TW202002987A - 人參皂苷m1用於治療口腔癌之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於人參皂苷M1用於治療口腔癌之新用途。

Description

人參皂苷M1用於治療口腔癌之用途

相關參照。本申請案主張於2018年4月17日提交的美國臨時申請號62/658,732之效益，其全部內容係藉由引用併入本文。

本發明係關於人參皂苷M1用於治療口腔癌，特別是口腔鱗狀細胞癌（OSCC）之新用途。

根據台灣行政院衛生署最近的報告，口腔癌影響了大量處於經濟生產年齡的患者，而每年台灣約有2300名平均年齡為58.3歲的男性死於口腔癌。口腔癌也是全世界常見的惡性腫瘤，並且口腔癌的發病率每年持續增加（Murugan等，2012）。口腔癌的常用療法係有關於以下一種或多種形式：手術、化學療法及放射療法。不幸的是，儘管臨床管理有進展，存活率仍然低（Petti和Scully，2007；Tsantoulis等，2007）。此外，一些抗癌治療具有毒性副作用（例如，對正常牙齦上皮樣細胞的毒性損害），並且經歷抗癌治療的患者通常遭受低生活品質甚至危及生命的併發症。這強烈強調了發現和開發新的有效治療方法以改善口腔癌患者預後的重要性，尤其是減少副作用。

已知人參的主要活性成分人參皂苷具有多種藥理活性，例如抗腫瘤、抗疲勞、抗過敏及抗氧化活性。人參皂苷具有基本結構，由具有17個碳原子排列成四環的性脂烷（gonane）類固醇核組成。人參皂苷在體內金屬化，而最近的一些研究表明，人參皂苷代謝物，而不是天然存在的人參皂苷，很容易被人體吸收並充當活性成分。其中，經由人類腸道細菌的絞股藍皂苷途徑（gypenoside pathway），人參皂苷M1已知為原人參二醇型（protopanaxadiol-type）人參皂苷的一種代謝產物。迄今為止，並無先前技術參考文獻報導了人參皂苷M1在治療口腔癌中的效用。

本發明中，非可預期地發現人參皂苷M1能有效抑制口腔癌細胞的生長、群落形成及遷移，並減少口腔癌動物中的腫瘤生長。特別是，發現人參皂苷M1對口腔癌細胞具有選擇性毒性，因此其可以有效治療口腔癌而對正常的牙齦上皮樣細胞毒性較小的定量投予。因此，本發明提供了一種藉由投予人參皂苷M1作為抗癌劑及/或癌轉移抑制劑來治療個體口腔癌的新方法，其具有較少的副作用。

特別地，本發明提供了治療有需要的個體的口腔癌之方法，包含向個體投予有效治療個體的量的人參皂苷M1。

特定而言，本發明的治療方法能有效抑制口腔癌細胞的生長或移轉。本發明的治療方法亦有效於減少患有口腔癌的個體中的腫瘤生長。

在一些具體實施例中，本發明的治療方法包含以對口腔癌細胞選擇性毒性的量投予人參皂苷M1。

在一些具體實施例中，口腔癌細胞為口腔鱗狀細胞癌（OSCC）。

在一些具體實施例中，人參皂苷M1係藉由腸胃外或腸內途徑而投予。

本發明還提供了人參皂苷M1用於製備治療有需要的個體的口腔癌的藥物之用途。本發明進一步提供包含人參皂苷M1之組合物，其用於治療有需要的個體的口腔癌。

下面的描述中闡述了本發明的一或多個具體實施例的細節。由以下對若干具體實施例的詳細描述以及由所附申請專利範圍，本發明的其他特徵或優點將顯而易見。

除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的技術人員通常理解的含義。如本文所用，除非另有說明，否則以下術語具有歸屬於它們的含義。

本文使用的冠詞「一」和「一個」指的是冠詞的一個或多於一個（即，至少一個）語法對象。舉例來說，「一元素」表示一個元素或多於一個元素。

「包含(comprise)」或「包含(comprising)」等詞通常以包括(include/including)的含義使用，其意味著允許存在一種或多種特徵、成分或要素。「包含(comprise)」或「包含(comprising)」等詞包括「組成了」或「由......組成」等詞。

