KR20100125785A

KR20100125785A - 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 자궁근종 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR20100125785A
Application number: KR1020090044651A
Authority: KR
Inventors: 최인호; 심상희; 이동목; 이은주; 프라티바즈라촤리여
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2009-05-21
Filing date: 2009-05-21
Publication date: 2010-12-01
Also published as: WO2010134767A3; KR101103481B1; WO2010134767A2

Abstract

본 발명은 속단, 현호색, 오령지, 봉출, 육계 및 반지련으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 자궁근종 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 이러한 한약재 추출물은 부작용이 적으면서도 근종조직과 근종세포의 성장을 억제함으로써 안전한 자궁근종 치료제로 사용가능하다.

속단, 현호색, 오령지, 봉출, 육계, 반지련, 한약재, 추출물, 자궁근종

Description

한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 자궁근종 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for treating uterine leiomyoma comprising herb extract}

본 발명은 속단, 현호색, 오령지, 봉출, 육계 및 반지련으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 자궁근종 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

자궁 근종이란 자궁의 근층을 이루고 있는 '평활근'에서 기원한 양성 종양을 말한다. 이 질환은 매우 흔한 질환으로 엄밀하게 자궁 근종이 전혀 없는 여성은 오히려 드물다고 할 정도로 많은 병이다.

이 근종은 크기가 너무 크지 않고 특별한 증상을 일으키지 않는 한 반드시 치료의 대상이 되진 않는다. 그러나 정확한 진단이 필요하고 악성 육종과의 감별, 빈뇨, 잔뇨감, 요통, 생리과다, 빈혈, 기능성 자궁출혈, 반복 유산, 불임 등의 이유로 인해 대부분 크기가 크면 치료한다. 임신을 원하는 환자의 경우는 자궁을 보존할 수 있는 방향으로 치료를 하고, 그렇지 않고 자궁 절제를 원하는 경우 자궁 절제술을 시행한다. 약물적 치료도 있으나 완치는 역시 수술적 방법을 통해야 이 루어진다고 할 수 있다.

근종의 성장은 에스트로겐(estrogen)에 의존하는 것으로 생각되고 있으며 그 이유로는 난소의 기능이 왕성할 때 근종이 잘 자라고 초경 이전이나 폐경기 이후에는 발생이 드물며, 특히 폐경기 이후에는 근종의 크기가 감소하는 점 등을 들 수 있다.

35세 이상의 여성 중 약 20%가 가지고 있으며 인종상으로는 흑인이 백인보다 많으며 유색인종에서 빈발하는 경향이 있다. 폐경 이후 대개 크기가 줄어들면 새로운 근종의 발생은 드문 편이다. 30-40세에 호발하지만 종양이 지속되면 폐경기 후에도 발견된다. 그러나 폐경기 후에 그 크기가 증가하면 근종의 2차성 변성 특히 육종성 변화나, 폐경기 후 난소 또는 그 이외의 장기에서 여성호르몬의 분비과다를 의심해야 한다.

이 종양은 가장 흔히 체부에 발생하지만 드물게는 경관, 자궁인대 또는 자궁경부(5% 미만)에도 생긴다. 대개 병변은 다발성이고 고립성이며 크기는 현미경적 크기에서부터 매우 큰 거대종양에 이르기까지 다양하다. 유형에 따른 빈도를 살펴보면 근층 내 근종(80%), 장막하 근종(15%), 점막하 근종(5%)의 순서로 빈발한다.

하지만 높은 발생빈도에도 불구하고 근종에 대한 명확한 원인이나 치료방법에 대한 이해 및 연구는 부족한 실정이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 한약재 추출물을 처리한 후 세포의 변화 및 조직의 변화를 관찰함으로써 근종 치료제로 유용하게 사용할 수 있는 한약재 추출물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자궁 근종 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 한약재 추출물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 소화된 자궁 근종 조직을 자궁 근종 세포 배양시 함께 사용함으로써 감소된 배양배지 양으로 세포배양이 가능하도록 한 세포배양 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 속단, 현호색, 오령지, 봉출, 육계 및 반지련으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 자궁근종 치료용 약학조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 한약재 추출물은 속단, 현호색, 오령지 및 봉출로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 한약재 추출물일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 한약재 추출물은 물, 에틸아세테이트, 클로로포름, 헥산, C1-C4 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 한약재 추출물은 봉출의 클로로포름 추출물일 수 있다.

상기 봉출의 클로로포름 추출물은 (i) 봉출을 메탄올로 추출하는 단계; (ii) 봉출 메탄올 추출물에 메탄올성 물을 가하여 현탁시킨 후, 헥산을 첨가하는 단계; 및 (iii) 얻어진 물 층에 클로로포름을 가하여 클로로포름 층을 분리하고 감압 농축하는 단계를 거쳐 얻어질 수 있다.

