中药饮片使用10-12倍重量的60％(v/v)乙醇溶液浸泡约12小时，加热回流提取，提取4次，每次回流1小时；
(2)将步骤(1)得到的产物合并，过滤，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液在40℃-60℃进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰提取物8。
(4)将步骤(3)得到的泽兰提取物8的2/3加4L水稀释，使用高速离心机在25℃以每分钟5000转的速度离心5分钟，取上清，得到泽兰提取物8的水溶液上清液，留下沉淀；
(5)使用大孔树脂D101进行分段分离，首先将3kg的大孔树脂 D101装入大孔树脂柱中，使用95％(v/v)乙醇溶液浸泡大孔树脂D101，浸泡约12小时，使其充分溶胀，接着用水冲洗大孔树脂柱，替换其中的乙醇；之后将步骤(4)中得到的泽兰提取物8的水溶液上清液反复上样4次，使大孔树脂D101充分吸附泽兰提取物8的水溶液上清液；
(6)使用14L水对大孔树脂D101进行洗脱，洗脱液在40℃-60℃进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰提取物9。
以上制得的提取物1、总提取物、提取物8实质上相同，均为60％乙醇溶液提取浓缩后得到的浸膏；
提取物9与提取物2实质上相同，均为大孔树脂水洗脱部分，浓缩后得到的浸膏。
制备例10：泽兰提取物10的制备
1.原料、试剂和仪器
泽兰中药饮片，20％(v/v)乙醇溶液。
2.泽兰提取物10制备步骤：
(1)将4kg泽兰中药饮片使用10-12倍重量的20％(v/v)乙醇溶液浸泡约12小时，加热回流提取，提取4次，每次回流1小时；
(2)将步骤(1)得到的产物合并，过滤，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液在40℃-60℃的温度下进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰提取物10。
制备例11：泽兰提取物11的制备
1.原料、试剂和仪器
泽兰中药饮片，40％(v/v)乙醇溶液。
2.泽兰提取物11制备步骤：
(1)将4kg泽兰中药饮片使用10-12倍重量的40％(v/v)乙醇溶液浸泡约12小时，加热回流提取，提取4次，每次回流1小时；
(2)将步骤(1)得到的产物合并，过滤，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液在40℃-60℃的温度下进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰提取物11。
制备例12：泽兰提取物12的制备
1.原料、试剂和仪器
泽兰中药饮片，80％(v/v)乙醇溶液。
2.泽兰提取物12制备步骤：
(1)将4kg泽兰中药饮片使用10-12倍重量的80％(v/v)乙醇溶液浸泡约12小时，加热回流提取，提取4次，每次回流1小时；
(2)将步骤(1)得到的产物合并，过滤，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液在40℃-60℃的温度下进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰提取物12。
制备例13：泽兰提取物13的制备
1.原料、试剂和仪器
泽兰中药饮片，95％(v/v)乙醇溶液。
2.泽兰提取物13制备步骤：
(1)将4kg泽兰中药饮片使用10-12倍重量的95％(v/v)乙醇溶液浸泡约12小时，加热回流提取，提取4次，每次回流1小时；
(2)将步骤(1)得到的产物合并，过滤，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液在40℃-60℃的温度下进行减压浓缩，得到浸膏，为泽兰提取物13。
实验例1：泽兰提取物1的骨质疏松指标检测
1)实验方法
1.1动物，材料，仪器与药物
SD清洁级大鼠，雌性，3月龄，购于厦门大学实验动物中心；三氯乙醛水合物购自上海生工；β-雌二醇购自Sigma-Aldlrich；Micro-CT 为德国Simense Inveon PET/CT；固体密度测量仪为德国OHAUS；电子分析天平为德国OHAUS。
