KR20200143668A

KR20200143668A - 구강암을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 진세노사이드 m1의 용도

Info

Publication number: KR20200143668A
Application number: KR1020207020053A
Authority: KR
Inventors: 시우-롱 리; 쿠오-펑 후아; 위-치에 리
Original assignee: 시우-롱 리
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2020-12-24
Also published as: DK3668519T3; WO2019201280A1; ES2889404T3; EP3668519B1; JP7307732B2; US11524021B2; TWI820118B; CN111615393B; US20210023104A1; CN111615393A; EP3668519A1; JP2021517886A; EP3668519A4; TW202002987A

Abstract

본 발명은 구강암을 치료하기 위한 진세노사이드 M1의 새로운 용도에 관한 것이다.

Description

구강암을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 진세노사이드 M1의 용도

본 출원은 2018년 4월 17일자 출원된 미국 가출원 제62/658,732호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에서 참조로 통합된다.

본 발명은 구강암, 특히 구강 편평세포 암종(oral squamous cell carcinoma: OSCC)을 치료하기 위한 진세노사이드 M1의 새로운 용도에 관한 것이다.

대만의 Executive Yuan의 Department of Health의 최근 보고에 따르면, 구강암은 경제적 생산 연령에 있는 상당한 수의 환자에게 영향을 미치고 있으며, 대만에서 평균 연령 58.3세의 대략 2300명의 남성이 매년 구강암으로 사망한다. 구강암은 또한 전세계적으로 일반적인 악성종양이며, 구강암의 발병률은 매년 증가하고 있다(Murugan et al., 2012). 구강암에 대한 일반적인 치료법은 다음 방법 중 하나 이상을 포함한다: 수술, 화학요법 및 방사선요법. 불행하게도, 임상 관리에서의 진보에도 불구하고, 생존율은 불량하다(Petti and Scully, 2007; Tsantoulis et al., 2007). 추가로, 일부 항암 치료는 독성 부작용(예를 들어, 정상의 잇몸 상피모양 세포(gingival epithelioid cell)에 대한 독성 손상)이 있으며, 항암 치료 중인 환자는 일반적으로 낮은 삶의 질 및 심지어 생명 위협 합병증을 겪게된다. 이는 구강암 환자의 예후를 개선하기 위한, 특히, 감소된 부작용을 갖는 새롭고 효과적인 치료법을 발견하고 개발하는 것이 중요하다는 것을 강하게 강조하고 있다.

진세노사이드(ginsenoside), 즉, 인삼의 주요 활성 성분은 다양한 약리 활성, 예를 들어, 항종양, 항피로(antifatique), 항알레르기성 및 항산화 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 진세노사이드는 4개의 고리에 배열된 17개의 탄소 원자를 갖는 고난 스테로이드 핵(gonane steroid nucleus)으로 구성된 기본 구조를 가지고 있다. 진세노사이드는 체내에서 금속화되며, 많은 최근의 연구는 천연 진세노사이드보다 진세노사이드 대사물이 체내에서 용이하게 흡수되고 활성 성분으로서 작용함을 제시하고 있다. 그러한 진세노사이드 대사물 중에, 진세노사이드 M1은 인간 장내 박테리아에 의한 지페노사이드 경로(gypenoside pathway)를 통한 프로토파낙사디올-타입 진세노사이드(protopanaxadiol-type ginsenoside) 중 하나의 대사물로서 공지되어 있다. 지금까지, 구강암의 치료에서 진세노사이드 M1의 효과를 보고한 종래 기술 참고문헌은 없다.

본 발명에서는, 예상치 못하게 진세노사이드 M1이 구강암 세포의 성장, 집락 형성 및 이동을 억제하고, 구강암 동물에서 종양 성장을 감소시키는데 효과적임을 발견하였다. 특히, 진세노사이드 M1은 구강암 세포에 대해서 선택적인 독성을 가져서 정상의 잇몸 상피모양 세포에 덜 독성이면서 구강암을 치료하기에 효과적인 양으로 투여될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 부작용이 덜한 항암제 및/또는 암 전이 억제제로서 진세노사이드 M1을 투여함으로써 대상체에서 구강암을 치료하기 위한 새로운 방법을 제공하고 있다.

특히, 본 발명은 구강암의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기에 효과적인 양의 진세노사이드 M1을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 구강암을 치료하는 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 치료 방법은 구강암 세포의 성장 또는 이동을 억제하기에 효과적이다. 본 발명의 치료 방법은 또한 구강암을 앓고 있는 대상체에서 종양 성장을 감소시키기에 효과적이다.

일부 구체예에서, 본 발명의 치료 방법은 구강암 세포에 선택적으로 독성인 양으로 진세노사이드 M1을 투여함을 포함한다.

일부 구체예에서, 구강암 세포는 구강 편평세포 암종(OSCC)이다.

일부 구체예에서, 진세노사이드 M1은 비경구 또는 장내 경로(parenteral or enteral route)에 의해서 투여된다.

본 발명은 또한 구강암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 구강암을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서 진세노사이드 M1의 용도를 제공한다. 본 발명은 추가로 구강암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 구강암을 치료하는데 사용하기 위한 진세노사이드 M1을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나 이상의 구체예의 상세사항이 이하 설명에서 기재된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점이 몇 가지 구체예에 대한 이하 상세한 설명 및 또한 첨부된 청구범위로부터 자명할 것이다.