또한, 본 발명의 자궁근종 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 한약재 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 한약재 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 한약재 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 한약재 추출물을 인체에 투여하는 경우, 천연 추출물 인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 없으며, 본 발명의 한약재 추출물을 랫트에 경구투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)이 적어도 2g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판명되어 그 안정성이 확보되어 있다.

또한, 본 발명은 개체로부터 근종 조직을 제거하여 생리식염수에 담구는 단계; 세정 후, 자른 조직을 콜라게네이즈에 넣고 배양하여 세포를 분리하는 단계; 원심분리하여 상층액을 제거하고 뭉쳐있는 조직들을 잘 떨어지게 하는 단계; 및 조직을 배양접시에 배양한 후, 소화된 조직으로부터 세포가 나와 배양접시를 가득 채우면 계대배양하는 단계를 포함하여 이루어지는, 소화된 조직을 세포 배양 시 함께 사용하여 감소된 배양배지 양으로 세포배양이 가능하도록 한 세포배양 방법을 제공한다.

본 발명은 다른 세포배양 방법과 달리, 근종 세포 배양 시 소화(digestion)된 근종 조직을 함께 배양함으로써 기존 세포배양 방법에서 사용한 배양배지 양의 약 반 정도만 세포배양에 사용하여 소화된 조직에서 세포가 유출되도록 유도하는 데에 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 한약재 추출물 및 이들의 분획들은 자궁 근종의 성장을 억제함으로써 자궁 근종 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 하기 실시 예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러 한 실시 예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 한약재 추출물 제조

1. 한약재 추출물 제조

155-200 g의 약재를 이용하여 증류수와 약 3시간 정도 가열한 후 가열하여 얻은 액을 1 mm 크기의 필터에 여과한 후 감압농축을 통하여 동결 건조하여 분말을 얻었다. 이렇게 얻어진 한약재 추출물은 0.1 g/ml 농도로 준비하였으며, 한약재 추출물은 멸균된 3차 증류수에 녹인 후 40 ㎛ strainer에 한 번 거른 후 0.2 ㎛ 필터에 걸러 사용 전까지 -20℃에 냉동 보관하였다.

2. 한약재 추출물의 각 분획 제조

음건하여 세절한 한약재 1 kg을 믹서기를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄한 시료에 메탄올(MeOH) 4 리터를 가하여 3시간 동안 환류 냉각 열탕추출 하였으며 이를 3회 반복하였다. 이러한 추출물을 면솜을 이용하여 여과하고, 여과된 추출액을 모아 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다.

상기 메탄올 추출물에 5% 메탄올성 물 1 리터를 현탁시킨 후 이 현탁액을 분획깔때기에 붓고 바로 이어 헥산(Hexane) 1 리터를 부어 수회 흔들어 진탕 혼합한 후 두 용매 사이의 평형이 일어나도록 실온에서 4시간 동안 방치하였다. 헥산층과 물 층(5% 메탄올 성 물 soluble)이 분배되면 헥산 층은 분리하여 감압 농축하여 헥산 분획을 얻었다.

분획깔때기에 남아 있는 물 층에 클로로포름(CHCl₃) 1 리터를 가한 후, 위와 같은 방법으로 진탕 혼합한 후 4시간 동안 실온에서 방치하였다. 클로로포름 층을 분리하여 감압 농축하여 클로로포름 분획 6.9 g을 얻었다. 그 후 남아 있는 물 층에 같은 방법으로 에틸아세테이트(Ethyl Acetate) 1 리터를 가하여 에틸아세테이트 분획을 얻었다.

이렇게 얻어진 한약재 추출물 분획은 0.2 g/ml 농도로 준비하였으며, 각 분획은 DMSO에 녹인 후 4 ℃에 냉장 보관하였다.

<실시예 2> 세포 배양

당일 수술 후 제거된 근종 조직을 생리식염수에 담구어 운반하였다. 조직을 다시 한번 생리식염수에 담구어 세정과정을 거치고 조직을 약 3-5m의 크기로 자른 후 조직을 제1형 콜라게네이즈/KRB[type I collagenase/ KRB(Krebs-Ringer bicarbonate buffer)]에 넣어 약 30-40 분 정도 37 ℃에서 배양하였다. 이때, 배양시간 및 Krebs-Ringer bicarbonate buffer의 양은 샘플의 상태 및 양에 따라 조금씩 변형해야 한다.

세포분리과정(digestion)이 끝나면 2500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 배양배지(DMEM/10% fetal bovine serum/1% penicillin-steptomycin)에 넣어 준 후 섞어 뭉쳐있는 조직들이 잘 떨어질 수 있도록 하였고, 조직들을 세포배양 접시에 놓은 후 그곳에 배양배지를 넣었다.