泽兰提取物1由制备例1制得。
1.2去卵巢致大鼠骨质疏松模型(OVX)
雌性大鼠摘除卵巢后，骨代谢异常增强，松质骨丢失加快，骨强度下降明显，大鼠在骨量减少的部位和骨质疏松性骨折的发生上与人具有很大的相似性，是研究妇女绝经后骨质疏松的经典模型之一。具体操作方法如下：
雌性SD大鼠以30mg/kg水合氯醛溶液经腹腔注射麻醉，常规手术区域剪毛消毒，背中线纵向切开，行双侧卵巢摘除术。对照组做假手术，即手术中未切除卵巢，仅切除少量脂肪。卵巢或少量脂肪摘除后缝合切口。
1.3分组和给药
大鼠行摘除卵巢术后1个月，设定实验组为假手术对照组 (SHAM)、模型组(OVX)、阳性对照雌二醇组(E2)，每组6只。 E2组给药剂量为1mg/kg/d。另设泽兰提取物1给药组，给药剂量为125mg/kg/d和500mg/kg/d两组，每组3只大鼠。配药溶剂为0.5％羧甲基纤维素钠溶液，假手术对照组及模型对照组分别给予同等体积的 0.5％羧甲基纤维素钠溶液，本发明采用灌胃方式给药。实验过程中，观察大鼠的进食、饮水和活动情况，每周称重1次，并根据体重变化调整给药剂量。至第90天处死大鼠，检测骨质疏松相关指标。
2)检测指标
2.1 Micro-CT检测骨密度：取左侧股骨中段至下1/3处(远心端)，采用X射线计算机断层扫描成像，计算骨密度，单位为HU。
2.2子宫指数：大鼠称重，颈椎脱臼处死后，取出子宫，剥离子宫附近脂肪组织，称湿量，计算子宫指数(子宫湿重/体重)。
2.3骨组织形态计量学参数：取右侧股骨，按照常规固定，脱钙，切片，HE染色，采用正置显微镜进行拍照记录，多功能真彩色病理图像分析软件统计和分析股骨的病理学参数。各指标的涵义和计算公式如下表所示：
表1：骨组织微结构的参数和计算公式
参数 符号 单位 解释及公式
骨组织面积 T.Ar mm<sup>2</sup> 骨组织面积
骨小梁面积 Tb.Ar mm<sup>2</sup> 骨小梁面积
骨小梁周长 Tb.Pm mm 骨小梁周长长度
骨小梁厚度 Tb.Th mm (2000/1.199)/(Tb.Ar/Tb.Pm)
骨小梁面积比率 ％Tb.Ar ％ Tb.Ar/T.Ar×％
骨小梁数目 Tb.N #/mm (1.199/2)/(Tb.Pm/T.Ar)
骨小梁分离度 Tb.Sp mm (2000/1.199)x(T.Ar-Tb.Ar)/Tb.Pm
3)结果
3.1 Micro-CT扫描大鼠左侧股骨所得影像如图1A-图1H(图中比例尺为0.5mm)所示，检测的股骨骨密度列于表2。
与假手术对照组相比较，模型组的松质骨明显减少，骨密度显著降低(P<0.001)，表明切除卵巢引起的大鼠骨质疏松造模成功。与模型组比较，雌二醇组(E2)和泽兰提取物1给药组的松质骨数量均显著提高，且泽兰提取物1能够剂量依赖地增加大鼠骨密度(P<0.05)，表明泽兰提取物1能有效防止骨质疏松大鼠的左侧股骨的松质骨密度降低。
3.2子宫指数：结果如表2的子宫指数所示。
表2：泽兰提取物1对大鼠骨密度、子宫指数的影响
组别 浓度(mg/kg) 骨密度(HU) 子宫指数(g/kg)
SHAM对照组 / 1348.3±192.8 2.450±0.598
OVX模型组 / 764.7±144.8<sup>###</sup> 0.400±0.068<sup>###</sup>
E2 1 879.1±90.6<sup>*</sup> 1.122±0.074<sup>***</sup>
泽兰提取物1 125 839±152.1<sup>*</sup> 0.350±0.079
泽兰提取物1 500 853.4±76.8<sup>*</sup> 0.415±0.078
注：###P＜0.001为模型组与假手术对照组比较；*P＜0.05和***P ＜0.001为给药组与模型组对比。
由表2中数据可知，模型对照组的子宫指数降低非常显著 (P<0.001)，子宫内皮增生明显减少，表明切除卵巢引起的大鼠骨质疏松模型造模成功。与OVX组比较，雌二醇组(E2)显著提高子宫指数(P<0.001)，发挥雌激素样作用，会刺激子宫内皮增生。而泽兰提取物1(125mg/kg/d，500mg/kg/d)对大鼠子宫重量的影响无显著差异，表明泽兰提取物1不存在直接的雌激素样作用。与雌二醇相比，泽兰提取物1不容易发生子宫内膜增生、出血等不良反应，因此减少了子宫内膜癌、乳腺癌发生的风险。
