CN103622949B - 一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物，其中补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的重量比为0.5-1：1。本发明的药物组合物既可以可促进成骨细胞的增殖和分化成熟，又可以抑制破骨细胞的活性，发挥促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用，从而起到治疗骨质疏松症，并公开了含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。

Description

一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物

技术领域

本发明是提供本发明涉及一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物，及其在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。

背景技术

骨质疏松症OP是以骨量减少、骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病，是骨代谢失衡的结果。骨质疏松是一种年龄相关性疾病，人口老龄化程度越高，患病人数越多。OP可分为原发性和继发性两种，其中原发性OP占OP的90％，又可分为2种亚型，即I型和II型，I型又称绝经后OP，II型为老年性OP。继发性OP可继发于其他疾病或由药物引起。I型OP一般发生在女性绝经两年左右，即开始于46～48岁前后；II型OP一般发生于60岁前后。我国目前是世界人口大国，亦是老年人口绝对数量最多的国家。2000年，60岁以上的老人1.32亿；2010年，60岁以上的老人1.73亿；预计2020年将增加至2.45亿，2030年增加至3.55亿，2040年增加至4.1亿，2050年增加至4.38亿。50岁以上的人口2010年、2020年和2050年将分别达到3.32亿、4.69亿和5.71亿。随着年龄的增加骨量丢失程度增大，加剧了骨质疏松的程度和患病率，严重骨质疏松导致的骨折率也不断上升。骨质疏松的严重后果是骨折，其中髋部骨折的后果最严重，髋部骨折的住院病人治疗天数平均22～24天，住院费用为2.12万元，时间和费用远高于乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和心脏病搭桥等病症，据国家卫生部门的统计资料，2006年用于髋部骨折的治疗费在63.5亿以上，2020年预计将在850亿以上，到2050年更将达到18000亿元。骨质疏松后骨折恢复速度慢，使人的生活质量明显降低，给社会带来沉重的经济负担。因此积极开展骨质疏松症的防治有着重大的社会意义和经济意义。

骨质疏松的发生过程是一个复杂的生理反应过程，该过程包括破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成。骨质疏松最主要的表现就是骨吸收快于骨形成，导致骨代谢失衡、骨量丢失、骨密度下降、骨折率升高。因此骨骼健康与否也是成骨细胞和破骨细胞相互作用的结果。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨细胞是骨细胞的一种，行使骨吸收的功能。骨质疏松的发生主要是成骨细胞的骨形成少于破骨细胞的骨吸收而导致的，因此在骨质疏松的防治和药物开发中对成骨细胞生理功能的影响评价及分子机制的研究就显得极为重要。

目前，临床主要采用骨吸收抑制药和骨合成及促进矿化药。第一类药物是以抑制破骨细胞过量的骨吸收，从而抑制绝经后骨质疏松症和其它的骨代谢障碍所导致的高骨转换率为理论基础的用药，主要包括：雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双磷酸盐、降钙素、依普黄酮、骨保护素等。第二类药物是以刺激成骨细胞骨形成和矿化成熟，同时也刺激破骨细胞增殖分化，导致新骨的形成超过吸收最终使得骨量增加为理论基础的用药，主要包括：甲状旁腺激素、活性维生素D3、氟化物、雄激素、前列腺素E2、生长激素、生长因子等。第一类药物存在的问题是只抑制骨丢失而对骨量增加没有贡献；第二类药物存在的问题是在骨吸收活动没有得到控制的前提下，提高骨量和骨密度，但达到理想的效果非常有限。目前两大类药物的作用靶点单一、副作用大，长期使用价格昂贵，并不能满足庞大的骨质疏松患者群体的需要。

中草药补骨脂为豆科植物补骨脂的干燥果实，性温，味辛、苦，有补肾助阳，纳气止泻之功效。首见于《开宝本草》，《药性论》则对其描述为：“治男子腰痛膝冷囊湿，逐诸冷痹顽，止小便利，腹中冷”，具有补肾助阳、固精缩尿、温中止泻作用。补骨脂中主要活性成分为香豆素、黄酮以及单萜酚类等。现代药理学研究表明，补骨脂水提液体外能够促进成骨细胞增殖和分化，体内能够增加去卵巢大鼠骨密度，促进骨的形成，具有良好的的抗骨质疏松作用。杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥树皮。味甘，性温。归肝、肾经。具有补肝肾，强筋骨，安胎的作用。用于肝肾不足，腰膝酸痛筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安。《神农本草经》中记载：“主腰脊痛，补中，益精气，坚筋骨，强志，除阴下痒湿，小便余沥，久服轻身耐老。”杜仲中主要活性成分为环烯醚萜苷、木脂素、苯丙素和黄酮类成分。现代药理学研究发现杜仲提取物能促进MC3T3-E1成骨细胞的生长。盐制杜仲可抑制骨吸收，提高骨的强度及质量，对去势大鼠骨质疏松有一定的防治作用。补骨脂和杜仲用于骨质疏松症的防治具有悠久的历史，在诸多经典名方中均有体现，青娥丸传统的经典名方，成方由补骨脂、杜仲、核桃和大蒜组成，具有补肾健骨强腰的功效。