조직이 배양접시에 붙을 때까지 그대로 배양한 후 소화된 조직에서 세포들이 나오는 것을 관찰하였다. 세포가 세포배양 접시에 가득 차게 되면 계대 배양을 진행하였고, 계대 배양은 트립신 EDTA를 이용하였다. 세포를 배양 접시에 분주하기 전 세포 수 측정을 통하여 동일한 세포를 6 well 배양 접시에 분주하였다.

<실시예 3> 한약재 추출물의 세포 형태 변화 및 세포 증식 검토

상기 준비된 세포가 약 70% 정도 성장해 있는 세포에, 앞서 준비된 현호색, 속단, 오령지, 봉출, 육계, 반지련 추출물을 2 ml 배지에 20 ㎕를 처리(한약재 추출물 농도: 1 mg/ml)한 후 7일 동안 배양하였다.

처리 시 한약재 추출물을 처리하지 않은 세포를 실험군(control)으로 두고 한약재 추출물을 처리한 세포를 처리군(treatment)으로 두고 실험을 진행하였다. 배양 동안 2일에 한번 씩 배지를 교체하고 교체 시 한약재 추출물을 동일한 농도로 첨가 해 주었다.

한약재 추출물 처리 후, 세포의 형태적 변화를 관찰하기 위해 매일 현미경으로 관찰하였고 실험군과 비교해 처리군의 변화를 관찰하였다. 또한, 세포의 증식 정도를 관찰하기 위해 7일(한약재 추출물 처리) 처리한 세포에 트립신 EDTA를 첨가하여, 세포를 부유 (500 ㎕ trypsin EDTA + DMEM 배지= 1 ml 배지에 부유) 시킨 후 세포 수 측정기(Hemocytometer)를 이용하여 세포를 측정하였다.

그 결과, 도 2와 같이 한약재 추출물 처리군에서 특별히 세포들이 퍼지거나 형태적 변화는 관찰하기 힘들었으나 실험군에 비해 세포의 수들이 감소했음을 사진을 통해 확인할 수 있었으며, 특히 오령지 처리 시 눈에 띄게 세포들이 떨어지면서 죽어가는 모습을 관찰할 수 있었다.

또한, 한약재 추출물을 처리하지 않은 실험군을 100으로 둔 후 한약재 추출물을 처리한 처리군의 세포의 증식을 검토한 결과, 도 3과 같이 실험군에 비해 6개 의 한약재 추출물 모두 근종과 정상세포의 증식 억제에 영향을 보였으며, 속단, 봉출의 경우 근종세포와 정상 세포 간 증식 억제에서도 근종세포에서 좀 더 효율적임을 확인할 수 있었으며, 봉출의 경우 가장 큰 차이를 보였다.

<실시예 4> 한약재 추출물 분획의 세포 증식 검토

상기 준비된 세포가 약 70% 정도 성장해 있는 세포에, 앞서 준비된 현호색, 속단, 오령지, 봉출, 육계, 반지련 추출물 분획들을 2 ml 배지에 2 ㎕를 처리(한약재 추출물 농도: 0.2 mg/ml)한 후 24시간, 48시간 동안 배양하였다.

처리 시 한약재 추출물 분획을 처리하지 않은 세포를 실험군(control)으로 두고 한약재 추출물 분획을 처리한 세포를 처리군(treatment)으로 두고 실험을 진행하였다. 배양 동안 2일에 한번 씩 배지를 교체하고 교체 시 한약재 추출물 분획을 동일한 농도로 첨가 해 주었다.

한약재 추출물 분획 처리 후, 세포의 형태적 변화를 관찰하기 위해 매일 현미경으로 관찰하였고 실험군과 비교해 처리군의 변화를 관찰하였다. 또한, 세포의 증식 정도를 관찰하기 위해 24시간, 48시간(한약재 추출물 분획 처리) 처리한 세포에 트립신 EDTA를 첨가하여, 세포를 부유 (500 ㎕ trypsin EDTA + DMEM 배지= 1 ml 배지에 부유) 시킨 후 세포 수 측정기(Hemocytometer)를 이용하여 세포를 측정하였다.

도 4와 같이, 한약재 추출물 분획의 경우 근종세포에서는 실험군에 비해 현호색-클로로포름, 속단-클로로포름, 봉출-클로로포름, 봉출-헥산, 육계 에틸아세테이트, 육계-헥산, 반지련-클로로포름이 효과를 보였으며, 정상 근층의 경우 현호색 -클로로포름, 속단-에틸아세테이트, 오령지-헥산, 육계-에틸아세테이트, 육계-헥산, 반지련-클로로포름이 실험군에 비해 효과를 보였다. 특히, 봉출-클로로포름 경우 정상 근층세포에서는 실험군에 비해 유의성을 나타내지 않았으나 근종세포의 경우는 실험군에 유의성을 보여 근종세포에 좀 더 효과적임을 알 수 있었다.