3.3骨组织形态计量学检测：大鼠右侧股骨石蜡切片如图2A-2D (图中比例尺为200μm)所示，数据分析结果如表3所示。
表3：泽兰提取物1对大鼠股骨骨组织微结构的影响
Figure BDA0002992380220000181
Figure BDA0002992380220000191
注：###P＜0.001为模型组与假手术对照组比较；*P＜0.05和***P ＜0.001为给药组与模型组对比。
结果显示，模型组与假手术对照组比较，模型组的骨小梁面积、骨小梁厚度和数目均显著减少且骨小梁分离度显著增加，显示造模成功。给药组与模型组比较，雌二醇(E2)和泽兰提取物1均能显著提高骨小梁面积、骨小梁厚度、骨小梁数目，降低骨小梁分离度(P＜0.001)，说明泽兰提取物1能有效增加骨的形成，减少骨的吸收，防止骨量的丢失，从而为预防或治疗骨质疏松提供有效途径。
实验例2：泽兰提取物1-6对切除卵巢致骨质疏松大鼠的影响
1)试验方法
1.1动物，材料，仪器，造模
SD清洁级大鼠，雌性，3月龄，购于厦门大学实验动物中心，三氯乙醛水合物购自上海生工，Micro-CT为德国Siemense Inveon PET/CT，大鼠按实验例1中所述的方法行卵巢摘除术。
泽兰提取物1-6分别由制备例1-6制得。
1.2分组和给药
大鼠术后1个月分为假手术对照组(SHAM)，模型组(OVX)，以及给药组。给药组有6组，分别为泽兰提取物1-6，并按表4的提取比例分别给予相应的剂量灌胃给药(泽兰提取物1为500mg/kg/d，泽兰提取物2为276.8mg/kg/d，泽兰提取物3为147.6mg/kg/d，泽兰提取物4为106.4mg/kg/d，泽兰提取物5为34.9mg/kg/d，泽兰提取物6为47.1mg/kg/d)，假手术组和模型组分别给予同等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液。大鼠每周称重1次，并根据体重变化调整给药剂量。灌胃90天后处死大鼠，取左侧股骨，使用Micro-CT扫描成像，计算骨密度。
2)结果
如表4所示。
表4：泽兰提取物1-6对大鼠骨密度的影响
组别 提取比率(％) 骨密度(HU)
SHAM对照组 / 1391.8±173.8
OVX模型组 / 831.1±42.4<sup>###</sup>
泽兰提取物1 / 979.0±116.9<sup>**</sup>
泽兰提取物2 27.68 1159.1±46.3<sup>***</sup>
泽兰提取物3 14.76 860.1±39.3
泽兰提取物4 10.64 911.1±42.1
泽兰提取物5 3.49 903.8±40.7
泽兰提取物6 4.71 897.1±87.7
注：###P＜0.001为模型组与假手术对照组比较；**P＜0.01和***P ＜0.001为给药组与模型组对比。假手术对照组和模型组大鼠为6只，各给药组大鼠为3只。
Micro-CT检测骨密度值：由表4可知，与假手术对照组比较，模型组骨密度显著降低(P<0.001)，表明切除卵巢引起的大鼠骨质疏松模型造模成功。相较于模型组，泽兰提取物1和泽兰提取物2均能够大幅提高大鼠骨密度(P<0.001)，而泽兰提取物3-6组则无显著性差异。
3)结论
泽兰60％乙醇提取物(泽兰提取物1)及其水洗脱组分(泽兰提取物2)均能明显提高大鼠骨密度，且泽兰水洗脱组分的效果更为显著，说明了泽兰提取物防治骨质疏松的主要有效成分为极性较大的提取组分。
实验例3：泽兰提取物7和泽兰提取物8对切除卵巢骨质疏松大鼠的影响
1)试验方法
1.1动物，材料，仪器，造模
SD清洁级大鼠，雌性，3月龄，购于厦门大学实验动物中心，三氯乙醛水合物购自上海生工，Micro-CT为德国Siemense Inveon PET/CT，大鼠按实验例1中所述的方法行卵巢摘除术。
泽兰提取物7-8分别由制备例7-8制得。
1.2分组和给药
术后1个月大鼠分为假手术对照组(SHAM)，模型组(OVX)，以及给药组(500mg/kg/d泽兰提取物7和500mg/kg/d泽兰提取物8), 每组6只。假手术组和模型组分别给予同等剂量的0.5％羧甲基纤维素钠溶液。至90天处死大鼠，取左侧股骨，使用Micro-CT扫描成像，计算骨密度。
2)结果