본 발명의 상기 요약 뿐만 아니라 이하 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위해서, 현재 바람직한 구체예들을 도면에서 나타낸다. 그러나, 본 발명은 나타낸 정확한 배열 및 수단들로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
도면에서,
도 1a 및 도 1b는 진세노사이드 M1이 인간 구강암 세포의 생존력을 억제함을 나타내고 있다. 인간 구강암 세포주 SAS 세포(도 1a) 또는 OECM-1 세포(도 1b)를 진세노사이드 M1(5 ~ 20 μg/ml), 진세노사이드 Rh2(5 ~ 20 μg/ml) 또는 비히클(0.1% DMSO)과 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 트리판 블루 배제 방법(Trypan blue exclusion method)에 의해서 살아있는 세포의 수를 계수하였다. 데이터는 평균 ± SD; n = 3으로 표현되었다. *, ** 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.05, p < 0.01 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차(significant difference)를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험(Dunnett's multiple comparisons test)에 의한 원-웨이 ANOVA(One-way ANOVA)).
도 2는 진세노사이드 M1이 진세노사이드 Rh2보다 정상의 인간 잇몸 상피모양 세포에 대해 덜 독성을 나타냄을 나타내고 있다. 인간 정상 인간 잇몸 상피모양 세포주 SG 세포를 진세노사이드 M1(5 ~ 20 μg/ml), 진세노사이드 Rh2(5 ~ 20 μg/ml) 또는 비히클(0.1% DMSO)과 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 트리판 블루 배제 방법에 의해서 살아있는 세포의 수를 계수하였다. 데이터는 평균 ± SD; n = 3으로 표현되었다. ** 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.01 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).
도 3a 내지 도 3d는 진세노사이드 M1이 인간 구강암 세포에서의 아폽토시스(apoptosis)를 유도함을 나타내고 있다. 인간 구강암 세포주 OECM-1 세포를 진세노사이드 M1(10 ~ 20 μg/ml), 50 μM 시스타플라틴(cistaplatin)(CDDP) 또는 비히클(0.1% DMSO)과 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다. (도 3a) 아폽토시스 DNA 파괴를 유세포 분석(flow cytometry)을 이용하는 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 표지화(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling: TUNEL) 분석에 의해서 분석하였다. (도 3b) 세포 주기 분포를 유세포 분석을 사용하는 PI 염색에 의해서 측정하였다. (도 3c) 아폽토시스 수준을 유세포 분석을 사용한 PI/Annexin V 이중 염색 분석법에 의해서 측정하였다. (도 3d) 카스파제-9(caspase-9) 및 카스파제-3의 활성화 수준을 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 사용한 프로-카스파제-9 및 프로-카스파제-3의 분해를 검출함으로써 측정하였다. 유세포 분석 및 웨스턴 블롯팅 결과는 세 가지의 상이한 실험을 대표하며, 막대 그래프는 이들 세 가지 실험에 대한 평균 ± SD로서 표현된 정량화를 나타낸다. ** 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.01 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).
도 4a 및 도 4b는 진세노사이드 M1이 인간 구강암 세포의 집락 형성 능력을 감소시킴을 나타내고 있다. 인간 구강암 세포주 SAS 세포(도 4a) 또는 OECM-1 세포 (도 4b)를 진세노사이드 M1(5 ~ 20 μg/ml) 또는 비히클(0.1% DMSO)와 함께 10일 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4% 빙냉 파라포름알데하이드에 고정시키고, 0.1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색시키고, 집락을 계수하였다. 데이터는 평균 ± SD; n = 4로 표현되었다. * 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.05 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).
도 5a 및 도 5b는 진세노사이드 M1가 인간 구강암 세포의 이동 능력을 감소시킴을 나타내고 있다. 인간 구강암 세포주 SAS 세포(도 5a) 또는 OECM-1 세포(도 5b)를, 세포가 100% 컨플루언스(confluence)에 도달하여 단층을 형성할 때까지, 6-cm 디쉬에서 배양하였다. 무균의 200-μl 피펫 팁을 사용하여 스크레치함으로써 클리어 존(clear zone)을 생성시켰다. 세포를 진세노사이드 M1(5 ~ 10 μg/ml) 또는 비히클(0.1% DMSO)과 함께 24 시간(SAS 세포) 또는 18 시간(OECM-1 세포) 동안 인큐베이션하였다. 이동 거리를 측정하고 비히클-대조 세포와 비교하였다. 데이터는 평균 ± SD; n = 3으로 표현되었다. ***은 비히클-대조 세포에 비한 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).
도 6a 내지 도 6c는 진세노사이드 M1의 경구 투여가 마우스에서의 인간 구강암 성장을 감소시킴을 나타내고 있다. 종양 크기 약 40 ~ 60 mm³의 인간 구강암 세포주 SAS 세포 이종이식 마우스에게 연속 5일 동안 진세노사이드 M1(30-90 mg/kg) 또는 비히클을 매일 경구 투여하였다. (도 6a) 종양 부피를 종양의 길이(L) 및 폭(W)의 측정에 의해서 측정하고, 종양 부피(mm³) = (LxW²)/2로서 계산하였다. (도 6b) 마우스를 희생시킨 후에 종양 중량을 측정하였다. (도 6c) 마우스의 체중을 기록하였다. 데이터를 평균 ± SD; n = 6으로서 표현하였다. ** 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.01 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).
도 7a 내지 도 7c는 진세노사이드 M1의 피하(SC) 주입이 마우스에서의 인간 구강암 성장을 감소시킴을 나타내고 있다. 종양 크기 약 40 ~ 60 mm³의 인간 구강암 세포주 SAS 세포 이종이식 마우스에게 연속 5일 동안 진세노사이드 M1(20 mg/kg) 또는 비히클을 매일 SC 주입하였다. (도 7a) 종양 부피를 종양의 길이(L) 및 폭(W)의 측정에 의해서 측정하고, 종양 부피(mm³) = (LxW²)/2로서 계산하였다. (도 7b) 마우스를 희생시킨 후에 종양 중량을 측정하였다. (도 7c) 마우스의 체중을 기록하였다. 데이터를 평균 ± SD; n = 6으로서 표현하였다. **은 비히클-대조 세포에 비한 p < 0.01의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서의 전문가에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 다음 용어는 달리 특정되지 않는 한 그들에 대해서 주어진 의미를 갖는다.

