TWI661831B - 使用台灣白鳳菜之經水萃取的產物來治療肝細胞癌以及抑制肝細胞癌幹細胞的生長 - Google Patents

Abstract

本發明揭示台灣白鳳菜之一經水萃取的產物可被用來治療肝細胞癌以及抑制肝細胞癌幹細胞的生長。

Description

使用台灣白鳳菜之經水萃取的產物來治療肝細胞癌以及抑制肝細胞癌幹細胞的生長

本發明是有關於使用台灣白鳳菜( Gynura formosanaKitam.)之一經水萃取的產物(water-extracted product)來治療肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)以及抑制肝細胞癌幹細胞(hepatocellular cancer stem cells)的生長。

肝癌(liver cancer)是世界上致死率第二高的癌症，其中約有八成的病患是屬於肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)。肝細胞癌是由肝臟細胞的不正常增生所引起，雖然肝細胞癌的發病機制尚未被完全瞭解，但目前已知的是，肝細胞癌與慢性病毒性肝炎感染(chronic viral hepatitis infection)(例如，慢性B型肝炎與慢性C型肝炎)、酒精濫用所引起的肝硬化(cirrhosis)、非酒精性脂肪肝(non-alcoholic steatohepatitis)以及黃麴毒素(aflatoxin)等因素具有高度的相關性。

目前在臨床上常見用來治療肝細胞癌的化學治療藥物有順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)以及阿黴素(doxorubicin)。然而，這些化學治療藥物對於肝細胞癌的治癒率(cure rate)仍相當有限，主要的原因包括：患者本身的個體差異、抗癌藥物的嚴重副作用(side effect)，以及癌細胞的抗藥性(drug resistance)與轉移能力(metastatic ability)，而這被報導可能與腫瘤中的癌症幹細胞(cancer stem cells, CSCs)有關(Patel P. and Chen E. I. (2012), Front. Endorcrinol. (Lausanne), 3:125)。因此，本領域的相關研究人員嘗試從傳統中藥(traditional Chinese medicines, TCM)中來尋找可供用於治療肝細胞癌的活性組分(active components)。

台灣白鳳菜(拉丁學名： Gynura formosanaKitam.)；中文別名：白紅菜、白擔當、白廣菜、白鳳菊、台灣土三七以及長柄橙黃菊；中文俗名：肝炎草)為菊科(Compositae)三七草屬( Gynura)的多年生草本植物；高30至60 cm，莖直立，基部多少斜升；葉質厚，葉片卵形，橢圓形或倒披針形，頂端鈍或急尖，葉基下延成葉柄，葉緣具粗齒或提琴狀羽裂；頭花少數，具長總梗，小花橙黃色。產區主要分布於全島海濱以及低海拔山區。

台灣白鳳菜的全株植物(whole plant)皆為可利用的部位，在民俗醫學上，台灣白鳳菜具有清熱解毒、涼血止血的效用，可用於治療肝炎、跌打損傷、腫毒、支氣管肺炎、小兒高燒、百日咳、目赤腫痛、風濕關節痛、崩漏、骨折、外傷出血、乳腺癌、瘡傷癤種，以及燒燙傷等。此外，台灣白鳳菜亦被證實具有抗-高血糖(anti-hyperglycemic)、抗-高血壓(anti-hypertensive)、降尿酸(hypouricemic)、鎮痛、抗氧化(anti-oxidant)、抗發炎(anti-inflammatory)以及治療肝損傷等活性。

目前已有許多研究是有關於三七草屬物種( Gynuraspp.)的萃取物在藥學領域上的應用。例如，CN 103222995 B揭示白子菜[ Gynura divaricata(L.) DC.](又被稱為白背三七)在製備護肝藥物或保健食品中的應用。在此件大陸專利案的實施例中，分別使用水和乙醇來對白子菜進行萃取，而製得白子菜的水萃取物與乙醇萃取物。該等萃取物經由實驗而被證實可以顯著地改善四氯化碳-誘發的急性肝損傷(CCl ₄-induced liver injury)。

CN 101278957 A揭示白子菜萃取物在製備抗癌藥物上的用途。依據此件大陸專利公開案的實施例，該白子菜萃取物主要是藉由使用水來對白子菜的全草進行加熱萃取，繼而使用乙醇來進行數次萃取與沉澱處理並予以過濾與濃縮而被製淂。高效能液相層析(high performance liquid chromatography, HPLC)分析的結果顯示，該白子菜萃取物的主要成分為黃酮類(flavonoids)、萜烯(terpene)以及固醇類(sterols)化合物。該白子菜萃取物被拿來投藥給帶有不同類型之癌症(包括肝癌、鼻咽癌、肺癌、食道癌以及乳癌)的患者，而實驗結果顯示，該白子菜萃取物可有效地減少患者血清中的腫瘤標記[包括癌胚胎抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、甲型胎兒蛋白(α-fetoprotein, AFP)、血清鐵蛋白(serum ferritin, FER)以及癌抗原-125 (cancer antigen 125, CA-125)]。