如表5所示。
表5：泽兰提取物7和泽兰提取物8对大鼠骨密度的影响
组别 骨密度(HU)
SHAM对照组 1501.8±229.8
OVX模型组 765.4±28.2<sup>###</sup>
泽兰提取物7 762.9±63.1
泽兰提取物8 954.6±124.4<sup>**</sup>
注：###P＜0.001为模型组与假手术对照组比较；**P＜0.01为给药组与模型组对比。
由表5可知，泽兰提取物8可以显著提高大鼠股骨骨密度，而泽兰提取物7对大鼠股骨骨密度没有影响。这说明了泽兰中抗骨质疏松的有效成分 主要为采用乙醇溶液所得的提取物，说明了泽兰的乙醇提取物而非水提取物具有显著的治疗和/或预防骨质疏松的作用。
实验例4：不同剂量的泽兰提取物9对切除卵巢骨质疏松大鼠的影响
1)试验方法
1.1动物，材料，仪器，造模
SD清洁级大鼠，雌性，3月龄，购于厦门大学实验动物中心，三氯乙醛水合物购自上海生工，Micro-CT为德国Siemense Inveon PET/CT，大鼠按实验例1中所述的方法行卵巢摘除术。
泽兰提取物9由制备例9制得。
1.2分组和给药
术后1个月大鼠分为假手术对照组(SHAM)，模型组(OVX)，以及给药组(按剂量分为低剂量组、中剂量组、高剂量组)，每组6 只。给药组按69.2mg/kg/d、138.4mg/kg/d和276.8mg/kg/d三个剂量灌胃给药，假手术组和模型组分别给予同等剂量的0.5％羧甲基纤维素钠溶液。至90天处死大鼠，取左侧股骨，使用Micro-CT扫描成像，计算骨密度。
2)结果
如表6所示。
表6：泽兰提取物9对大鼠股骨骨密度的影响
组别 浓度(mg/kg/d) 骨密度(HU)
SHAM对照组 / 1501.8±229.8
OVX模型组 / 765.4±28.2<sup>###</sup>
低剂量组 69.2 768.8±47.7
中剂量组 138.4 839.9±16.6<sup>*</sup>
高剂量组 276.8 1012.4±90.8<sup>***</sup>
注：###P＜0.001为模型组与假手术对照组比较；*P＜0.05和***P ＜0.001为给药组与模型组对比，N＝6。
由表6可知，中剂量和高剂量泽兰提取物9可以显著提升大鼠骨密度，说明泽兰提取物9能有效增加骨的形成，防止骨量的丢失，从而提供一种预防或治疗骨质疏松的有效手段。
实验例5：泽兰提取物10-13以及泽兰提取物1的抗骨质疏松的活性的检测
1.实验动物、试剂和仪器
如下面的表7所示。
表7
Figure BDA0002992380220000231
2.实验方法
2.1.破骨细胞分化模型构建
破骨细胞的过度激活是骨质疏松症发病的主要机制之一，目前临床上使用的药物绝大多数为破骨细胞抑制剂，所以破骨细胞的抑制剂具有潜在的预防或治疗骨质疏松症的效果。在机体中，破骨细胞来源于血系单核-巨噬细胞，骨髓中含有大量单核-巨噬细胞前体细胞。体外分离的单核-巨噬细胞前体细胞在M-CSF的诱导下可形成单核-巨噬细胞，再在M-CSF和RANKL的共同诱导下可以分化成破骨细胞。在体外建立此破骨细胞分化模型可用于骨质疏松症体外药物的筛选和作用评价。
2.2.小鼠单核-巨噬细胞前体细胞的提取
选取6-8周龄的C57BL/6J小鼠，通过断颈法处死小鼠，并将其浸入75％乙醇中5分钟进行消毒灭菌，在生物安全柜中，无菌操作分离小鼠的股骨和胫骨。配置含10％FBS和1％青霉素混合液的α-MEM培养基，无菌注射器中吸满培养基，使用注射器将整个骨髓细胞从股骨和胫骨上冲出，并以5×104/cm2的密度接种在10cm的培养皿中，加入M-CSF (50ng/mL)培养过夜，然后收集上层的悬浮细胞。
2.3.破骨细胞的分化
收集的骨髓细胞继续在M-CSF(50ng/mL)的处理下培养3天，可成为小鼠单核-巨噬细胞，小鼠单核巨噬细胞为具有多分化潜能的破骨前体细胞。将上述单核-巨噬细胞以5×104/cm2的密度种植在96孔细胞培养板中，同时处理M-CSF(50ng/mL)和RANKL(50ng/mL)7天，诱导分化成破骨细胞。
2.4.提取物处理
细胞在处理M-CSF和RNAKL的同时，处理泽兰不同浓度乙醇的提取物(25μg/mL)，细胞培养7天后，镜下观察。
2.4.指标检测