<실시예 5> 한약재 추출물 분획 처리에 따른 TGF-β 단백질 발현 검토

한약재 추출물 분획 처리에 따른 근종 조직의 변화를 관찰하기 위해 근종조직에서 높게 발현되는 대표적인 단백질 TGF-β 항체를 이용하여 한약재 추출물을 24시간 처리한 근종 조직에서 발현 정도를 관찰하였다.

즉, 앞서 준비된 세포와 같이 배양된 조직에, 앞서 준비된 한약재 추출물 분획을 24 시간 동안 처리한 후 조직을 분리하였다. 분리된 조직을 고정시킨 후 파라핀 블록으로 만들어 얇게 자른 후 슬라이드 글라스에 붙였다. 여기에 TGF-β 1차 항체를 첨가하고 2차 항체를 첨가하여 한약재 추출물 분획 처리에 따른 TGF-β의 발현 정도를 관찰하였다.

그 결과, 도 5와 같이 한약재 추출물 분획을 처리하지 않은 조직에서는 TGF-β의 높은 발현을 관찰할 수 있었으며, 각각의 한약재 추출물 분획 처리 후 TGF-β의 발현이 상당히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이때, 도 5에서 갈색은 TGF-β 단백질 발현정도를 나타낸 것이다.

<실시예 6> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 실시예 1에 따라 조제된 한약재 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 0.5g/㎏, 1g/㎏ 및 2g/㎏의 용량으로 1회 단회 경구투여하였다.

상기 추출물의 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 한약재 추출물을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과, 본 발명의 한약재 추출물은 랫트에서 2g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으므로, 안전한 물질로 판단되었다.

이하, 본 발명의 봉출 추출물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

실시예 1에서 제조한 봉출 추출물 300 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

실시예 1에서 제조한 봉출 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 실시예 1에서 제조한 봉출 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 실시 예 1에서 제조한 봉출 추출물 50 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 함유하여 제조하였다.

<제제예 5> 액제의 제조

통상의 액제의 제조방법에 따라 적량의 정제수에 실시예 1에서 제조한 봉출 추출물 100 mg, 이성화당 10 g 및 만니톨 5 g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

도 1은 본 발명에 따른 한약재 추출물로부터 분획을 제조하는 공정을 도식화한 모식도이고,

도 2는 본 발명에 따른 한약재 추출물 처리에 따른 세포 형태 변화를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명에 따른 한약재 추출물 처리에 따른 세포 증식 변화를 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명에 따른 한약재 추출물 분획 처리에 따른 세포 증식 변화를 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명에 따른 한약재 추출물 분획 처리에 따른 TGF-β 단백질 발현 정도를 나타낸 것이다.

Claims

속단, 현호색, 오령지, 봉출, 육계 및 반지련으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 자궁근종 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 한약재 추출물은 속단, 현호색, 오령지 및 봉출로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 한약재 추출물인 것을 특징으로 하는 자궁근종 치료용 약학조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 한약재 추출물은 물, 에틸아세테이트, 클로로포름, 헥산, C1-C4 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 자궁근종 치료용 약학조성물.
제 3항에 있어서, 상기 한약재 추출물은 봉출의 클로로포름 추출물인 것을 특징으로 하는 자궁근종 치료용 약학조성물.
제 4항에 있어서, 상기 봉출의 클로로포름 추출물은 (i) 봉출을 메탄올로 추출하는 단계; (ii) 봉출 메탄올 추출물에 메탄올성 물을 가하여 현탁시킨 후, 헥산을 첨가하는 단계; 및 (iii) 얻어진 물 층에 클로로포름을 가하여 클로로포름 층을 분리하고 감압 농축하는 단계를 거쳐 얻어지는 것을 특징으로 하는 자궁근종 치료용 약학조성물.
개체로부터 근종 조직을 제거하여 생리식염수에 담구는 단계;

세정 후, 자른 조직을 콜라게네이즈에 넣고 배양하여 세포를 분리하는 단계;

원심분리하여 상층액을 제거하고 뭉쳐있는 조직들을 잘 떨어지게 하는 단계; 및

조직을 배양접시에 배양한 후, 소화된 조직으로부터 세포가 나와 배양접시를 가득 채우면 계대배양하는 단계

를 포함하여 이루어지는, 소화된 조직을 세포 배양 시 함께 사용하여 감소된 배양배지 양으로 세포배양이 가능하도록 한 세포배양 방법.