另外，後續有研究使用乙醇來對白子菜進行萃取並使用乙酸乙酯來進行分配分離，接而分離出其中的活性成分，包括屬於黃酮類化合物的槲皮素(quercetin)與堪非黃酮醇衍生物(kaempferol derivatives)以及綠原酸衍生物(caffeoylquinic acid derivatives)(Chen J. et al.(2014), Fitoterapia, 99:1-6；Wan C. et al. (2011), Pharmacogn. Mag., 7(26):101-108)。該等成分已被報導能夠抑制在結腸直腸癌細胞(colorectal cancer cell)內異常活化之典型的Wnt/β-鏈蛋白訊息傳遞路徑(canonical Wnt/β-catenin signaling pathway)，而被認為具有抗癌潛力(Park C. H. et al. (2005), Biochem. Biophys. Res. Commun., 328(1):227-34; Park S. and Choi J. (2010), J. Cell Biochem., 110(6):1376-85; Taira J. et al.(2014), J. Agric. Food Chem., 62(1):167-72)。

在Chen S. C. et al. (2003), J. Chin. Pharm., 55:109-19中，Chen S. C.等人使用甲醇來對經風乾的台灣白鳳菜的地上部進行萃取，繼而在真空下移除甲醇以得到台灣白鳳菜的一甲醇萃取物。接著，將該台灣白鳳菜的甲醇萃取物懸浮於水中，並依序以氯仿(chloroform)和乙酸乙酯(ethyl acetate)來進行分配分離(partitioning)，而分別得到台灣白鳳菜的一氯仿萃取物、一乙酸乙酯萃取物以及一水萃取物。該等萃取物被拿來處理人類前骨髓性白血病細胞(human promyelocytic leukemia cells) HL-60細胞，而實驗結果發現，該氯仿萃取物與該乙酸乙酯萃取物具有抑制HL-60細胞增生的活性，而該甲醇萃取物與該水萃取物未被偵測到有此活性。Chen S. C.等人進一步藉由使用矽膠管柱(silica gel column)的層析法自該氯仿萃取物中分離出數種能夠抑制HL-60細胞增生的活性成分。

雖然已存在有上述文獻報導與專利案，申請人仍積極致力自天然植物中開發出可以有效地治療肝細胞癌的藥物。申請人嘗試以水對台灣白鳳菜的地上部進行萃取而得到一台灣白鳳菜之經水萃取的產物，它經由活體外與活體內試驗而被證實具有優異的抗肝細胞癌活性，並且與臨床上所使用的化療藥物具有協同效用(synergic effect)。因此，依據本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物被預期可供用於治療肝細胞癌。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種台灣白鳳菜之經水萃取的產物供應用於製備一用來治療肝細胞癌之醫藥品的用途。

在第二個方面，本發明提供一種用於治療在一個體中之肝細胞癌的方法，其包括對該個體投藥以台灣白鳳菜之一經水萃取的產物。

在第三個方面，本發明提供一種台灣白鳳菜之經水萃取的產物供應用於製備一用來抑制肝細胞癌幹細胞的生長之醫藥品的用途。

在第四個方面，本發明提供一種用於抑制在一個體中之肝細胞癌幹細胞的生長的方法，其包括對該個體投藥以台灣白鳳菜之一經水萃取的產物。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例後，將變得明顯。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

在開發可用於治療肝細胞癌的藥物上，申請人意外地發現到：台灣白鳳菜之經水萃取的產物具有這方面的產業應用潛力。於是，本發明揭示台灣白鳳菜之一經水萃取的產物供應用於製備一用來治療肝細胞癌之醫藥品的用途。

依據本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物藉由活體外試驗( in vitrotest)而被證實對於肝細胞癌細胞具有細胞毒性(cytotoxicity)，並且可以有效地抑制肝細胞癌細胞以及肝細胞癌幹細胞(hepatocellular cancer stem cell)的生長。此外，該台灣白鳳菜之經水萃取的產物進一步藉由動物試驗而被證實可以有效地在活體內抑制肝細胞癌腫瘤的生長。因此，本發明提供一種用於治療肝細胞癌之醫藥品，其包含有台灣白鳳菜之一經水萃取的產物。

如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性的進展(progression of severity)。

依據本發明，水萃取的方法可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。在此方面，可以參照，例如，US 2014/0356301 A1、嘉南藥理大學保健營養系的蔡孟憲所著碩士論文[名稱：“白鳳菜和荔枝核水萃物對於高脂及高糖飲食誘導小鼠胰島素阻抗之改善作用(The Water Extracts of Gynura Formosanaand Litchi ChinensisSeed Reduced High-Fat and High-Sucrose Diet Induced Insulin Resistance in Mice)”]以及嘉南藥理大學保健營養系的張建國所著碩士論文[名稱：白鳳菜煎煮萃出液之降尿酸試驗(Hypouricemic Effect of Gynura FormosanaExtract Using Long Time Water Boiling)”]。

可瞭解到的是，有關該台灣白鳳菜之經水萃取的產物的萃取方法的操作條件會進一步隨著所使用的台灣白鳳菜的處理方式以及台灣白鳳菜的用量比例等因素而被變動，以便達致最佳的萃取效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。

較佳地，該台灣白鳳菜之經水萃取的產物是以台灣白鳳菜的莖與葉當中的至少一者來製備。在本發明的一個較佳具體例中，該台灣白鳳菜之經水萃取的產物是以台灣白鳳菜的莖與葉(亦即地上部)來製備。

依據本發明，該水萃取是在一範圍落在20℃至28℃內的溫度下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該水萃取是在25℃下被進行。