相对于单核-巨噬细胞，破骨细胞具有更大体积和明显的细胞质结构，此外，一个成熟的破骨细胞通常会具有3-100个细胞核，属于多核融合细胞。同时，破骨细胞会表达大量抗酒石酸酸性磷酸酶，会被TRAP 染色试剂盒染成红色。将细胞培养板在室温下用4％多聚甲醛固定10 分钟，然后在37摄氏度下用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒染色1小时，使用倒置显微镜拍照，观察并计数多核融合破骨细胞。采用Graph Prism 8.0软件分析数据，使用t检验分析差异性，***为P<0.001，代表模型组和提取物处理组间的显著性差异。
3.实验结果
如图3A-3H所示，提取的单核细胞(图3A，空白对照组)体积较小且不能被TRAP染色试剂盒染成红色。经M-CSF和RANKL处理后的细胞中(图3B，模型组)，出现大量多核融合的破骨细胞，细胞体积显著增大，具有明显的细胞质结构(如框内所示)，且可以被TRAP 染色试剂盒染成红色。这表明破骨细胞分化模型构建成功。细胞在 M-CSF和RANKL诱导分化的同时，处理不同浓度乙醇提取的泽兰提取物(25μg/mL)，破骨细胞的数量显著减少(图3C-3G)。如3H所示，泽兰20％乙醇提取物(泽兰提取物10)、40％乙醇提取物(泽兰提取物11)、60％乙醇提取物(泽兰提取物1)、80％乙醇提取物(泽兰提取物12)、95％乙醇提取物(泽兰提取物13)可以显著减少96孔板中的破骨细胞数目(***)。因此，泽兰20％乙醇提取物、40％乙醇提取物、60％乙醇提取物、80％乙醇提取物、95％乙醇提取物均具有抑制破骨细胞形成的作用，具有潜在的抗骨质疏松作用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (23)

1.泽兰乙醇提取物在制备治疗或预防骨质疏松症的药物中的用途；
其中，所述泽兰乙醇提取物的制备方法包括下述步骤：
(1)使用25％-95％的乙醇溶液对泽兰进行浸泡、提取，得到提取液；
(2)将提取液进行浓缩，得到第一浓缩物；
(3)将步骤(1)的提取液或者将步骤(2)的第一浓缩物用水稀释后离心，取上清液，上样大孔树脂柱；
(4)使用水进行洗脱，得到洗脱液；
(5)将洗脱液进行浓缩，得到第二浓缩物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述大孔树脂柱为大孔树脂D101、D101-Ⅰ、DA201、DM301、HPD100或DM130。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)满足如下I.-VII.中的任意1种、任意2种、任意3种、任意4种、任意5种、任意6种或者全部7种：
I.乙醇溶液的浓度为45％-75％；
II.乙醇溶液的用量为泽兰的5-20倍量；
III.泽兰为粉碎的或未经粉碎的泽兰；
IV.浸泡的时间为至少1小时；
V.所述提取为回流提取；
VI.提取次数为1次或多次；和
VII.每次提取的时间为至少0.2小时。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，乙醇溶液的浓度为50％-70％。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，乙醇溶液的浓度为55％-65％。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，乙醇溶液的浓度为60％。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，乙醇溶液的用量为泽兰的8-15倍量。
8.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，乙醇溶液的用量为泽兰的10-12倍量。
9.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中浸泡的时间为至少5小时。
10.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，浸泡的时间为至少10小时。
11.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，提取次数为1-4次。