細胞凋亡是抗癌藥物媒介細胞死亡的重要機制之一。其係由兩種主要途徑誘導：線粒體（內在）途徑和死亡受體（外在）途徑。線粒體途徑係藉由從線粒體向胞質液中釋放促凋亡因子（proapoptotic factor），例如細胞色素c和凋亡誘導因子，而被活化。線粒體外膜通透性受Bcl-2家族蛋白調節，Bcl-2家族蛋白是細胞色素c釋放與凋亡蛋白酶活化的中心調節劑（Martinou和Youle，2011）。從線粒體釋放後，細胞色素c可與dATP和凋亡蛋白酶活化因子-1結合，導致凋亡蛋白酶-9和凋亡蛋白酶-3的活化。活化的凋亡蛋白酶-3切割各種基質，包括聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），一種DNA修復酶，從而導致不可避免的細胞死亡（Green和Reed，1998）。死亡受體途徑係有關於Fas和腫瘤壞死因子受體家族的其他成員，觸發凋亡蛋白酶-8活化（Thorburn，2004）。凋亡蛋白酶-8直接活化凋亡蛋白酶-3並切割Bid，然後觸發線粒體途徑（Yin，2000）。在經歷抗癌藥物治療的細胞中，通常在細胞凋亡過程中觀察到活性含氧物（ROS）的產生（Meshkini和Yazdanparast，2012）。增加的ROS量可能導致DNA損傷，並且這些受損細胞隨後經歷細胞週期停滯以促進DNA修復，或誘導細胞凋亡以消除過度受損的細胞（Norbury和Zhivotovsky，2004）。DNA損傷可能通過藉由直接刺激p21WAF1/CIP1（細胞週期蛋白依賴性酶抑制劑（Cdks））的表現來抑制G1/S和G2/M兩者轉換，從而活化p53依賴性細胞凋亡（Vousden和Lu，2002）。DNA損傷也可能活化蛋白酶ATM和ATR，其隨後觸發蛋白酶Chk1和Chk2的活化，而蛋白酶Chk1和Chk2藉由去活化Cdc25（通常活化Cdc2的磷酸酶）來抑制Cdc2（Canton和Scott，2010）。

本發明中，非可預期地發現人參皂苷M1可抑制口腔癌細胞的生長和遷移。本發明中還證明，人參皂苷M1在患有口腔癌的動物模型中有效減少腫瘤生長。特定而言，人參皂苷M1在誘導口腔癌細胞的凋亡和降低遷移活性的同時，抑制存活力和群體形成是有效的。這些結果表明人參皂苷M1可預防和減輕口腔癌。更特定而言，人參皂苷M1對口腔癌細胞具有選擇性毒性，因此可以有效殺死口腔癌細胞而對正常細胞(例如： 正常的牙齦上皮樣細胞)的毒性較小的定量投予。

因此，本發明提供了一種治療有此需要的個體的口腔癌之方法，包含向個體投予有效治療個體的量的人參皂苷M1。本發明還提供了一種人參皂苷M1用於製備治療有需要的個體的口腔癌的藥物之用途。本發明進一步提供一種包含人參皂苷M1之組合物，其用於治療有需要的個體的口腔癌。

在一些具體實施例中，治療方法有效抑制口腔癌細胞的生長。特定而言，治療方法有效抑制口腔癌細胞的存活力和群體形成及/或誘導細胞凋亡。

在一些具體實施例中，治療方法有效抑制口腔癌細胞的遷移。

人參皂苷M1、20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20（S）-原人參二醇為本領域已知的皂苷代謝物之一。人參皂苷M1的化學結構如下：