단수의 표현은 본원에서 물품의 문법적 대상 중 하나 또는 그 초과(즉, 적어도 하나)를 나타내는 것으로 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.

용어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 일반적으로는 하나 이상의 특징, 성분 또는 구성요소의 존재를 허용함을 의미하는 포함한다/포함하는의 의미로 사용된다. 용어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 용어 "로 이루어진다" 또는 "로 이루어진"을 포괄한다.

아폽토시스는 항암 약물-매개된 세포 치사의 중요한 기전 중 하나이다. 그것은 두 가지 주요 경로, 즉, 미토콘드리아 (내인성) 경로 및 사멸 수용체 (외인성) 경로에 의해서 유도된다. 미토콘드리아 경로는 미토콘드리아로부터 시토졸(cytosol)로의 프로아폽토틱 인자(proapoptotic factor), 예컨대, 시토크롬 c 및 아폽토시스 유발인자의 방출에 의해서 활성화된다. 미토콘드리아 외막 투과성은 시토크롬 c 방출 및 카스파제 활성화의 중심 조절자(central regulator)인 Bcl-2 패밀리 단백질에 의해서 조절된다(Martinou and Youle, 2011). 미토콘드리아로부터 방출된 후에, 시토크롬 c는 dATP와 카스파제-9 및 카스파제-3의 활성화를 초래하는 아폽토틱 프로테아제-활성화 인자-1에 결합할 수 있다. 활성화된 카스파제-3은 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라제(poly(ADP-ribose) polymerase: PARP), DNA 복구 효소를 포함한 다양한 기질을 분해하여, 불가피한 세포 사멸을 유도한다(Green and Reed, 1998). 사멸 수용체 경로는 Fas 및 카스파제-8 활성화를 촉발시키는 종양-괴사 인자 수용체 패밀리의 다른 구성원과 연루된다(Thorburn, 2004). 카스파제-8은 카스파제-3을 직접적으로 활성화시키고 Bid를 분해하며, 이는 이어서 미토콘드리아 경로를 촉발시킨다(Yin, 2000). 반응성 산소 종(Reactive oxygen species: ROS) 생성은 일반적으로는 항암 약물 치료에 주어진 세포에서의 아폽토시스 과정 동안에 관찰되었다(Meshkini and Yazdanparast, 2012). 증가된 ROS 수준은 DNA 손상을 유도할 수 있고, 이들 손상된 세포는 후속하여 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 진행하여 DNA 복구를 촉진하거나 아폽토시스를 유도하여 과도하게 손상된 세포를 제거한다(Norbury and Zhivotovsky, 2004). DNA 손상은 사이클린-의존성 키나아제(cyclin-dependent kinase: Cdk))의 억제제인 p21WAF1/CIP1의 발현을 직접적으로 자극함으로써 G1/S 및 G2/M 전이 둘 모두를 억제함을 통해서 p53-의존성 아폽토시스를 활성화시킬 수 있다. DNA 손상은 또한 단백질 키나아제 ATM 및 ATR을 활성화시키고, 이들은 후속적으로 단백질 키나아제 Chk1 및 Chk2의 활성화를 촉발시키고, 이들은 이어서 Cdc2를 정상적으로 활성화시키는 포스파타제인 Cdc25을 불활성화시킴으로써 Cdc2를 억제시킨다(Canton and Scott, 2010).

본 발명에서, 놀랍게도, 진세노사이드 M1이 구강암 세포의 성장 및 이동을 억제할 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명에서 또한 진세노사이드 M1이 구강암을 앓고 있는 동물 모델에서 종양 성장을 감소시키는데 효과적임이 임증되었다. 특히, 진세노사이드 M1은 구강암 세포의 아폽토시스를 유도하고 이동 활성을 감소시키면서 생존력 및 집락 형성을 억제하는데 효과적이다. 이들 결과는 진세노사이드 M1이 구강암을 예방하고 완화시킬 수 있음을 나타낸다. 더욱 특히, 진세노사이드 M1은 구강암 세포에 대한 선택적 독성을 지녀서, 그것이 정상 세포, 예를 들어, 정상의 잇몸 상피모양 세포에 덜 독성이면서 구강암 세포를 치사시키는데 효과적인 양으로 투여될 수 있게 한다.