骨质疏松症目前尚无有效的治疗药物，而传统药物的副作用较大，限制了其广泛应用。我国有着丰富的中草药资源，而且中医药治疗骨质疏松症已有上千年的历史，其中补骨脂和杜仲在骨科中药方剂中现频次较高。我们之前的研究基础，发现补骨脂和杜仲出的有效提取部位或是单体成分联合使用，既可以可促进成骨细胞的增殖和分化成熟，又可以抑制破骨细胞的活性，发挥促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用，从而起到治疗骨质疏松症。

发明内容

为了解决以上问题，基于组分中药的思想，本发明的目的在于提供一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物，及其在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。

技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：

一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物，活性成分由补骨脂二氢黄酮和咖啡酸组成。

上述含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物，活性成分中补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的重量比为0.5-1：1。

上述含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物，活性成分中补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的重量比为0.8：1。

上述含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。

与现有技术相比，本发明涉及的补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物具有如下优点和显著的进步：补骨脂二氢黄酮可以刺激成骨细胞的增殖和分化，从而促进骨形成，咖啡酸抑制了破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收，补骨脂二氢黄酮联合咖啡酸使用起到双重调节的作用，从而起到治疗骨质疏松的作用。这些都表明，联合用药、小分子联合用药或其衍生物在骨质疏松治疗方面具有很好的前景。

具体实施例

实施例1

补骨脂二氢黄酮，咖啡酸均购置于南京泽朗医药科技公司，两种化合物纯度均大于98％，取补骨脂二氢黄酮5g、咖啡酸10g，混合，加入淀粉，灌胶囊，制备得含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的胶囊。

实施例2

补骨脂二氢黄酮，咖啡酸均购置于南京泽朗医药科技公司，两种化合物纯度均大于98％，取补骨脂二氢黄酮8g、咖啡酸10g，混合，加入淀粉，灌胶囊，制备得含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的胶囊。

实施例3

补骨脂二氢黄酮，咖啡酸均购置于南京泽朗医药科技公司，两种化合物纯度均大于98％，取补骨脂二氢黄酮10g、咖啡酸10g，混合，加入淀粉，灌胶囊，制备得含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的胶囊。

试验一、补骨脂二氢黄酮和咖啡酸联合使用对成骨细胞活性影响

1.1、主要试剂

MTT(AMRESCO公司)，RPMI1640培养基(美国invitrogen公司)，胎牛血清(美国GIBICO公司)，PBS(美国GIBICO公司)，胰酶(美国GIBICO公司)，96孔细胞培养板(greiner bio-one公司)。

1.2药物

按上述实施例3的方法制备含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的胶囊。

1.3主要仪器

可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司，型号：SPECTRA MAX190)，莱卡倒置荧光显微镜(德国莱卡公司，型号：DMIL)，精密移液器(法国吉尔森公司，型号：P2)，CO₂培养箱(FORMA，型号：3111)，电子天平(德国赛多利斯有限公司，型号：BT323S)，离心机(美国BECKMAN公司，型号：GS-15R)，排枪(GILSON pipetman UltraZ20324K)。

2实验方法

2.1药物溶液的配制

补骨脂二氢黄酮溶液：取5.73mg补骨脂二氢黄酮，用DMSO溶解，配制成10mmol／L的溶液。

咖啡酸溶液：取5.50mg化合物，用DMSO溶解，配制成10mmol／L的溶液。

2.2成骨细胞的分离和培养

在无菌条件下取新生24h内的雄性SD鼠(南京中医药大学动物中心提供)颅骨，用镊子去除表面膜层，PBS液清洗3次，用37℃胰酶消化30min，再次用PBS液清洗3次，用37℃胶原酶II消化60min后，消化液1000r／min离心10min，收集释放成骨细胞，将细胞转移培养瓶，加入5mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.，3MTT法测量组合物对于成骨细胞增殖的影响

取对数生长期的成骨细胞细胞，弃培养液。加10mL PBS洗一次，弃PBS后，加入1mL0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5mL完全培养基中和反应，吹打后将细胞转入10mL离心管中，1000r／min离心3min。配细胞悬液，苔盼蓝染色计数后，用适量的完全培养基调整细胞浓度为5×10³／mL。将细胞加入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液90μL，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5％CO₂)常规培养。待细胞生长至70％加入10μL测试药液。对照组加入10μL DMEM。(每个药物浓度设6个复孔)将培养板放回细胞培养箱，48h后加入20μL MTT(5mg／mL)溶液，继续在培养箱中孵育4h。倒扣掉上清，吸水纸拍干，每孔加150μLDMSO，摇床避光震摇15min，使结晶物充分溶解。用全自动酶标仪在490nm测定吸光值，实验重复3次，取3次平均值。