經由人類腸道細菌的絞股藍皂苷途徑，人參皂苷M1已知為原人參二醇型人參皂苷的一種代謝產物。攝入後可在血液或尿液中發現人參皂苷M1。人參皂苷M1可藉由本領域已知的方法通過真菌發酵從人參植物製備，例如台灣專利申請號094116005（I280982）和美國專利號7,932,057，其全部內容係藉由引用併入本文。在某些具體實施例中，用於製備人參皂苷M1的人參植物包括五加科（Araliaceae），人參（Panax）屬，例如，人參屬（P. ginseng）及假人參屬（P. pseudo-ginseng）（也稱為三七）。通常，製備人參皂苷M1的方法包括以下步驟：（a）提供人參植物材料（例如葉子或莖）的粉末；（b）提供用於發酵人參植物材料的真菌，其中發酵溫度範圍為20-50℃，發酵濕度範圍為70-100%，pH值範圍為4.0-6.0，發酵週期範圍為5-15天；（c）萃取並收集發酵產物；以及（d）從發酵產物中分離20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20（S）-原人參二醇。

當在本發明中將人參皂苷M1描述為「分離的」或「純化的」時，應理解為不是絕對地分離或純化，而是相對地分離或純化。例如，純化的人參皂苷M1是指與其天然存在的形式相比更純化的人參皂苷。在一具體實施例中，包含純化的人參皂苷M1的製劑可包含總製劑的大於50%、大於60%、大於70%、大於80%、大於90%或100%（w / w）的人參皂苷M1。應理解，當在本文中使用一定數量以顯示比率或劑量時，該數量通常包括正負10%的範圍，或更特定而言，該數量的正負5%的範圍。

本文使用的「個體」或「受試者」等詞包括人與非人動物，例如寵物（例如狗、貓等）、農畜（如牛、羊、豬，馬等）、或實驗動物（如大鼠，小鼠，天竺鼠等）。

本文所用的「治療」乙詞是指施用或投予包括一或多種活性劑的組合物給患有失調、失調的症狀或病症、失調的進展或有發展失調的風險的個體，目的是治療、治癒、減輕、緩解、改變、補救、改善、增進或影響失調、失調的症狀或病症、由失調引起的殘疾、或失調的發作或進展。

本文所用的「副作用」乙詞是指由抗癌治療所誘導的不良作用。具體而言，對於口腔癌治療來說，所產生的副作用包括例如對正常牙齦上皮樣細胞的毒性損傷。

本文使用的「治療有效量」乙詞是指對受治療的個體賦予治療效果的活性成分的量。例如，用於治療癌症的成分的有效量是能夠抑制癌細胞生長或遷移的這種成分的量。特定而言，與未用這種成分治療的靶癌細胞的數量相比，這樣的量有效地將靶癌細胞的數量減少至少10%，例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。較佳地，這樣的量對靶癌細胞具有選擇性毒性。在一些具體實施例中，該成分的投予量選擇性地對靶癌細胞提供比對正常細胞更多的毒性。例如，在某些實例中，該成分可以這樣的量投予，其有效地減少靶癌細胞數量，與未用該成分治療的靶癌細胞的數量相比，減少超過50%（例如，60%、70%、80%、90%或100%），同時對正常細胞引發的毒性較小，例如，與未用該成分治療的正常細胞的數量相比，減少正常細胞的數量少於50%（例如40%、30%、20%、10%或更少）。

治療有效量可根據各種原因而改變，例如投予途徑和頻率、接受該藥物的個體的體重和種類、以及投予目的。本領域技術人員可基於本文的揭露、已建立的方法、及其自身經驗確定每種情況下的劑量。例如，在某些具體實施例中，用於本發明的人參皂苷M1的口服劑量為每天10至1000 mg/kg。在一些實例中，口服本發明中使用的人參皂苷M1的口服劑量為每日100至300 mg/kg、每日50至150 mg/kg、每日25至100 mg/kg、每日10至50 mg/kg，或每日5至30 mg/kg。此外，在本發明的一些具體實施例中，定期地投予人參皂苷M1一段時間，例如，每日投予至少15天、一個月或兩個月或更長時間。

根據本發明，人參皂苷M1可用作治療口腔癌的活性成分。在一具體實施例中，治療有效量的活性成分可與醫藥上可接受的載體一起配製成適當形式的醫藥組合物，以達遞送和吸收之目的。取決於投予模式，本發明的醫藥組合物較佳包含約0.1%重量至約100%重量的活性成分，其中重量百分比是基於整個組合物的重量而計算。

