CN113116870A - 大麻二酚在制备促进口腔黏膜愈合的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备促进口腔黏膜愈合的药物中的应用。本发明创造性地发现可以将大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物用于制备促进口腔黏膜愈合的药物中，其对口腔黏膜角质细胞具有显著的促进增殖、迁移作用以及抑制口腔黏膜角质细胞过度焦亡的作用；其对口腔溃疡模型小鼠的口腔黏膜促愈合具有显著的效果；通过转录组测序技术分析发现，其对诱发炎症的角质细胞多数基因都有下调作用，尤其是对NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡的相关基因均有明显下调作用。

Description

大麻二酚在制备促进口腔黏膜愈合的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物应用领域，具体涉及一种促进口腔黏膜愈合的新策略，尤其涉及大麻二酚在制备促进口腔黏膜愈合的药物中的应用。

背景技术

口腔黏膜的炎症性病损，累及上皮及上皮下结缔组织(固有层)，疼痛剧烈，可严重影响患者的生活质量。其为病因不明的多因素综合作用结果，目前尚无稳定、有效的治疗手段，临床处理多为对症治疗，以减缓疼痛、促进愈合为主，如口腔冲洗，局部或全身使用止痛药、激素等。近年来，学者们陆续提出采用生长因子、抗炎物质、免疫调节剂、抗辐射药物等来预防和治疗，大多仍处于临床前阶段，且多数生长因子具有潜在的促进癌细胞生长的风险。

CN101468039B公开了一种治疗口腔粘膜病的复方双层缓释药膜的制备方法，是以冰片、人工牛黄、替硝唑、盐酸达克罗宁、吐温-80、甘油、糖精钠、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇等原料制成的。这种复方双层缓释药膜克服了中西药单方、单层膜的缺点，耐用持久，疗效明显，有促进口腔病变处愈合之功效。双层膜与单层膜相比，由单层释药变为双层释药，使药物限于局部与病变部位接触，减少了药物外流，降低口腔药物异味。

CN104189165A公开了一种针对口腔粘膜溃疡的中药制剂，其配方中各组成部分的质量配比是：大黄500～700g；芒硝500～700g；甘草500～700g；栀子200～400g；黄芩200～400g；薄荷200～400g；连翘1100～1300g。其直接作用于粘膜，药物吸收快，疗效明显，具有生物相容性好、阻止渗液溢出、止血止痛、消炎抑菌、促进肉芽组织和粘膜组织的形成皮肤粘膜组织愈合和修复快等特点。

CN106692201A公开了一种防治放射性口腔粘膜炎的组合物及其应用，该组合物包括贻贝软组织提取物和真菌多糖。本发明的防治放射性口腔粘膜炎的组合物可以阻断外源因素导致的辐射损伤，具有超强的抗辐射作用，预防口腔黏膜炎的同时促进口腔黏膜组织再生与修复，缩短创面愈合时间，消炎止痛。本发明温和、无刺激、无毒副作用、无使用依赖性。

大麻叶提取物中的主要活性成分是大麻素，大麻植物中分离得到的大麻素有四氢次大麻酚(THCV)、大麻二酚(CBD)、次大麻二酚(CBDV)、大麻萜酚(CBG)等。其中大麻二酚作为一种非精神作用类的成分，在抗肿瘤、神经系统保护、免疫调节和抗炎抗氧化等多方面具有药用价值。近年来，研究者们对大麻素的药理研究以及药物开发利用取得了较大进展，但在口腔领域尤其是促进口腔黏膜愈合方面研究甚少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进口腔黏膜愈合的新策略，尤其提供大麻二酚在制备促进口腔黏膜愈合的药物中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备促进口腔黏膜愈合的药物中的应用。

本发明创造性地发现可以将大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物用于制备促进口腔黏膜愈合的药物中，通过大麻二酚对人口腔角质细胞生物学行为影响的探究和口腔溃疡模型小鼠治疗效果的探究发现，其对口腔黏膜角质细胞具有显著的促进增殖、迁移作用以及抑制口腔黏膜角质细胞过度焦亡的作用，且这三种作用呈浓度及时间依赖性；其对口腔溃疡模型小鼠的口腔黏膜促愈合具有显著的效果；通过转录组测序技术分析发现，其对诱发炎症的角质细胞多数基因都有下调趋势，尤其是NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡的相关基因均有明显下调作用。