结果以药物对细胞的生长增值率表示：

增值率(％)=[(对照-空白)-(给药-空白)]／(对照-空白)×100％

3统计处理

采用SPSS16.0软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。

4实验结果

MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当单独1μM补骨脂二氢黄酮时，对成骨细胞增殖率有差异(P＜0.05)，单独1μM咖啡酸对成骨细胞无明显促进作用，没有统计学差异，当0.5μM补骨脂二氢黄酮联合0.5μM咖啡酸使用时有显著性差异(P＜0.005)。

表1补骨脂二氢黄酮联合咖啡酸对成骨细胞增殖率影响(X±SD)

注：与对照组比较**P＜0.01；***P＜0.001

试验二、补骨脂二氢黄酮和咖啡酸联合使用对破骨细胞增殖影响

1.1、主要试剂

MTT(AMRESCO公司)，RPMI1640培养基(美国invitrogen公司)，胎牛血清(美国GIBICO公司)，PBS(美国GIBICO公司)，胰酶(美国GIBICO公司)，96孔细胞培养板(greiner bio-one公司)。

1.2、主要仪器

可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司，型号：SPECTRA MAX190)，莱卡倒置荧光显微镜(德国莱卡公司，型号：DMIL)，精密移液器(法国吉尔森公司，型号：P2)，CO₂培养箱(FORMA，型号：3111)，电子天平(德国赛多利斯有限公司，型号：BT323S)，离心机(美国BECKMAN公司，型号：GS-15R)，排枪(GILSON pipetman UltraZ20324K)。

1.3药物

按上述实施例3的方法制备含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的胶囊。

2实验方法

2.1破骨细胞的培养

将80-100g SD大鼠断颈处死，75％乙醇浸泡15min，无菌条件下取四肢长骨(股骨、肱骨、胫骨)，剔除软组织及骨垢，置于冷的PBS缓冲液中洗净。然后在冷的α-MEM全培养液(15％胎牛血清，青霉素100IU／mL，链酶素100mg／mL，10^-8’mol／L1，25-(OH)₂-D)内，将骨干纵形剖开，用尖手术刀轻刮骨的内表面，并用尖吸管吸取培养液反复冲洗髓腔面，至颜色变白，静置1min，取细胞悬液，接种于预置盖玻片的24孔培养板上(每孔已加1mLα-MEM全培养液，并在CO₂孵育箱中孵育1h)，每孔加细胞悬液0.5mL，置于CO₂孵育箱中培养。

2.2加入药物

于培养16h后用PBS缓冲液冲洗未附着于盖玻片上的细胞，每孔加入1mLα-MEM全培养液，其中对照组中加入10μL／mL的载体溶液DMEM，实验组中分别加入1×10^-6mol／L的补骨脂二氢黄酮、咖啡酸或者两者联合使用，每3d更换培养液液一次，补充等量的新培养液及等量的化合物载体溶液和药物。

2.3活性测定

72h后分别进行TRAP活性测定，24孔板中每孔加入缓冲液和基质液各0.2mL，37℃水浴15min，每孔加入显色液0.6mL，充分混匀后于紫外分光光度计上测定510nm处的吸光度(OD)值。实验重复3次，取3次平均值。

3统计处理

采用SPSS16.0软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。TRAP酶活力测定法实验后统计结果显示，与对照组比较，当单独1μM补骨脂二氢黄酮时，对破骨细胞增殖率无明显差异，单独1μM咖啡酸对破骨细胞有明显的增值抑制作用(P＜0.01)，当0.5μM补骨脂二氢黄酮联合0.5μM咖啡酸使用显著抑制了破骨细胞的增殖(P＜0.001)。

表2补骨脂二氢黄酮联合咖啡酸对破骨细胞TRAP活性影响(X±SD)

注：与对照组比较**P＜0.01；***P＜0.001

4实验结果

由上述实验结果可见，单独使用补骨脂二氢黄酮，有一定的促进成骨细胞增殖的作用，单独使用咖啡酸时，对成骨细胞增殖并无明显影响，但是补骨脂二氢黄酮和咖啡酸协同作用时，对于促进成骨细胞增殖作用明显增强，同时，单独使用补骨脂二氢黄酮，对破骨细胞TRAP酶活性并无明显影响，单独使用咖啡酸时，一定程度上抑制了破骨细胞的增殖，但是补骨脂二氢黄酮联合咖啡酸使用时，显著降低了破骨细胞TRAP酶活性，明显抑制破骨细胞的增殖。补骨脂二氢黄酮联合咖啡酸使用补骨脂显著提高了其促进成骨细胞增殖的活性，而且增加了其对于破骨细胞增殖的活性，进一步表明其用于治疗骨质疏松的良好效果。

实验结论

本发明药物组合既可以可促进成骨细胞的增殖，又可以抑制破骨细胞的活性，发挥促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用，从而起到治疗骨质疏松症。

Claims (3)

1.一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物，其特征在于：活性成分由补骨脂二氢黄酮和咖啡酸组成，补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的重量比为0.5-1∶1。

2.根据权利要求1所述含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物，其特征在于：活性成分中补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的重量比为0.8∶1。

3.权利要求1所述一种含补骨脂二氢黄酮和咖啡酸的药物组合物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。