如本文所用，「醫藥上可接受的」意指載體與組合物中的活性成分相容，並且較佳地可穩定該活性成分並且對接受治療的個體來說是安全的。該載體可為活性成分的稀釋劑、載體、賦形劑或基質。合適的賦形劑的一些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠（tragacanth gum）、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿和甲基纖維素。該組合物可另外包含潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；潤濕劑；乳化和懸浮劑；防腐劑，如甲基和丙基羥基苯甲酸酯；甜味劑；及調味劑。本發明的組合物可在投予患者後提供活性成分快速、持續或延遲釋放的效果。

根據本發明，該組合物的形式可為片劑、丸劑、粉末、錠劑、小包、藥片、酏劑、懸浮液、洗劑、溶液、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液和包裝粉末。

本發明的組合物可經由任何生理學上可接受的途徑遞送，例如口服、腸胃外（例如肌肉內、靜脈內、皮下和腹膜內）、透皮、栓劑和鼻內方法。關於腸胃外投予，較佳以無菌水溶液的形式使用，其可包含足以使溶液與血液等滲透壓的其他物質，例如鹽或葡萄糖。根據需要，水溶液可適當地緩衝（較佳pH值為3至9）。在無菌條件下製備合適的腸胃外組合物可用本領域技術人員熟知的標準藥理學技術完成，並且不需要額外的創造性勞動。

根據本發明，人參皂苷M1或包含人參皂苷M1作為活性成分的組合物可用於治療患有口腔癌或有口腔癌風險的個體。特定而言，人參皂苷M1或包含人參皂苷M1作為活性成分的組合物可投予患有口腔癌的個體或有患口腔癌風險的個體，以有效抑制口腔癌細胞生長或遷移的量，以防止疾病的發生或改善症狀或延緩症狀的惡化。口腔癌的一特定實例為口腔鱗狀細胞癌（OSCC）。在一些較佳具體實施例中，人參皂苷M1或包含根據本發明的人參皂苷M1的組合物係以對口腔癌細胞具有選擇性毒性但對正常細胞毒性較小的量而投予。

藉由以下實施例進一步說明本發明，提供這些實例是為了說明之目的而非限制。根據本揭露，本領域技術人員應當理解，在不脫離本發明的精神和範疇的情況下，可對所揭露的具體實施例進行許多改變並仍然獲得相同或相似的結果。

實施例

藉由本領域已知的方法製備人參皂苷M1、20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20（S）-原人參二醇，例如在台灣專利申請號094116005（I280982）及美國專利號7932057中描述的。

在本研究中，我們已研究人參皂苷M1在體外和體內的功效和相關機制。我們證明人參皂苷M1劑量依賴地抑制人類OSCC SAS和OECM-1細胞的存活力，具有與人參皂苷Rh2相似的功效。值得注意的是，人參皂苷M1對正常人類牙齦上皮樣細胞株SG的毒性低於人參皂苷Rh2。為了進一步了解人參皂苷M1的作用模式，進行了針對細胞凋亡的標誌的四種測定，即（1）藉由末端去氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記（TUNEL）測定法測定凋亡DNA斷裂，（2）在碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色核之後，藉由流式細胞儀檢測細胞週期，（3）PI / Annexin V雙染色試驗，及（4）凋亡蛋白酶活化。我們證明了人參皂苷M1在OECM-1和SAS細胞中顯著增加凋亡DNA斷裂、G1期阻滯（G1 phase arrest）、PI /Annexin V雙陽性染色和凋亡蛋白酶-3/9活化。此外，我們證明了人參皂苷M1劑量依賴性地抑制了SAS和OECM-1細胞的群體形成和遷移能力。此外，口服投予或皮下注射人參皂苷M1顯著降低了SAS異種移植小鼠中的腫瘤生長。這些結果表明人參皂苷M1可發展成對抗OSCC的潛在治療劑。