따라서, 본 발명은 구강암의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기에 효과적인 양의 진세노사이드 M1을 대상체에 투여함을 포함하여, 대상체에서 구강암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 구강암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 구강암을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서의 진세노사이드 M1의 용도를 제공한다. 본 발명은 추가로 구강암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 구강암을 치료하는데 사용하기 위한 진세노사이드 M1을 포함하는 조성물을 제공한다.

일부 구체예에서, 치료 방법은 구강암 세포의 성장을 억제하기에 효과적이다. 특히, 치료 방법은 구강암 세포의 생존력 및 집락 형성을 억제하고/거나 아폽토시스를 유도하는데 효과적이다.

일부 구체예에서, 치료 방법은 구강암 세포의 이동을 억제하는데 효과적이다.

진세노사이드 M1, 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올은 본 기술분야에서 공지된 사포닌 대사물 중 하나이다. 진세노사이드 M1의 화학적 구조는 다음과 같다:

진세노사이드 M1은 인간 장내 박테리아에 의한 지페노사이드 경로를 통한 프로토파낙사디올-타입 진세노사이드의 한 대사물로서 공지되어 있다. 진세노사이드 M1은 섭취 후에 혈액 또는 요(urine)에서 발견될 수 있다. 진세노사이드 M1은 본 기술분야에서 공지된 방법, 예컨대, 대만 특허출원 제094116005호(I280982) 및 미국특허 제7,932,057호에 의한 균류 발효를 통해서 인삼 식물(ginseng plant)로부터 제조될 수 있으며, 상기 특허출원 또는 특허의 전체 내용은 본원에서 참조로 통합된다. 특정의 구체예에서, 진세노사이드 M1을 제조하기 위한 인삼 식물은 두릅나무과(Araliaceae family), 파낙스속(Panax genus), 예를 들어, 파낙스 진셍(P. ginseng) 및 파낙스 슈도 진셍(P. pseudo-ginseng)(상치(Sanqi)로도 일컬어짐)을 포함한다. 일반적으로는, 진세노사이드 M1의 제조 방법은 (a) 인삼 식물 재료(예, 잎 또는 줄기)의 분말을 제공하는 단계; (b) 인삼 식물 재료를 발효시키기 위한 균류를 제공하는 단계; (c) 발효 생성물을 추출하고 수거하는 단계; 및 (d) 발효 생성물로부터 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올을 분리하는 단계를 포함하고, 여기에서, 발효 온도는 20 내지 50℃의 범위이고, 발효 습도는 70 내지 100%의 범위이고, pH 값은 4.0 내지 6.0의 범위이고, 발효 기간은 5 내지 15일의 범위이다.

진세노사이드 M1은 본 발명에서 "분리된" 또는 "정제된" 것으로 기재되며, 완전히 분리되거나 정제되지는 않은 것으로 이해되어야 하지만, 상대적으로 분리되고 정제된 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 정제된 진세노사이드 M1는 이의 자연적으로 존재하는 형태에 비해서 더 정제된 것을 나타낸다. 일 구체예에서, 정제된 진세노사이드 M1을 포함하는 제제(preparation)는 전체 제제의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 또는 100% (w/w)의 양으로 진세노사이드 M1을 포함할 수 있다. 특정의 수치가 본원에서 비율 또는 투여량을 나타내기 위해서 사용되는 때에, 그 수치는 그 수치의 10% 내외의 범위, 또는 더욱 특히, 5% 내외의 범위 내의 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용된 용어 "개체" 또는 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물, 예컨대, 반려 동물(예컨대, 개, 및 고양이 등), 농장 동물(예컨대, 소, 양, 돼지, 및 말 등), 또는 실험실 동물(예컨대, 래트, 마우스, 및 기니아 피그 등)을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "치료하는"은 장애에 걸리거나, 그러한 장애의 증상 또는 병태에 있거나, 그러한 장애의 진행이 있거나, 그러한 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에, 그러한 장애, 또는 그러한 장애의 증상 또는 병태, 또는 그러한 장애에 의해서 유도된 불능, 또는 그러한 장애의 개시 또는 진행을 치유하거나, 치료하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경하거나, 처리하거나, 개선시키거나, 향상시키거나, 그에 영향을 주기 위한 하나 이상의 활성 작용제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 "부작용"은 항암 치료에 의해서 유도된 부작용을 나타낸다. 특히, 구강암 치료의 경우에, 생성되는 부작용은, 예를 들어, 정상의 잇몸 상피모양 세포에 대한 독성 손상을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 치료되는 대상체에 치료 효과를 부여하기 위한 활성 성분의 양을 나타낸다. 예를 들어, 암을 치료하기 위한 성분의 유효량은 암 세포의 성장 또는 이동을 억제할 수 있는 그러한 성분의 양이다. 특히, 그러한 양은, 그러한 성분에 의한 치료가 없는 상태에서의 표적 암 세포의 수와 비교하여, 표적 암 세포의 수를 적어도 10%, 예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%까지 감소시키는데 효과적이다. 바람직하게는, 그러한 양은 표적 암 세포에 선택적으로 독성이다. 일부 구체예에서, 성분은 정상 세포에 대해서 보다 표적 암 세포에 대해서 더 독성을 선택적으로 제공하는 양으로 투여된다. 예를 들어, 특정의 예에서, 성분은, 정상 세포에 대한 독성을 덜 유발시키면서, 예를 들어, 성분에 의한 치료가 없는 상태에서의 정상 세포의 수와 비교할 때, 50% 미만(예, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 그 미만)으로 정상 세포의 수를 감소시키면서, 성분에 의한 치료가 없는 상태에서의 표적 암 세포의 수와 비교할 때, 50% 초과(e.g, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%)까지 표적 암 세포의 수를 감소시키는데 효과적인 양으로 투여될 수 있다.