依據本發明，該台灣白鳳菜之經水萃取的產物實質上不含有黃酮類(flavonoids)化合物。

依據本發明，該台灣白鳳菜之經水萃取的產物實質上不含有槲皮素(quercetin)、堪非黃酮醇(kaempferol)以及綠原酸(caffeoylquinic acid)。

如本文中所用的，術語“實質上不含有(substantially free of)”意指一被具體指明的成分缺少有意義的含量。較佳地，該成分的含量(例如，0.05 mg/g以下)對於該台灣白鳳菜之經水萃取的產物的性質不具有可測量的影響(measurable effect)。

依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道(parenteral)或口服(oral)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。較佳地，該醫藥品被製造成適於以靜脈內注射而被投藥的劑型。

在本發明的另一個較佳具體例中，該醫藥品被製成適於口服投藥的劑型。

依據本發明，該醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。

依據本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物已藉由活體外試驗與活體內試驗而被證實與臨床上所使用的化療藥物具有協同效用。因此，依據本發明，該醫藥品可與一化學治療藥物一起合併使用。較佳地，該化學治療藥物是選自於由下列所構成的群組：順鉑(cisplatin)、阿黴素(doxorubicin)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)、卡培他濱(capecitabine)、依託泊苷(etoposide)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、諾拉曲特(nolatrexed)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該化學治療藥物是順鉑。

本發明亦提供一種用以治療在一個體中之肝細胞癌的方法，其包括對該個體投藥以台灣白鳳菜之一經水萃取的產物。

基於該台灣白鳳菜之經水萃取的產物在抑制肝細胞癌幹細胞的生長上的效用，本發明亦預期該台灣白鳳菜之經水萃取的產物供應用於製備一用來抑制肝細胞癌幹細胞的生長之醫藥品的用途。

於是，本發明亦提供一種用於抑制肝細胞癌幹細胞的生長之醫藥品，其包含有台灣白鳳菜之一經水萃取的產物。

依據本發明，該醫藥品的投藥劑型、投藥途徑以及可供使用之藥學上可接受的載劑是如上面所述者。

本發明亦提供一種用於抑制在一個體中之肝細胞癌幹細胞的生長的方法，其包括對該個體投藥以台灣白鳳菜之一經水萃取的產物。

依據本發明，該台灣白鳳菜之經水萃取的產物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。而有關投藥劑量與投藥次數的選擇是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1. 細胞株的來源與培養：

在下面的實施例中所使用的人類肝細胞癌細胞株(human hepatocarcinoma cell line) Huh7是由高雄醫學大學的陳宜民教授所提供；小鼠肝臟細胞株(alpha mouse liver cell line) AML12 (ATCC ^®CRL-2254 ^™)、大鼠肝臟細胞株(rat liver cell line) Clone 9 (ATCC ^®CRL-1439 ^™)是購自於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)；以及人類皮膚角質細胞株(human skin keratinocyte cell line) HaCaT是購自於德國細胞株服務有限公司(Cell Line Service GmbH, CLS)。

這4種細胞分別依照下面表1所示的培養基被培養於培養皿(petri dish)中，並在設定為37℃、5% CO ₂的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.4)來清洗細胞，接著加入胰蛋白□-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以定量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養箱中進行培養。 表1. 用於培養4種細胞株的培養基 細胞 培養基的種類與配方 Huh7 杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、2 mM L-麩醯胺酸(L-glutamine)、0.1 mM非必需胺基酸(non-essential amino acids)、100 U/mL盤尼西林(penicillin)以及0.1 mg/mL鏈黴素(streptomycin)](Thermo Fisher Scientific) AML12 DMEM/F12培養基(DMEM/F12 medium)[1:1 (v/v)][添加有10% FBS、0.005 mg/mL胰島素(insulin)、0.005 mg/mL運鐵蛋白(transferrin)、5 ng/mL硒(selenium)以及40 ng/mL地塞米松(dexamethasone)] Clone 9 DMEM培養基(添加有10% FBS、100 U/mL盤尼西林以及0.1 mg/mL鏈黴素) HaCaT DMEM高葡萄糖培養基(DMEM high glucose medium)(HyClone™)(添加有10% FBS、100 U/mL盤尼西林以及0.1 mg/mL鏈黴素) 2. 實驗動物：

在本實施例中所使用的雌性BALB/cAnN.Cg-Foxn1 ^nu/CrlNarl裸鼠(nude mouse)(6週大，平均體重約15 g)是購自於財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心。所有的實驗動物被飼養於一個室溫維持在20-26℃以及相對濕度維持在50±10%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的處理以及一切實驗程序均符合國際實驗動物管理標準，亦經過高雄醫學大學實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of Kaohsiung Medical University)審核並且認可通過。 一般實驗方法： 1. 統計學分析(Statistical analysis)：

在下面的實施例中，各組的實驗被重複至少3次，所得到的實驗數據是使用GraphPad Prism 5.01軟體(La Jolla, CA, USA)來進行統計分析，並以“平均值(mean)±標準偏差(standard deviation, S.D.)”來表示。各組實驗數據之間的差異是藉由史徒登氏t -試驗(Student’s t-test)以及單因子變異數分析(one-way analysis of variance, ANOVA)合併塔基事後檢定(Tukey’s post hoc test)來進行評估。若所得到的統計比對結果是 p＜0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 製備台灣白鳳菜之經水萃取的產物 (preparation of water extract of Gynura formosanaKitam.)