實施例 1 ：人參皂苷 M1 抑制人類口腔癌細胞的存活力

每個6公分培養皿平鋪有5×10⁵ 個人類口腔癌細胞SAS於2ml培養基中，並在5% CO₂ 培養箱中在37℃下生長過夜。將細胞與人參皂苷M1（5~20 μg/ ml）、人參皂苷Rh2（5~20 μg/ml）或載體一起培育24小時。每組含有0.1%的最終DMSO濃度。此後，藉由台盼藍排除法計數細胞數。我們發現人參皂苷M1和人參皂苷Rh2劑量依賴地抑制人類口腔癌SAS細胞（圖1A）和人類口腔癌OECM-1細胞的細胞數（圖1B）。這些結果表明，人參皂苷M1和人參皂苷Rh2均抑制人類口腔癌細胞的存活力；然而，人參皂苷M1和人參皂苷Rh2之間沒有顯著差異。資料表示為平均值±SD；n = 3。*，**和***分別表示與載體對照細胞相比在p >0.05，p >0.01和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

實施例 2 ：人參皂苷 M1 顯示出對正常人類牙齦上皮樣細胞的毒性低於人參皂苷 Rh2

每個6公分培養皿平鋪有5×10⁵ 個正常人類牙齦上皮樣細胞株SG於2ml培養基中，並在5% CO₂ 培養箱中在37℃下生長過夜。將細胞與人參皂苷M1（5~20 μg/ml）、人參皂苷Rh2（5~20 μg/ml）或載體一起培育24小時。每組含有0.1%的最終DMSO濃度。此後，藉由台盼藍排除法計數細胞數。我們發現人參皂苷M1顯示出對SG細胞的毒性低於人參皂苷Rh2（圖2）。20 μg/ml的人參皂苷Rh2完全殺死SG細胞；然而，與對照細胞相比，20 μg/ml的人參皂苷M1僅減少了50%的細胞數（即保留了至少50%的正常細胞）（圖2）。資料表示為平均值±SD；n = 3。**和***分別表示與載體對照細胞相比在p >0.01和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

實施例 3 ：人參皂苷 M1 誘導人類口腔癌細胞的凋亡

為了進一步了解人參皂苷M1的作用模式，進行了針對細胞凋亡的標誌的三種測定，即（1）藉由末端去氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記（TUNEL）測定法測定凋亡DNA斷裂，（2）在碘化丙啶（PI）染色核之後，藉由流式細胞儀檢測細胞週期，（3）PI /Annexin V雙染色試驗，和（4）凋亡蛋白酶活化。每個6公分培養皿平鋪有1×10⁶ 個人類口腔癌細胞OECM-1於2 ml培養基中，並在5% CO₂ 培養箱中在37℃下生長過夜。將細胞與人參皂苷M1（10-20 μg/ml）、50μM順鉑（cistaplatin，CDDP）或載體一起培育24小時。每組含有0.1%的最終DMSO濃度。此後，進行三次測定。我們發現是20 μg/ml人參皂苷M1和50μ M CDDP，而不是10 μg/ml人參皂苷M1，會顯著誘導OECM-1細胞中的凋亡DNA斷裂（圖3A）。此外，測定人參皂苷M1對OECM-1細胞的細胞週期分佈的影響，我們發現用人參皂苷M1和CDDP處理後，G1期細胞以濃度依賴性方式增加，與對照細胞相比，同時降低S和G2/M期細胞的百分比，表明人參皂苷M1和CDDP在G1期誘導細胞週期停滯（圖3B）。用人參皂苷M1和CDDP處理後，亞G1期細胞增加。（圖3B）。此外，我們發現是20 μg/ml人參皂苷M1和50μM CDDP，而不是10μg/ml人參皂苷M1，會顯著增加具有PI/Annexin V雙陽性染色的OECM-1細胞的百分比（圖3C）。這些結果表明，人參皂苷M1在濃度為20 μg/ml時顯著誘導人類口腔癌細胞OECM-1凋亡。人類口腔癌SAS細胞中人參皂苷M1的凋亡誘導活性被證實為人參皂苷M1以劑量依賴性方式誘導凋亡蛋白酶-3和凋亡蛋白酶-9前驅物的減少，表明凋亡蛋白酶-3和凋亡蛋白酶-9被人參皂苷M1活化（圖3D）。資料表示為平均值±SD；n = 3。**和***分別表示與載體對照細胞相比在p >0.01和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