优选地，所述药物促进口腔角质细胞增殖。

优选地，所述药物促进口腔角质细胞迁移。

优选地，所述药物抑制口腔角质细胞焦亡。

优选地，所述药物抑制NLRP3炎症小体激活途径。

第二方面，本发明提供大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备口腔角质细胞增殖促进剂中的应用。

第三方面，本发明提供大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备口腔角质细胞迁移促进剂中的应用。

第四方面，本发明提供大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备口腔角质细胞焦亡抑制剂中的应用。

此处的口腔角质细胞焦亡抑制剂是指大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在缓解炎症、促进愈合的过程中可以抑制口腔角质细胞过度的焦亡，而不是指完全抑制焦亡。

第五方面，本发明提供大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备NLRP3炎症小体激活途径抑制剂中的应用。

在本发明中，所述药物还可以包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料包括稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如粘合剂和稀释剂的组合、载体和调味剂的组合、粘合剂和填充剂的组合等，其他任意的组合方式便不在此一一赘述。

优选地，所述载体包括脂质体、胶束、树状大分子、微球或微囊。

本发明所述大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物可以负载于常用药用载体上作为促进口腔黏膜愈合的药物，实现更好的生物相容性、靶向性、生物安全性和给药效果。

本发明所述大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物还可以与其他药物联用实现对口腔黏膜愈合更好的促进效果。

优选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、注射剂、喷剂、膜剂、栓剂、滴鼻剂或滴丸剂，优选口腔喷剂。

用大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物为活性成分的药物可以根据实际需要被制备成上述任一种药物剂型，各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法进行制备。

在本发明中，所述药物的给药途径可以根据实际需要选择口服给药、舌下给药、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口腔喷雾给药或经皮给药的任意一种方式。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地发现可以将大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物用于制备促进口腔黏膜愈合的药物中，通过大麻二酚对人口腔角质细胞生物学行为影响的探究和口腔溃疡模型小鼠治疗效果的探究发现，其对口腔黏膜角质细胞具有显著的促进增殖、迁移作用以及抑制口腔黏膜角质细胞过度焦亡的作用，且这三种作用呈浓度及时间依赖性；其对口腔溃疡模型小鼠的口腔黏膜促愈合具有显著的效果；通过转录组测序技术分析发现，其对诱发炎症的角质细胞多数基因都有下调趋势，尤其是NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡的相关基因均有明显下调作用。为研究口腔黏膜损伤的治疗策略提供了理论依据，为制备新的促进口腔黏膜愈合的药物提供了一个嵌入点。

附图说明

图1是大麻二酚对人口腔角质细胞促增殖作用的结果图(图中CBD-0、CBD-0.5、CBD-2、CBD-10、CBD-50分别代表含浓度为0、0.5、2、10、50μmol/L大麻二酚的培养基培养的结果)；

图2是大麻二酚对人口腔角质细胞促迁移作用的结果图(图中从上至下，从左至右依次代表浓度为0、0.5、2、10、50μmol/L的大麻二酚给药0h、24h、48h后划痕细胞迁移情况)；

图3A是大麻二酚对人口腔角质细胞抑制焦亡作用的结果图(图3A代表不给予大麻二酚和给予50μmol/L大麻二酚处理后细胞焦亡比例)；

图3B是大麻二酚对人口腔角质细胞抑制焦亡作用的结果图(图3B是图3A结果的统计学分析结果)；

图4是大麻二酚对小鼠体重的影响结果图；

图5是大麻二酚对小鼠口腔黏膜愈合的影响结果图；

图6是小鼠口腔组织HE染色结果图(其中(a)、(b)、(c)图分别代表阴性对照组、低浓度药物组、高浓度药物组的HE染色结果)；

图7是小鼠口腔组织EDU染色结果图(其中(a)、(b)、(c)图分别代表阴性对照组、低浓度药物组、高浓度药物组的EDU染色结果)；

图8是小鼠口腔组织免疫荧光染色结果图(其中(a)、(b)、(c)图分别代表阴性对照组、低浓度药物组、高浓度药物组免疫荧光染色结果)；

图9A是转录组测序分析结果图(A为给予大麻二酚后细胞表达差异基因火山图)；

图9B是转录组测序分析结果图(B为NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡相关基因集富集结果图)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