在下面實施例中所使用的台灣白鳳菜( Gynura formosanaKitam.)是在2015年7月於新北市新莊區所採集而得，並委託高雄醫學大學藥學院藥學系的顏銘宏教授以及張訓碩教授進行分類學鑑定(taxonomically identified)。

首先，將所採集的台灣白鳳菜的地上部(aerial parts of Gynura formosanaKitam.)(包括莖與葉)(約600 g)以清水予以洗滌，繼而以一約為1:1的比例將之與蒸餾水(distilled water)混合，接著將所得到的混合物置於一均質機中進行均質處理。之後，於25℃下使用一超音波處理器並以一為40 KHz的頻率來對所得到的均質物(homogenate)進行震盪處理歷時30分鐘，接著以一孔徑為0.45 μm的濾紙予以過濾而得到一濾液。接著，將該濾液於 -50℃下進行冷凍乾燥處理歷時24至48小時，而得到一呈乾燥粉末狀的台灣白鳳菜之經水萃取的產物(約22g)。

之後，將適量之所得到的台灣白鳳菜之經水萃取的產物溶於純水中而配製成一具有一濃度為1 mg/mL的待測溶液樣品，以供用於下面的成分分析。另外，將適量之台灣白鳳菜之經水萃取的產物溶於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline, PBS)中，並以一孔徑為0.22 μm的濾紙予以過濾，而生成一濃度為10 mg/mL的儲備溶液，以供用於下面的藥理實驗。 實施例 2. 台灣白鳳菜之經水萃取的產物之成分分析 實驗方法： A、 高效能液相層析 (high performance liquid chromatography, HPLC) ：

為瞭解本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物的主要成份分佈，依據上面實施例1所得到的台灣白鳳菜之經水萃取的產物被拿來進行高效能液相層析分析。

有關HPLC分析是依據Liu W. et al. (2010), Int. J. Mol. Sci., 11:4750-4763當中所述的方法來進行。本實驗所使用的HPLC分析儀器如下：Shimadzu LC-20AT系列液相層析系統(Shimadzu LC-20AT Series liquid chromatography system)(Shimadzu)以及光電二極體陣列偵測器(photodiode Array Detector, PDA)(Shimadzu，型號SPD-M20A VP)。HPLC的各項操作參數與條件被顯示於下面的表2中。 表2. HPLC的操作參數與條件 操作參數 條件 分離管柱 Phenomenex Luna® 5 µm C18(2) 100Ǻ管柱(Phenomenex, Cat. No. P/NO00G-4252-E0) 管柱規格 250 mm × 4.6 mm 管柱溫度 25℃ 偵測波長 210 nm 移動相 0.1%醋酸(acetic acid)/乙腈(acetonitrile)，90：10 (v/v) 移動相的梯度洗提 (gradient elution) 在第0至30分鐘內，乙腈的濃度由10%變至30%；在第30至45分鐘時，乙腈的濃度由30%變至60%。 流速(mL/分鐘) 0.8

為供比較，槲皮素(quercetin)、堪非黃酮醇(kaempferol)以及綠原酸(caffeoylquinic acid)(購自於Sigma-Aldrich)被拿來進行相同的分析。 B、 液相層析 - 電噴灑游離質譜分析 (liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, LC-ESI-MS) ：

為瞭解本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物的主要成份之分子量，申請人進一步將依據上面實施例1所得到的台灣白鳳菜之經水萃取的產物拿來進行下面的液相層析-電噴灑游離質譜分析(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, LC-ESI-MS)。

在進行LC-ESI-MS分析之前，台灣白鳳菜之經水萃取的產物是藉由使用一Discovery ^®DSC-18固相萃取管柱(Discovery ^®DSC-18 SPE Tube)(購自於Sigma)來進行固相萃取(Solid phase extraction)，並且以10-100%的甲醇進行梯度洗提，所洗提出的5個分離部分(fraction)被分別拿來進行下面的LC-ESI-MS分析。

本實驗所使用的LC-ESI-MS分析儀器如下：Waters 2695系列液相層析系統(Waters 2695 Series liquid chromatography system)(Waters, USA)，以及Waters Micromass ^®ZQ ^™質譜儀(Waters Micromass ^®ZQ ^™mass spectrometer)。其中，關於LC-ESI-MS的各項操作參數與條件被顯示於下面的表3中。 表3. LC-ESI-MS的操作參數與條件 操作參數 條件 分離管柱 Zorbax® Eclipse XDB-C18管柱(Agilent, Cat. No. 930990-902) 管柱規格 150 mm × 2.1 mm 管柱溫度 25℃ 移動相 0.02%甲酸(formic acid)/含有0.02%甲酸的甲醇溶液，95:5 (v/v) 移動相的梯度洗提 (gradient elution) 在第0至2.5分鐘時，甲醇溶液的濃度為5%；在第2.5至50分鐘時，甲醇溶液的濃度由5%變至100%；在第50至70分鐘時，甲醇溶液的濃度維持在100%。 流速(mL/分鐘) 0.2 結果： A、 高效能液相層析分析：