치료 유효량은 다양한 이유, 예컨대, 투여 경로 및 빈도, 상기 약제가 투여되는 개체의 체중 및 종, 및 투여 목적에 따라서 변화될 수 있다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는 각각의 경우에, 본원의 개시, 확립된 방법, 및 그들 자신의 경험을 기반으로 하여 투여량을 결정할 수 있다. 예를 들어, 특정의 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 진세노사이드 M1의 경구 투여량은 일일 10 내지 1,000 mg/kg이다. 일부 예에서, 본 발명에서 사용되는 진세노사이드 M1의 경구 투여량은 일일 100 내지 300 mg/kg, 일일 50 내지 150 mg/kg, 일일 25 내지 100 mg/kg, 일일 10 내지 50 mg/kg, 또는 일일 5 내지 30 mg/kg이다. 또한, 본 발명의 일부 구체예에서, 진세노사이드 M1은 특정의 기간 동안 주기적으로, 예를 들어, 적어도 15일, 1개월 또는 2 개월 또는 그 초과 동안 매일 투여된다.

본 발명에 따르면, 진세노사이드 M1은 구강암을 치료하기 위한 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 치료 유효량의 활성 성분이 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 전달 및 흡수를 위한 적절한 형태의 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 투여 방식에 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 100 중량%의 활성 성분을 포함하며, 여기에서, 중량 백분율은 전체 조성물의 중량을 기준으로 하여 계산된다.

본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 담체가 조성물 중의 활성 성분과 상용성이고, 바람직하게는 상기 활성 성분을 안정화시킬 수 있고, 치료를 받는 개체에게 안전한 것을 의미한다. 상기 담체는 활성 성분에 대한 희석제, 비히클, 부형제, 또는 매트릭스일 수 있다. 적절한 부형제의 일부 예는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르보오스(sorbose), 만노오스(mannose), 전분, 아라비아검(Arabic gum), 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트검(tragacanth gum), 젤라틴(gelatin), 규산칼슘, 미세결정상 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스, 무균수, 시럽, 및 메틸셀룰로오스를 포함한다. 조성물은 추가로 윤활제, 예컨대, 탈크(talc), 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일(mineral oil); 습윤제(wetting agent); 유화제 및 현탁제; 보존제, 예컨대, 메틸 및 프로필 하이드록시벤조에이트; 감미제(sweetener); 및 향미제(flavoring agent)를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게의 투여 후에 활성 성분의 신속한, 연속 또는 지속된 방출의 효과를 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 조성물의 형태는 정제, 환제, 분말, 로젠지(lozenge), 패킷(packet), 트로키(troche), 엘릭시르(elixer), 현탁액, 로션, 용액, 시럽, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌제, 무균 주사 유체, 및 포장된 분말일 수 있다.

본 발명의 조성물은 어떠한 생리학적으로 허용되는 경로, 예컨대, 경구, 비경구(예컨대, 근육내, 정맥내, 피하, 및 복강내), 경피, 좌제, 및 비내 방법을 통해서 전달될 수 있다. 비경구 투여와 관련하여, 그것은, 바람직하게는, 다른 물질, 예컨대, 용액이 혈액에 등장성이게 하기에 충분한 염 또는 글루코오스를 포함할 수 있는 무균 수용액의 형태로 사용된다. 수용액은 필요에 따라서 적절히 완충(바람직하게는, 3 내지 9의 pH 값으로)될 수 있다. 무균 상태의 적절한 비경구 조성물의 제조는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 잘 공지된 표준 약물학적 기술에 의해서 달성될 수 있고, 과도한 창의적인 노동이 요구되지 않는다.

본 발명에 따르면, 진세노사이드 M1 또는 활성 성분으로서 진세노사이드 M1을 포함하는 조성물이 구강암을 앓고 있거나 구강암의 위험이 있는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 특히, 진세노사이드 M1 또는 활성 성분으로서 진세노사이드 M1을 포함하는 조성물은 구강암을 앓고 있는 개체, 또는 구강암을 앓을 위험에 있는 개체에게, 구강암 세포의 성장 또는 이동을 억제시키기에 효과적인 양으로, 질환의 발병을 방지하거나, 증상을 개선시키거나, 증상의 악화를 지연시키기 위해서 투여될 수 있다. 구강암의 한 가지 특정 예는 구강 편평세포 암종(OSCC)이다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 진세노사이드 M1 또는 진세노사이드 M1을 포함하는 조성물은 구강암 세포에 대해서는 선택적으로 독성이지만 정상 세포에 대해서는 덜 독성인 양으로 투여된다.