實施例 4 ：人參皂苷 M1 降低人類口腔癌細胞的群體形成能力

每個6公分培養皿平鋪有150個人類口腔癌細胞SAS或OECM-1於3ml培養基中，並在5% CO₂ 培養箱中在37℃下生長過夜。將細胞與人參皂苷M1（5~20 μg/ml）或載體一起培育10天。在第5天將細胞更換為含有相同濃度人參皂苷M1的新鮮培養基。將細胞在4%冰冷的多聚甲醛中於37℃固定15分鐘，並在室溫下用0.1%結晶紫染色10分鐘。對菌落進行計數，我們發現人參皂苷M1劑量依賴地抑制SAS細胞（圖4A）和OECM-1細胞（圖4B）的群體形成能力。資料表示為平均值±SD；n = 4。*和***分別表示與載體對照細胞相比在p >0.05和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

實施例 5 ：人參皂苷 M1 降低人類口腔癌細胞的遷移能力

藉由傷口癒合測定法測量細胞遷移能力。每個6公分培養皿平鋪有5×10⁶ 個人類口腔癌SAS細胞或OECM-1細胞於2 ml培養基中，並在5% CO₂ 培養箱中37℃下生長過夜，直至細胞達到100%聚集形成單層。我們使用無菌的200μl移液管尖端在培養皿上產生划痕的透明區域，並且藉由位相差顯微鏡（phase contrast microscope）拍攝的傷口作為基線。將細胞與人參皂苷M1（5~10 μg/ml）或載體一起培育24小時（SAS細胞）或18小時（OECM-1細胞），然後再次拍照傷口。我們發現5或10 μg/ml的人參皂苷M1顯著抑制人類口腔癌細胞SAS（圖5A）和OECM-1細胞（圖5B）的遷移能力。資料表示為平均值±SD；n = 3。***表示與載體對照細胞相比在p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

實施例 6 ：人參皂苷 M1 減少小鼠中的人類口腔癌生長

為了評估體內人參皂苷M1的抗癌活性，使用人類口腔癌異種移植物。6週齡雄性先天性無胸腺BALB/c裸（nu/nu）小鼠購自BioLASCO Taiwan Co.，Ltd（宜蘭，台灣），並放置在受控溫度（23±3℃）和相對濕度（50±5%）的房間內。根據NIH實驗動物護理和使用指南，經國立宜蘭大學機構動物護理和使用委員會（批准號：第106-13號）批准進行動物實驗。藉由在裸鼠背部皮下（SC）注射2×10⁶ 個人類口腔癌細胞SAS（在75μl PBS+75μl基質膠中）建立異種移植小鼠。在腫瘤大小達到約40~60 mm³ 後，將小鼠隨機分成6組（每組6隻小鼠）：( 1）口服載體對照；（2）口服30 mg/kg人參皂苷M1；（3）口服60 mg/kg人參皂苷M1；（4）口服90 mg/kg人參皂苷M1；（5）SC載體對照；（6）SC 20 mg/kg人參皂苷M1。給小鼠每天口服投予或SC注射載體或人參皂苷M1連續5天。在接受最後一劑人參皂苷M1或載體後24小時，將小鼠犧牲。藉由測量腫瘤的長度（L）和寬度（W）來確定腫瘤體積（TV）。第n天的腫瘤體積（TVn）計算為TV（mm3）=（LxW² ）/2。第n天與第0天的相對腫瘤體積（RTVn）根據下式表示：RTVn = TVn/TV0。我們發現，與載體對照組相比，口服投予90 mg/kg的人參皂苷M1顯著降低腫瘤大小；然而，口服投予30和60 mg/kg的人參皂苷M1並沒有顯著降低腫瘤大小（圖6A）和腫瘤重量（圖6B）。口服投予人參皂苷M1不會顯著影響小鼠的體重（圖6C）。資料表示為平均值±SD；n = 6。**和***分別表示與載體對照小鼠相比在p >0.01和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