圖1顯示將依據本發明的實施例1所製得的台灣白鳳菜之經水萃取的產物拿來進行HPLC所得到的洗提圖形，其中，在第0至10分鐘的滯留期間出現有3個主要的洗提波峰，分別被標示為a1至a3，而波峰a1至a3的最大吸收波長(λ _max)分別為205 nm、202 nm以及199 nm。另外，在第10至60分鐘的滯留期間內則無出現任何的洗提波峰(數據未顯示)。

此外，從槲皮素(quercetin)、堪非黃酮醇(kaempferol)以及綠原酸(caffeoylquinic acid)的洗提圖形可見，該等化合物的滯留時間分別為第42.3分鐘、第46.5分鐘以及第31.7分鐘(數據未顯示)。

從上述實驗結果可見，依據本發明所得到的台灣白鳳菜之經水萃取的產物的成分皆於10分鐘內被洗提出，應為高極性之化合物，並且不含有極性較低的綠原酸、槲皮素、堪非黃酮醇以及其他黃酮類化合物。 B、 液相層析 - 電噴灑游離質譜分析：

LC-ESI-MS的結果顯示，依據本發明所得到的台灣白鳳菜之經水萃取的產物中至少含有7種不同的化合物，該等化合物分別具有222、314、352、390、418、420以及704的分子量(molecular weight, MW)。申請人進一步將上述分子量與Reaxys資料庫中自三七草屬( Gynura)物種中分離所得的化合物進行比對，結果顯示分子量為352的化合物可能為前列環素(epoprostenol)。 實施例 3. 台灣白鳳菜之經水萃取的產物之細胞可活性分析 (cell viability assay)

在本實施例中，依據上面實施例1所得到的台灣白鳳菜之經水萃取的產物被拿來進行下面的細胞可活性分析，俾以評估該台灣白鳳菜之經水萃取的產物在活體外對於正常肝臟細胞與肝細胞癌細胞的細胞毒性(cytotoxicity)。 實驗方法：

首先，將依照上面“一般實驗材料”的第1項「細胞株的來源與培養」來進行繼代培養的AML12細胞、Clone 9細胞以及Huh7細胞分別分成5組，其中包括1個對照組與4個實驗組(亦即實驗組1至4)。將各組細胞分別以一為3×10 ³細胞/井的數量培養於含有適量細胞培養基(有關各個細胞所使用的培養基是如上面表1中所述者)的96-井培養盤中，並將適量之依據上面實施例1所製得的台灣白鳳菜之經水萃取的產物的儲備溶液添加至各個實驗組中，而使得實驗組1至4分別具有一最終濃度為125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL以及1000 μg/mL的台灣白鳳菜之經水萃取的產物。至於對照組的細胞則不作任何處理。

各組細胞培養物在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時72小時後，加入1/10體積的alamarBlue ^®(Thermo Fisher Scientific)，並予以培養歷時4小時。之後，於570 nm的波長下以分光光度計來讀取各井的吸光值(OD ₅₇₀)。

細胞可活性百分比(%)是藉由將所測得的吸光值(OD ₅₇₀)代入下列公式(1)而被計算出： 公式 (1) ： A ＝ (B/C) × 100其中：A＝細胞可活性百分比(%) B＝各組所測得的OD ₅₇₀吸光值 C＝對照組所測得的OD ₅₇₀吸光值

另外，抑制50%人類肝細胞癌細胞株Huh7生長的濃度(50% inhibition concentration, IC ₅₀)是藉由計算本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物會降低細胞可活性達50% (與對照組的細胞相較之下)的濃度而從曲線的線性部份被測定出。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果分別被顯示於圖2、圖3以及圖4中。 結果：

圖2與圖3分別顯示小鼠肝臟細胞株AML12以及大鼠肝臟細胞株Clone 9在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所測得的細胞可活性百分比。從圖2與圖3可見，無論是小鼠肝臟細胞株AML12或大鼠肝臟細胞株Clone 9，實驗組1至4的細胞可活性百分比相較於對照組所具者皆沒有顯著的差異性。

圖4顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7在以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所測得的細胞可活性百分比。從圖4可見，與對照組相較之下，實驗組1至4的細胞可活性百分比皆有顯著的降低，同時會隨著台灣白鳳菜之經水萃取的產物之濃度的增加而更趨於明顯。特別地，本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物對於人類肝細胞癌細胞株Huh7的50%抑制濃度(IC ₅₀)為573 μg/mL。

這個實驗結果顯示：本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物不會對於正常肝臟細胞造成傷害，而對於肝細胞癌細胞則具有顯著的細胞毒性。 實施例 4. 台灣白鳳菜之經水萃取的產物在抑制肝細胞癌細胞生長上的效用評估

在本實施例中，依據上面實施例1所得到的台灣白鳳菜之經水萃取的產物被拿來進行下面的群落形成分析(colony forming assay)，俾以評估該台灣白鳳菜之經水萃取的產物在活體外抑制肝細胞癌細胞生長上的效用。 實驗方法：