본 발명은 제한하고자 하는 것이 아니라 입증 목적으로 제공되는 하기 실시예에 의해서 추가로 예시된다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는, 본 개시를 고려하여, 많은 변화가 개시되어 있는 특정의 구체예에서 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다.

실시예

진세노사이드 M1, 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올을 본 기술분야에서 공지된 방법, 예컨대, 대만 특허출원 제094116005호(I280982) 및 미국특허 제7,932,057호에 기재된 것들에 의해서 제조하였다.

현재의 연구에서, 본 발명의 발명자들은 시험관내 및 생체내 진세노사이드 M1의 효능 및 관련된 기전을 조사하였다. 본 발명의 발명자들은 진세노사이드 M1이 진세노사이드 Rh2와 유사한 효능으로 인간 OSCC SAS 및 OECM-1 세포의 생존력을 투여량-의존적으로 억제하였음을 입증하였다. 특히, 진세노사이드 M1은 진세노사이드 Rh2보다 정상의 인간 잇몸 상피모양 세포주 SD에 덜 독성으로 나타났다. 진세노사이드 M1의 작용 방식에 대한 추가의 이해를 얻기 위해서, 아폽토시스의 품질 보증 마크(hallmark)를 표적으로 하는 4 가지 분석, 즉, (1) 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 표지화(TUNEL) 분석에 의해서 분석된 아폽토시스 DNA 파괴, (2) 핵을 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide: PI)-염색한 후에 유세포 분석에 의해서 분석된 세포 주기, (3) PI/아넥신 V 이중 염색 분석(PI/Annexin V double staining assay), 및 (4) 카스파제 활성화를 수행하였다. 본 발명의 발명자들은 진세노사이드 M1이 OECM-1 및 SAS 세포에서의 아폽토시스 DNA 파괴, G1기 정지, PI/아넥신 V 이중 양성 염색 및 카스파제-3/9 활성화를 유의하게 증가시켰음을 입증하였다. 또한, 본 발명의 발명자들은 진세노사이드 M1이 SAS 및 OECM-1 세포의 집락 형성 및 이동 능력을 용량-의존적으로 억제시켰음을 입증하였다. 더욱이, 진세노사이드 M1의 경구 투여 또는 피하 주입은 SAS 이종이식 마우스에서의 종양 성장을 유의하게 유의하게 감소시켰다. 이들 결과는 진세노사이드 M1이 OSCC에 대한 효능적인 치료제로 개발될 수 있음을 나타낸다.

실시예 1: 진세노사이드 M1이 인간 구강암 세포의 생존력을 억제시킴

2 ml의 배양 배지 중의 6-cm 디쉬(dish) 당 5×10⁵ 인간 구강암 세포 SAS를 플레이팅하고 5% CO₂ 인큐베이터 내 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 진세노사이드 M1(5 ~ 20 μg/ml), 진세노사이드 Rh2(5 ~ 20 μg/ml) 또는 비히클과 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 그룹은 0.1%의 최종 DMSO 농도를 지녔다. 그 후에, 세포 수를 트리판 블루 배제 방법에 의해서 계수하였다. 본 발명의 발명자들은 진세노사이드 M1 및 진세노사이드 Rh2가 인간 구강암 SAS 세포(도 1a) 및 인간 구강암 OECM-1 세포(도 1b)의 세포 수를 용량-의존적으로 억제하였음을 발견하였다. 이들 결과는 진세노사이드 M1과 진세노사이드 Rh2가 인간 구강암 세포의 생존력을 억제하였음을 나타냈지만; 진세노사이드 M1과 진세노사이드 Rh2 사이에 유의차는 없었다. 데이터는 평균 ± SD; n = 3으로 표현되었다. *, ** 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.05, p < 0.01 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).

실시예 2: 진세노사이드 M1이 진세노사이드 Rh2보다 정상의 인간 잇몸 상피모양 세포에 덜 독성을 나타냄

2 ml의 배양 배지 중의 6-cm 디쉬 당 5×10⁵ 정상의 인간 잇몸 상피모양 세포주 SG를 플레이팅하고 5% CO₂ 인큐베이터 내 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 진세노사이드 M1(5 ~ 20 μg/ml), 진세노사이드 Rh2(5 ~ 20 μg/ml) 또는 비히클과 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 그룹은 0.1%의 최종 DMSO 농도를 지녔다. 그 후에, 세포 수를 트리판 블루 배제 방법에 의해서 계수하였다. 본 발명의 발명자들은 진세노사이드 M1이 진세노사이드 Rh2보다 SG 세포에 덜 독성을 나타냈음을 발견하였다(도 2). 20 μg/ml의 진세노사이드 Rh2는 SG 세포를 완전히 치사히켰지만, 20 μg/ml의 진세노사이드 M1은 대조 세포에 비해서 세포 수를 단지 50% 감소시켰다(즉, 적어도 50%의 정상 세포가 보존되었다)(도 2). 데이터는 평균 ± SD; n = 3으로 표현되었다. ** 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.01 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).