其中药物大麻二酚的来源为：云南汉盟制药有限公司自制样品；

实验动物SPF级C57BL/6小鼠购自于上海南方模式生物科技股份有限公司，250-350g，雄性，对小鼠所有操作均在无菌层流室内进行；

口腔角质细胞(永生化人口腔角质细胞HOK-16B在含角质细胞生长因子的SFM培养基中培养)购自加州大学洛杉矶分校No-Hee Park实验室。

实施例1

大麻二酚对口腔角质细胞的促增殖作用评价

采用CCK-8法检测口腔角质细胞活力，操作方法为：制备细胞悬液，细胞计数；接种到96孔板中，每孔细胞数目约5000/mL，每组设3个副孔，每孔中加入100μL培养液；37℃培养箱中培养24小时。再换成含不同浓度的(0、0.5、2、10、50μmol/L)大麻二酚的培养基分别培养24、48、72、96h后，应用CCK8试剂盒检测不同组口腔角质细胞的增殖情况(具体操作步骤按照试剂盒说明书进行)。

结果如图1所示，由图1中可知：大麻二酚具有显著促进口腔角质细胞增殖的作用，而且大麻二酚对口腔角质细胞的增殖促进作用具有显著的浓度依赖性和时间依赖性。

实施例2

大麻二酚对口腔角质细胞的促迁移作用评价

细胞划痕实验检测口腔角质细胞迁移行为，操作方法为：制备细胞悬液，细胞计数；将口腔角质细胞HOK-16B接种于12孔板，每孔细胞数目约1×10⁵个mL，每组设3个副孔，每孔中加入800μL培养液；37℃培养箱中培养过夜后孔板底铺满单层角质细胞。用200μl枪头垂直于孔板底制造细胞划痕(尽量保证各划痕宽度一致)。吸去原培养液，PBS洗三次，换含不同浓度大麻二酚(0、0.5、2、10、50μmol/L)的无血清培养基，拍照记录。置于5％CO2、37℃孵箱中孵育，每隔24小时取出拍照。

结果如图2所示，由图2中可知：大麻二酚具有显著促进口腔角质细胞迁移的作用，且其促进作用与浓度呈正相关。

实施例3

大麻二酚对口腔角质细胞的抑制焦亡作用评价

Annexin V-FITC检测口腔角质细胞焦亡，操作方法为：制备细胞悬液，细胞计数；将口腔角质细胞HOK-16B接种于6孔板中，分别加入含不同浓度的(0、50μmol/L)大麻二酚的培养基，置于5％CO2、37℃孵箱中孵育。接种48h后,用Annexin V-FITC细胞焦亡检测试剂盒检测焦亡率(具体操作步骤按照试剂盒说明书进行)。

结果如图3A和图3B所示：给予50μmol/L大麻二酚后HOK-16B细胞焦亡率低于未给大麻二酚的辅料对照组(图3A中Q2、Q3象限代表焦亡早期及晚期的细胞)，且由图3B看出二者的差异有统计学意义。

实施例4

体内评价试验

具体操作方法如下：

(1)采用机械损伤法建立小鼠口腔溃疡模型

将成年雄性小鼠(250-350g)置于塑料笼中正常喂养5天适应动物实验中心环境。随机分成3组，每组30只。三组小鼠行腹腔注射麻醉后，用内径5mm的环切钻直接钻取舌背黏膜组织造成直径约5mm、深约1mm的缺损，并持续给予高粘稠度饮食，造模1天后溃疡形成。

(2)分别设置阴性对照组(用1mL生理盐水替代药物)、低浓度药物组(1mg/mL)和高浓度药物组(10mg/mL)，从口腔溃疡形成当天(造模后1天)开始分别在三组小鼠舌背溃疡处局部口喷给药，每天1次。给药3天后(造模后4天)收样观察。

评价指标包括如下内容：

(1)体重变化监测

操作方法为：从口腔溃疡建模当天开始，每天监测各组小鼠的体重变化。结果如图4所示：随着病程进展，小鼠体重先下降后回升，低浓度给药组与对照组体重变化无明显差异，高浓度给药组体重回升明显更快。

(2)溃疡大小变化监测

操作方法为：从口腔溃疡建模当天开始，每天测量口腔溃疡病损的最大径(D)和最小径(d)，溃疡大小记为二者均值。结果如图5所示，由图可知：给予大麻二酚局部喷雾处理后，溃疡尺寸明显减小，即给药后促进口腔黏膜愈合，且高浓度组比低浓度组促愈合效应更显著。