12.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，合并每次提取得到的提取液。
13.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，每次提取的时间为至少0.5小时。
14.根据权利要求1所述的用途，其中，步骤(1)中，每次提取的时间为至少1小时。
15.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症或继发性骨质疏松症。
16.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症或老年性骨质疏松症。
17.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，所述治疗或预防骨质疏松症的药物不引起雌激素样作用。
18.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，泽兰乙醇提取物的给药剂量为每千克体重每天50mg-1000mg。
19.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，泽兰乙醇提取物的给药剂量为每千克体重每天50mg-500mg。
20.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，泽兰乙醇提取物的给药剂量为每千克体重每天150mg-300mg。
21.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，泽兰乙醇提取物的给药剂量为每千克体重每天150mg-250mg。
22.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，泽兰乙醇提取物的给药剂量为每千克体重每天200mg。
23.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的用途，其中，泽兰乙醇提取物的给药剂量为每千克体重每天250mg。
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CN1562153A (zh) * 2004-04-01 2005-01-12 上海交通大学 具有耐缺氧作用的泽兰提取物的制备方法
CN101120936A (zh) * 2006-08-11 2008-02-13 四川九章生物化工科技发展有限公司 绿原酸在制备具有雌激素样或促雌激素样作用药物中的应用
KR101582907B1 (ko) * 2010-10-27 2016-01-08 주식회사 성균바이오텍 등골나물속 추출물을 유효성분으로 하는 비만 또는 골대사질환 예방 또는 치료용 조성물
CN102133263B (zh) * 2011-03-08 2012-05-02 河南中医学院 一种泽兰提取物的制备方法及其提取物的应用
CN103495011B (zh) * 2013-09-24 2014-09-03 宁波保税区欣诺生物技术有限公司 一种治疗骨质疏松的中药片剂的制备方法
CN103622949B (zh) * 2013-12-06 2015-06-24 南京中医药大学 一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物
CN104001004A (zh) * 2014-06-16 2014-08-27 徐艳 一种治疗骨折和骨质疏松的中药组合物及其制备方法和应用
CN104840748B (zh) * 2015-05-18 2018-05-01 南京中医药大学 具有抗脑癌活性的中药组合物及其制备方法和应用
CN109953912A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 郑永刚 一种具有祛斑美白效果的天然提取物化妆品
CN109232491A (zh) * 2018-10-15 2019-01-18 浙江大学 一种华泽兰中苯并呋喃类化合物的制备方法及用途

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