此外，與載體對照組相比，SC注射20 mg/kg人參皂苷M1亦顯著降低腫瘤大小（圖7A）和腫瘤重量（圖7B）。SC注射人參皂苷M1不會顯著影響小鼠的體重（圖7C）。資料表示為平均值±SD；n = 6。**表示與載體對照小鼠相比在p >0.01上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。參考文獻 Canton DA, Scott JD. (2010) Chk-ing in and Chk-ing out: kinase compartmentalization comes to checkpoint control. Mol Cell 40: 1-2. Green DR, Reed JC. (1998) Mitochondria and apoptosis. Science 281: 1309-1312. Martinou JC, Youle RJ. (2011) Mitochondria in apoptosis: Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics. Dev Cell 21: 92-101. Meshkini A, Yazdanparast R. (2012) Involvement of oxidative stress in taxol-induced apoptosis in chronic myelogenous leukemia K562 cells. Exp Toxicol Pathol 64: 357-365. Murugan AK, Munirajan AK, Tsuchida N. (2012) Ras oncogenes in oral cancer: the past 20 years. Oral Oncol 48: 383-392. Norbury CJ, Zhivotovsky B. (2004) DNA damage-induced apoptosis. Oncogene 23: 2797-2808. Petti S, Scully C. (2007) Oral cancer knowledge and awareness: primary and secondary effects of an information leaflet. Oral Oncol 3: 408-415. Thorburn A. (2004) Death receptor-induced cell killing. Cellular Signalling 16: 139-144. Tsantoulis PK, Kastrinakis NG, Tourvas AD, Laskaris G, Gorgoulis VG. (2007) Advances in the biology of oral cancer. Oral Onc. 43: 523-534. Vousden KH, Lu X. (2002) Live or let die: the cell's response to p53. Nat Rev Cancer 2: 594-604. Yin XM. (2000) Signal transduction mediated by Bid, a pro-death Bcl-2 family proteins, connects the death receptor and mitochondria apoptosis pathways. Cell Research 10: 161-167.

無

當結合附圖閱讀時，將更佳地理解前述發明內容以及本發明的以下詳細描述。出於說明本發明之目的，在圖式中顯示出目前較佳的具體實施例。然而應理解的是，本發明不限於所示的精確安排及手段。

在圖式中：

圖1A-1B顯示人參皂苷M1抑制人類口腔癌細胞的存活力。將人類口腔癌細胞株SAS細胞（圖1A）或OECM-1細胞（圖1B）與人參皂苷M1（5~20 μg/ml）、人參皂苷Rh2（5~20 μg/ml）或載體（0.1% DMSO）一起培育24小時。藉由台盼藍排除法計數活細胞數。資料表示為平均值±SD；n = 3。*，**和***分別表示與載體對照細胞相比在p >0.05，p >0.01和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

圖2顯示人參皂苷M1對正常人類牙齦上皮樣細胞的毒性低於人參皂苷Rh2。將人類正常的人類牙齦上皮樣細胞株SG細胞與人參皂苷M1（5~20 μg/ml）、人參皂苷Rh2（5~20 μg/ml）或載體（0.1% DMSO）一起培育24小時。藉由台盼藍排除法計數活細胞數。資料表示為平均值±SD；n = 3。**和***分別表示與載體對照細胞相比在p >0.01和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

圖3A-3D顯示人參皂苷M1誘導人類口腔癌細胞的凋亡。將人類口腔癌細胞株OECM-1細胞與人參皂苷M1（10-20 μg/ml），50 μM順鉑（cistaplatin，CDDP）或載體（0.1% DMSO）一起培育24小時。（圖3A）藉由使用流式細胞儀的末端去氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記（TUNEL）測定，測定凋亡DNA斷裂。（圖3B）藉由使用流式細胞儀的PI染色，確定細胞週期分佈。（圖3C）藉由使用流式細胞儀的PI/膜聯蛋白V雙染色測定法，測量凋亡程度。（圖3D）藉由使用西方墨點法偵測凋亡蛋白酶原-9（pro-caspase-9）和凋亡蛋白酶原-3的降解，測量凋亡蛋白酶-9（caspase-9）和凋亡蛋白酶-3的活化程度。流式細胞儀和西方墨點法結果代表三種不同的實驗，直方圖顯示這三個實驗定量表示為平均值±SD。**和***分別表示與載體對照細胞相比在p >0.01和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