首先，將依照上面“一般實驗材料”的第1項「細胞株的來源與培養」來進行繼代培養的Huh7細胞分成5組，其中包括1個對照組與4個實驗組(亦即實驗組1至4)。將各組細胞分別以一為1×10 ³細胞/井的數量培養於含有適量細胞培養基(有關各組細胞所使用的培養基是如上面表1中所述者)的6-井培養盤中，並將適量之依據上面實施例1所製得的台灣白鳳菜之經水萃取的產物的儲備溶液添加至各個實驗組中，而使得實驗組1至4分別具有一最終濃度為250 μg/mL、500 μg/mL、750 μg/mL以及1000 μg/mL的台灣白鳳菜之經水萃取的產物。至於對照組的細胞則不作任何處理。

各組細胞培養物在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時9天之後，加入含有10%甲醛(formaldehyde)的0.05%結晶紫(crystal violet)來固定所形成的細胞群落並予以染色，接著，以顯微鏡觀察所形成的細胞群落並且使用一BioSpectrum 610成像系統(BioSpectrum 610 Imaging System)(UVP, USA)來進行拍照，繼而以CellProfiler軟體(CellProfiler software)來對所拍得的照片進行分析而計算出細胞群落的數量。

另外，抑制50%人類肝細胞癌細胞株Huh7細胞群落形成的濃度(IC ₅₀)是藉由計算本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物會降低所形成的細胞群落數量達50% (與對照組的細胞相較之下)的濃度而從曲線的線性部份被測定出。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖5中。 結果：

圖5顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所測得的細胞群落形成數量。從圖5可見，與對照組相較之下，實驗組1至4中所形成的細胞群落的數量有顯著的減少，同時會隨著台灣白鳳菜之經水萃取的產物之濃度的增加而更趨於明顯。特別地，本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物對於人類肝細胞癌細胞株Huh7的細胞群落形成的50%抑制濃度(IC ₅₀)為390 μg/mL。這個實驗結果顯示：本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物可以有效地抑制人類肝細胞癌細胞的生長。 實施例 5. 台灣白鳳菜之經水萃取的產物在抑制肝細胞癌幹細胞 (hepatocellular cancer stem cell) 生長上的效用評估

在本實施例中，依據上面實施例1所得到的台灣白鳳菜之經水萃取的產物被拿來進行下面的球體形成分析(sphere forming assay)，俾以評估該台灣白鳳菜之經水萃取的產物在活體外抑制肝細胞癌幹細胞生長上的效用。 實驗材料：

在本實施例中所使用的球體形成培養基(sphere formation medium)為DMEM/F12培養基[添加有1% (v/v)的N2補充劑(N2 supplement)(100X)(Life Technologies, CA, USA)、20 ng/mL表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)以及20 ng/mL鹼性-纖維母細胞生長因子(basic-fibroblast growth factor, basic-FGF)(PeproTech, NJ, USA)]。 實驗方法：

首先，將依照上面“一般實驗材料”的第1項「細胞株的來源與培養」來進行繼代培養的Huh7細胞分別以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)予以清洗過後，以一為1´10 ⁴細胞/mL的數量培養於含有適量之球體形成培養基的極低黏附性培養盤(ultra-low attachment plate)(Corning, NY, USA)中，並置於培養箱(37℃、5% CO ₂)中予以培養歷時1週，而使得Huh7細胞聚集形成腫瘤球體(tumor sphere)，其中癌症幹細胞被富集(enriched)。

接著，收集所形成的腫瘤球體，並加入適量之胰蛋白酶(trypsin)以使腫瘤球體分散而細胞則散浮於培養基中。接著，將所得到的細胞分成4組，其中包括1個對照組與3個實驗組(亦即實驗組1至3)。將各組細胞分別以一為5´10 ³細胞/井的數量培養於含有適量之球體形成培養基的極低黏附性24-井培養盤中，並將適量之依據上面實施例1所製得的台灣白鳳菜之經水萃取的產物的儲備溶液添加至各個實驗組中，而使得實驗組1至3分別具有一最終濃度為125 μg/mL、250 μg/mL以及500 μg/mL的台灣白鳳菜之經水萃取的產物。至於對照組的細胞則不作任何處理。

各組細胞培養物在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時7天之後，以顯微鏡量測並計算各組細胞培養物中所形成的腫瘤球體的數量與平均直徑。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖6與圖7中。 結果：

圖6顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所形成的腫瘤球體數量。從圖6可見，在與對照組相較之下，實驗組1至3的腫瘤球體數量有顯著的減少，同時會隨著台灣白鳳菜之經水萃取的產物之濃度的增加而更趨於明顯。

圖7顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所形成的腫瘤球體直徑大小。從圖7可見，與對照組相較之下，實驗組1至3的細胞培養物中所形成的腫瘤球體直徑有顯著的縮小，同時會隨著台灣白鳳菜之經水萃取的產物之濃度的增加而更趨於明顯。

這個實驗結果顯示：本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物對於人類肝細胞癌幹細胞的生長具有優異的抑制效果。 實施例 6. 台灣白鳳菜之經水萃取的產物在活體內 ( in vivo) 抗肝細胞癌上的效用評估

在本實施例中，申請人使用人類肝細胞癌細胞株Huh7來誘發裸鼠(nude mouse)生成腫瘤，並且藉由腫瘤體積與腫瘤重量的測量來評估本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物在活體內抗肝細胞癌上的效用。 實驗方法：