실시예 3: 진세노사이드 M1이 인간 구강암 세포에서의 아폽토시스를 유도함

진세노사이드 M1의 작용 방식에 대한 추가의 이해를 얻기 위해서, 아폽토시스의 품질 보증 마크를 표적으로 하는 3 가지 분석, 즉, (1) 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 표지화(TUNEL) 분석에 의해서 분석된 아폽토시스 DNA 파괴, (2) 핵을 프로피디움 아이오다이드(PI)-염색한 후에 유세포 분석에 의해서 분석된 세포 주기세포 주기넥신 V 이중 염색 분석, 및 (4) 카스파제 활성화를 수행하였다. 2 ml의 배양 배지 중의 6-cm 디쉬 당 1×10⁶ 인간 구강암 세포 OECM-1를 플레이팅하고 5% CO₂ 인큐베이터 내 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 진세노사이드 M1(10 ~ 20 μg/ml), 50 μM 시스타플라틴(cistaplatin: CDDP) 또는 비히클과 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 그룹은 0.1%의 최종 DMSO 농도를 지녔다. 그 후에, 세 가지 분석을 수행하였다. 본 발명의 발명자들은 20 μg/ml 진세노사이드 M1 및 50 μM CDDP이 OECM-1 세포에서의 아폽토시스 DNA 파괴를 유의하게 유도하였지만, 10 μg/ml 진세노사이드 M1은 그러하지 않았다(도 3a). 또한, OECM-1 세포에서의 세포 주기 분포에 대한 진세노사이드 M1의 효과를 측정하였고, 본 발명의 발명자들은 G1기에서의 세포가 진세노사이드 M1 및 CDDP에 의한 처리 후에 농도-의존 방식으로 증가하는 동안에, 대조 세포와 비교하여 S 및 G2/M기에서의 세포 백분율이 동시에 감소하여, 진세노사이드 M1 및 CDDP가 G1기에서의 세포 주기 정지를 유도함을 나타내는 것을 발견하였다(도 3b). 서브-G1기에서의 세포가 진세노사이드 M1와 CDDP에 의한 처리 후에 증가하였다(도 3b). 더욱이, 본 발명의 발명자들은 20 μg/ml 진세노사이드 M1 및 50 μM CDDP가 PI/아넥신 V 이중 양성 염색에 의해서 OECM-1 세포의 백분율을 유의하게 증가시켰음을 발견하였다(도 3c). 이들 결과는 진세노사이드 M1이 20 μg/ml의 농도에서 인간 구강암 세포 OECM-1 아폽토시스를 유의하게 유도하였음을 나타냈다. 인간 구강암 SAS 세포에서의 진세노사이드 M1의 아폽토시스 유도 활성은, 진세노사이드 M1이 용량-의존적 방식으로 카스파제-3 및 카스파제-9의 전구체의 감소를 유도하여 카스파제-3 및 카스파제-9가 진세노사이드 M1에 의해서 활성화됨에 따라서, 확인되었다(도 3d). 데이터는 평균 ± SD; n = 3으로 표현되었다. ** 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.01 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).

실시예 4: 진세노사이드 M1이 인간 구강암 세포의 집락 형성 능력을 감소시킴

3 ml의 배양 배지 중의 6-cm 디쉬 당 150 인간 구강암 세포 SAS 또는 OECM-1를 플레이팅하고 5% CO₂ 인큐베이터 내 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 진세노사이드 M1(5 ~ 20 μg/ml) 또는 비히클과 함께 10일 동안 인큐베이션하였다. 세포를 5일째에 동일한 농도의 진세노사이드 M1를 함유하는 새로운 배지에 대해서 변경시켰다. 세포를 37℃에서 15분 동안 4% 빙냉 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 실온에서 10분 동안 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색시켰다. 집락을 계수하였고, 본 발명의 발명자들은 진세노사이드 M1이 SAS 세포(도 4a) 및 OECM-1 세포(도 4b)의 집락 형성 능력을 용량-의존적으로 억제시킴을 발견하였다. 데이터는 평균 ± SD; n = 4로 표현되었다. * 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.05 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).

실시예 5: 진세노사이드 M1이 인간 구강암 세포의 이동 능력을 감소시킴

세포 이동 능력을 상처 치유 분석에 의해서 측정하였다. 2 ml의 배양 배지 중의 6-cm 디쉬 당 5×10⁶ 인간 구강암 SAS 세포 또는 OECM-1 세포를 플레이팅하고, 세포가 100% 컨플루언스에 도달하여 단층을 형성할 때까지, 5% CO₂ 인큐베이터 내 37℃에서 밤새 성장시켰다. 본 발명의 발명자들은 무균 200-μl 피펫 팁(pipette tip)을 사용하여 배양 접시 상에 스크래치된 클리어 존을 생성시켰고, 상처를 위상차 현미경에 의해서 기준선으로서 사진촬영을 하였다. 세포를 진세노사이드 M1(5 ~ 10 μg/ml) 또는 비히클과 함께 24 시간(SAS 세포) 또는 18 시간(OECM-1 세포) 동안 인큐베이션하였다. 본 발명의 발명자들은 5 또는 10 μg/ml의 진세노사이드 M1가 인간 구강암 세포 SAS(도 5a) 및 OECM-1 세포(도 5b)의 이동 능력을 유의하게 억제시킴을 발견하였다. 데이터는 평균 ± SD; n = 3로 표현되었다. ***은 비히클-대조 세포에 비한 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).