(3)HE染色

操作方法为：舌体组织石蜡切片常规脱蜡后，苏木素染色，水洗反蓝后伊红染色，切片梯度酒精脱水、透明后中性树胶封片，倒置显微镜下观察、采图。

结果如图6所示，由图可知(虚线标记为缺损处)：给予药物三天后高浓度及低浓度药物组上皮屏障均已基本恢复(图6-b,c)，其中低浓度药物组上皮下有少许炎细胞浸润(图6-b)，而阴性对照组上皮层未完全恢复，仍存在较明显缺损，且缺损处及其周边炎性细胞浸润明显(图6-a)。可见给予大麻二酚可明显促进口腔黏膜溃疡病损愈合。

(4)EDU染色

操作方法为：收样前两小时小鼠腹腔注射EDU，两小时后收样，制作组织石蜡切片，常规脱蜡后，0.5％TritonX-100破膜组织，EDU室温避光孵育30min后，DAPI复染细胞核，封片，荧光显微镜下观察、采图。

如图7所示，由图可知(虚线标记为缺损处)：给予药物三天后高浓度药物组缺损周围上皮及上皮下结缔组织细胞明显增殖(图7-c)，低浓度药物组仅在缺损周围上皮细胞存在明显增殖(图7-b)，而阴性对照组在缺损处及周围均无明显的细胞增殖(图7-a)。可见给予大麻二酚可明显促进病损边缘上皮及上皮下结缔组织细胞的快速增值，且促进效应与药物浓度呈正相关。

(5)免疫荧光染色

操作方法为：舌体组织收样后固定、制作组织石蜡切片，常规脱蜡后，柠檬酸钠抗原热修复、过氧化氢抑制内源性过氧化物酶体，4℃下孵育一抗过夜，37℃孵育二抗1小时，DAPI复染细胞核，封片，荧光显微镜下观察、采图。

如图8所示，由图可知(虚线标记为缺损处)：给予药物后三天后阴性对照组缺损及缺损周围上皮下结缔组织均有明显的炎症因子IL-6浸润(图8-a)，低浓度药物组仅在缺损处上皮下结缔组织存在少量炎症因子IL-6浸润(图8-b)，而高浓度药物组在缺损处及周围均无明显的炎性浸润(图8-c)。说明给予大麻二酚可抑制炎症因子IL-6的释放，且效应与给药浓度呈正相关。

实施例5

转录组测序分析

通过转录组测序技术分析炎症刺激的口腔角质细胞给予大麻二酚处理后相关基因的变化。具体操作方法如下：制备细胞悬液，细胞计数；将口腔角质细胞HOK-16B接种于6孔板中，置于5％CO2、37℃孵箱中孵育18h，给予LPS(100ng/mL)6h后，加入不同浓度的(0、50μmol/L)大麻二酚处理2h，最后加入ATP(4mM)处理30min后细胞收样，提取总RNA进行转录组测序分析。

结果如图9A和9B所示，由图可知：体外诱发炎症的角质细胞给予大麻二酚处理后多数基因都有下调趋势(如图9A中的点为大麻二酚处理组相对于对照组表达有差异的基因，横坐标代表差异倍数，正负代表上、下调，绝对值越大代表差异倍数越大；纵坐标代表调整后的P值，数值越大代表差异越显著，因此图中横、纵虚线分出的区域，即左上方格和右上方格认为是大麻二酚处理后有显著下调和显著上调的基因)。其中图9B列出的给药组相对于对照组，与NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡相关的基因均有明显下调(CK1-3为给药组，NC1-3为对照组，颜色由浅到深即为表达量由低到高)。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的大麻二酚在制备促进口腔黏膜愈合的药物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备促进口腔黏膜愈合的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物促进口腔角质细胞增殖；

优选地，所述药物促进口腔角质细胞迁移。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物抑制口腔角质细胞焦亡。

4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物抑制NLRP3炎症小体激活途径。

5.大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备口腔角质细胞增殖促进剂中的应用。

6.大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备口腔角质细胞迁移促进剂中的应用。

7.大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备口腔角质细胞焦亡抑制剂中的应用。

8.大麻二酚或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备NLRP3炎症小体激活途径抑制剂中的应用。

9.如权利要求1-8中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述辅料包括稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述载体包括脂质体、胶束、树状大分子、微球或微囊。

10.如权利要求1-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、注射剂、喷剂、膜剂、栓剂、滴鼻剂或滴丸剂，优选口腔喷剂。

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