首先，將Huh7細胞以一為2×10 ⁶細胞的數量加入至50 μL的培養基中，繼而加入50 μL的基質膠(Matrigel)(Cat NO. 354248, BD Biosciences)並予以混合均勻。接著，將所得到的混合物分別皮下注射至各個裸鼠的右側腹部的皮下組織中(亦即，每隻裸鼠分別被注射以100 μL的含有2×10 ⁶肝細胞癌細胞的混合物)，俾以誘發腫瘤生成。在裸鼠的右側腹部形成有可觸及的腫瘤(palpable tumor)且其大小達至95 mm ³(約在皮下注射之後的第10至14天)之後，將帶有腫瘤的裸鼠隨機地分成1個病理對照組(n=5)、1個正對照組(n=5)以及1個實驗組(n=5)，其中實驗組的裸鼠被口服投藥以本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物(配於PBS中，劑量為300 mg/Kg)，正對照組的裸鼠被腹膜內注射(intraperitoneal, IP)以化療藥物順鉑(cisplatin)(配於PBS中，劑量為5 mg/Kg)，而病理對照組的裸鼠則是被腹膜內注射以PBS(劑量為10 mL/Kg)。

之後，實驗組的裸鼠依照上述方式每天被口服投藥1次，投藥時間總共歷時25天。病理對照組與正對照組的裸鼠則是每3天被腹膜內投藥1次，投藥時間總共歷時7天，亦即在開始投藥之後的第4天與第7天再被腹膜內投藥1次。在開始投藥之後的第1、4、7、10、13、16、19、22以及25天，以卡尺(caliper)來量測各組小鼠的腹部腫瘤的長度以及寬度。

腫瘤體積(tumor volume)是藉由將所測得的腫瘤的長度與寬度代入下列公式(2)而被計算出： 公式 (2) ： D ＝ (E×F ²)/2 其中：D＝腫瘤體積(mm ³) E＝腫瘤的長度(mm) F＝腫瘤的寬度(mm)

在開始投藥之後的第25天結束之時，藉由CO ₂來犧牲各組的裸鼠，接著取出各組裸鼠的腫瘤並量測其重量。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖8、圖9以及圖10中。 結果：

圖8顯示在開始投藥之後，形成於各組裸鼠右側腹部的腫瘤體積隨著時間的變化。從圖8可見，病理對照組的裸鼠的腫瘤體積隨著時間而逐漸地增大，而實驗組的裸鼠的腫瘤體積會隨著時間而呈現緩慢增加的情形。

圖9與圖10分別顯示在開始投藥之後的第25天結束之時，從各組裸鼠的腹部取出的腫瘤所測得的體積與重量。從圖9與圖10可見，與病理對照組相較之下，實驗組的裸鼠的腫瘤體積與重量皆有顯著的降低。

上面的實驗結果顯示：本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物可以在活體內有效地抑制肝細胞癌腫瘤的生長。 實施例 7. 台灣白鳳菜之經水萃取的產物與化療藥物的組合在抗肝細胞癌上的效用評估

為了瞭解本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物與臨床上所使用的化療藥物[包含順鉑(cisplatin)、阿黴素(doxorubicin)以及5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)]之組合在抗肝細胞癌上的效用，下面的實驗被進行。 A、 細胞可活性分析：

首先，將不同濃度的順鉑、阿黴素、5-氟脲嘧啶以及250 μg/mL之本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物與上述3種化療藥物中任一者的組合依據下面表4來製成3種化療藥物溶液(亦即化療藥物溶液1至3)以及3種組合溶液(亦即組合溶液1至3)。接著，參照上面實施例3當中所述的方法並使用Huh7細胞來進行細胞可活性分析，藉此而得到化療藥物溶液1至3以及組合溶液1至3在抑制50% Huh7細胞生長下的化療藥物濃度。 表4. 化療藥物溶液1至3以及組合溶液1至3所含有的活性成分 溶液 所含有的活性成分 化療藥物溶液1 順鉑 化療藥物溶液2 阿黴素 化療藥物溶液3 5-氟脲嘧啶 組合溶液1 台灣白鳳菜之經水萃取的產物＋順鉑 組合溶液2 台灣白鳳菜之經水萃取的產物＋阿黴素 組合溶液3 台灣白鳳菜之經水萃取的產物＋5-氟脲嘧啶

另外，Huh7細胞在以組合溶液1至3中任一者予以處理後在抑制50% Huh7細胞生長下的組合指數數值(CI數值)(combination index values, CI values)是依據Chou T. C., (2006), Pharmacol Rev., 58(3):621-81而被計算出。

當CI數值＜1時，代表本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物與化療藥物之組合具有一協同效應(synergistic effect)；當CI數值＝1時，代表本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物與化療藥物之組合具有一加成效應(additive effect)；以及當CI數值＞1時，代表本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物與化療藥物之組合具有一拮抗效應(antagonistic effect)。所得到的實驗結果被顯示於表5中。 表5. 化療藥物溶液1至3以及組合溶液1至3在抑制50% Huh7細胞生長下的化療藥物濃度與CI數值 被用來處理細胞的溶液 化療藥物濃度(μM) CI數值 化療藥物溶液1 1.40±0.097 - 化療藥物溶液2 0.10±0.005 - 化療藥物溶液3 5.50±0.505 - 組合溶液1 0.19±0.005b 0.57 組合溶液2 0.05±0.013b 0.94 組合溶液3 1.37±0.195a 0.69 a：與對應的化療藥物溶液的濃度作比較， p＜0.01 b：與對應的化療藥物溶液的濃度作比較， p＜0.001