실시예 6: 진세노사이드 M1이 마우스에서의 인간 구강암 성장을 감소시킴.

생체내 진세노사이드 M1의 항암 활성을 평가하기 위해서, 인간 구강암 이종 이식편을 사용하였다. 주령 6주 웅성 선천성 무흉선 BALB/c 누드(nu/nu) 마우스를 BioLASCO Taiwan Co., Ltd (Ilan, Taiwan)로부터 구매하였고, 조절된 온도(23 ± 3℃) 및 상대습도(50 ± 5%)하에 방에 가두었다. 실험실 동물의 보호 및 사용에 대한 NIH Guide에 따른 National Ilan University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인(승인 번호: No. 106-13)하에 동물 실험을 수행하였다. 이종 이식 마우스를 누드 마우스의 등에의 2 x 10⁶ 인간 구강암 세포 SAS(75 μl PBS + 75 μl 매트리겔(Matrigel) 중)의 피하(SC) 주입에 의해서 확립시켰다. 종양이 그 크기가 약 40 ~ 60 mm³에 도달한 후에, 마우스를 무작위로 6 그룹(각각 6 마리의 마우스)으로 구분하였다: (1) 경구 비히클 대조군; (2) 경구 30 mg/kg 진세노사이드 M1; (3) 경구 60 mg/kg 진세노사이드 M1; (4) 경구 90 mg/kg 진세노사이드 M1; (5) SC 비히클 대조군; (6) SC 20 mg/kg 진세노사이드 M1. 마우스에게 비히클 또는 진세노사이드 M1을 연속 5일 동안 매일 경구 투여 또는 SC 주입하였다. 진세노사이드 M1 또는 비히클의 마지막 용량의 투여 후에 마우스를 희생시켰다. 종양 부피(tumor volume: TV)를 종양의 길이(L) 및 폭(W)의 측정에 의해서 측정하였다. 일 수 n에서의 TV(TVn)를 TV (mm³) = (LxW²)/2로서 계산하였다. 0일에 대한 일 수 n에서의 상대적인 종양 부피(RTVn)를 다음 식, RTVn=TVn/TV0에 따라서 표현하였다. 본 발명의 발명자들은 90 mg/kg의 진세노사이드 M1의 경구 투여가 비히클 대조군에 대해서 종양 크기를 유의하게 감소시키지만, 30 및 60 mg/kg의 진세노사이드 M1의 경구 투여는 종양 크기(도 6a) 및 종양 중량(도 6b)을 유의하게 감소시키지 못했음을 발견하였다. 진세노사이드 M1의 경구 투여는 마우스의 체중에 유의하게 영향을 주지 않았다(도 6c). 데이터는 평균 ± SD; n = 6로 표현되었다. ** 및 ***은 비히클-대조 세포에 비한 각각 p < 0.01 및 p < 0.001의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).

또한, 20 mg/kg 진세노사이드 M1의 SC 주입은 또한 비히클 대조 그룹에 비해서 종양 크기(도 7a) 및 종양 중량(도 7b)를 유의하게 감소시켰다. 진세노사이드 M1의 SC 주입은 마우스의 체중에 유의하게 영향을 주지 않았다(도 7c). 데이터는 평균 ± SD; n = 6로 표현되었다. **은 비히클-대조 세포에 비한 p < 0.01의 수준에서의 유의차를 나타낸다. (Dunnett의 다중 비교 시험에 의한 원-웨이 ANOVA).

참고문헌

Claims

구강암의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기에 효과적인 양의 진세노사이드 M1(ginsenoside M1)을 대상체에 투여함을 포함하여, 대상체에서 구강암을 치료하는 방법.
청구항 1에 있어서, 치료하는 방법이 구강암 세포의 성장 또는 이동을 억제하기에 효과적인, 방법.
청구항 2에 있어서,
진세노사이드 M1이 구강암 세포에 선택적으로 독성인 양으로 투여되는, 방법.
청구항 2에 있어서,
구강암 세포가 구강 편평세포 암종(oral squamous cell carcinoma: OSCC) 세포인, 방법.
청구항 1에 있어서,
진세노사이드 M1이 비경구 또는 장내 경로(parenteral or enteral route)에 의해서 투여되는, 방법.
구강암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 구강암을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 진세노사이드 M1의 용도.
청구항 6에 있어서,
약제가 구강암 세포의 성장 또는 이동을 억제하기에 효과적인, 용도.
청구항 7에 있어서,
약제가 구강암 세포에 선택적으로 독성인 양으로 투여되는, 용도.
청구항 7에 있어서,
구강암 세포가 구강 편평세포 암종(OSCC) 세포인, 용도.
청구항 6에 있어서,
약제가 비경구 또는 장내 경로에 의해서 투여되는, 용도.
진세노사이드 M1 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 구강암을 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.