圖4A-4B顯示人參皂苷M1降低了人類口腔癌細胞的群體形成能力。將人類口腔癌細胞株SAS細胞（圖4A）或OECM-1細胞（圖4B）與人參皂苷M1（5~20 μg/ml）或載體（0.1% DMSO）一起培育10天。將細胞在4%冰冷的多聚甲醛中固定，並用0.1%結晶紫來染色，並對群體計數。資料表示為平均值±SD；n = 4。*和***分別表示與載體對照細胞相比在p >0.05和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

圖5A-5B顯示人參皂苷M1降低了人類口腔癌細胞的遷移能力。將人類口腔癌細胞株SAS細胞（圖5A）或OECM-1細胞（圖5B）在6公分培養皿中培養，直至細胞達到100%聚集形成單層。藉由使用無菌的200 μl移液管尖端刮擦產生透明區域。將細胞與人參皂苷M1（5~10 μg/ml）或（0.1% DMSO）一起培育24小時（SAS細胞）或18小時（OECM-1細胞）。測量遷移距離並與載體對照細胞比較。資料表示為平均值±SD；n = 3。***表示與載體對照細胞相比在p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

圖6A-6C顯示口服投予人參皂苷M1減少小鼠中人類口腔癌的生長。人類口腔癌細胞株SAS細胞腫瘤大小約40~60 mm³ 的異種移植小鼠被每天口服投予人參皂苷M1（30-90 mg/kg）或載體連續5天。（圖6A）藉由測量腫瘤的長度（L）和寬度（W）確定腫瘤體積，並計算為腫瘤體積（mm3）=（LxW² ）/2。（圖6B）在小鼠被犧牲以後測量腫瘤重量。（圖6C）記錄小鼠的體重。資料表示為平均值±SD；n = 6。**和***分別表示與載體對照小鼠相比在p >0.01和p >0.001上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

圖7A-7C顯示皮下（SC）注射人參皂苷M1減少小鼠中人類口腔癌的生長。人類口腔癌細胞株SAS細胞腫瘤大小約40~60 mm³ 的異種移植小鼠被每天SC注射人參皂苷M1（20 mg/kg）或載體連續5天。（圖7A）藉由測量腫瘤的長度（L）和寬度（W）確定腫瘤體積，並計算為腫瘤體積（mm 3）=（LxW² ）/2。（圖7B）在小鼠被犧牲以後測量腫瘤重量。（圖7C）記錄小鼠的體重。資料表示為平均值±SD；n = 6。**表示與載體對照小鼠相比在p >0.01上的顯著差異。（Dunnett多重比較檢驗的單因子變異數分析）。

無

Claims (11)

1. 一種治療有需要的個體的口腔癌之方法，包含向該個體投予有效治療該個體的量的人參皂苷M1。
2. 如請求項1之方法，其中該治療方法係有效抑制口腔癌細胞的生長或轉移。
3. 如請求項2之方法，其中人參皂苷M1係以對口腔癌細胞選擇性毒性的量而投予。
4. 如請求項2之方法，其中該口腔癌細胞為口腔鱗狀細胞癌（OSCC）細胞。
5. 如請求項1之方法，其中該人參皂苷M1係藉由腸胃外或腸內途徑而投予。
6. 一種人參皂苷M1用於製備治療有需要的個體的口腔癌的藥物之用途。
7. 如請求項6之用途，其中該藥物係有效抑制口腔癌細胞的生長或轉移。
8. 如請求項7之用途，其中該藥物係以對口腔癌細胞產生選擇性毒性的量而投予。
9. 如請求項7之用途，其中該口腔癌細胞為口腔鱗狀細胞癌（OSCC）細胞。
10. 如請求項6之用途，其中該藥物係藉由腸胃外或腸內途徑而投予。
11. 一種用於治療口腔癌之醫藥組合物，包含人參皂苷M1及醫藥上可接受的載體。

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