由表5可見，組合溶液1至3在抑制50% Huh7細胞生長下的化療藥物濃度皆顯著地低於對應的化療藥物溶液1至3所具者。再者，組合溶液1至3在抑制50% Huh7細胞生長下的CI數值皆小於1。特別地，組合溶液1得到最低的CI數值。這個實驗結果顯示：本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物與臨床上所使用的化療藥物(特別是順鉑)在毒殺肝細胞癌細胞上具有協同效應。

基於上述結果，申請人選用順鉑來與本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物一起進行進一步的效用評估。 B、 群落形成分析 (colony forming assay) ：

首先，將順鉑、本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物以及它們的組合依據下面表6來製成3種順鉑溶液(亦即順鉑溶液1至3)、1種萃取物溶液、以及3種組合溶液(亦即組合溶液1至3)。接著，參照上面實施例4當中所述的方法來進行群落形成分析，其中被處理以該等順鉑溶液的細胞實驗組被稱之為“順鉑組”，而被處理以該萃取物溶液的細胞實驗組被稱之為“萃取物組”，至於被處理以該等組合溶液的細胞實驗組則被稱之為“協同組”。所得到的結果被顯示於圖11中。 表6. 順鉑溶液1至3、萃取物溶液以及組合溶液1至3所含有的活性成分之濃度 順鉑濃度(μM) 台灣白鳳菜之經水萃取的產物的濃度(μg/mL) 順鉑溶液1 0.1 - 順鉑溶液2 0.2 - 順鉑溶液3 0.4 - 萃取物溶液 - 250 組合溶液1 0.1 250 組合溶液2 0.2 250 組合溶液3 0.4 250

從圖11可見，與萃取物組相較之下，協同組1至3中所測得的細胞群落形成百分比皆有顯著的下降，同時會隨著台灣白鳳菜之經水萃取的產物之濃度的增加而更趨於明顯。而與順鉑組1至3相較之下，對應的協同組1至3中所測得的細胞群落形成百分比皆有顯著的下降。

這個實驗結果顯示：本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物與順鉑之組合能夠在活體外協同地抑制肝細胞癌細胞的生長。 C、 在活體內 ( in vivo) 的效用評估：

首先，參照上面實施例6當中所述的方法來誘發裸鼠的腫瘤生成。接著，將該等裸鼠隨機地分成1個順鉑組(n=5)以及1個協同組(n=5)，其中順鉑組的裸鼠被腹膜內注射以順鉑(配於PBS中，劑量為5 mg/Kg)，而協同組的裸鼠則是被腹膜內注射以順鉑(配於PBS中，劑量為5 mg/Kg)，並且在注射後立即被口服投藥以本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物(配於無菌水中，劑量為300 mg/Kg)。

之後，協同組的裸鼠依照上述方式每天被口服投藥1次，投藥時間總共歷時46天。協同組與順鉑組的裸鼠每3天被腹膜內投藥1次，投藥時間總共歷時7天，亦即在開始投藥之後的第4天與第7天再被腹膜內投藥1次。在開始投藥之後的第46天結束之時，藉由CO ₂來犧牲各組的裸鼠，接著取出各組裸鼠的腫瘤並量測其體積與重量。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖12以及圖13中。

從圖12與圖13可見，與順鉑組相較之下，協同組的裸鼠的腫瘤體積與重量皆顯著地降低。

這個實驗結果顯示：本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物與順鉑之組合能夠在活體內協同地抑制肝細胞癌細胞的生長。

綜合以上的實驗結果，申請人認為：依據本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物能夠有效地治療肝細胞癌，並且與臨床上所使用的化療藥物具有協同效用。因此，依據本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物具有發展成為一抗肝細胞癌藥物的高潛力。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示將依據本發明的實施例1所製得的台灣白鳳菜之經水萃取的產物拿來進行HPLC所得到的洗提圖形，其中波峰a1至a3表示在第0至10分鐘的滯留期間所出現的3個主要區分物，而波峰a1至a3的最大吸收波長(λ _max)分別為205 nm、202 nm以及199 nm； 圖2顯示小鼠肝臟細胞株AML12在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所測得的細胞可活性百分比； 圖3顯示大鼠肝臟細胞株Clone 9在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所測得的細胞可活性百分比； 圖4顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊＊＊”表示當與對照組作比較， p＜0.001； 圖5顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所形成的細胞群落形成百分比，其中“＊＊＊”表示當與對照組作比較， p＜0.001； 圖6顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所測得的腫瘤球體數量，其中“＊”表示當與對照組作比較， p＜0.05； 圖7顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7在分別以不同濃度的台灣白鳳菜之經水萃取的產物予以處理後所測得的腫瘤球體大小，其中“＊”表示當與對照組作比較， p＜0.05； 圖8顯示在開始投藥之後，形成於各組裸鼠右側腹部的腫瘤體積隨著時間的變化，其中實驗組表示被口服投藥以本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物的裸鼠；正對照組表示被腹膜內注射以順鉑的裸鼠；病理對照組表示被腹膜內注射以PBS的裸鼠；以及“＊＊＊”表示當與病理對照組作比較， p＜0.001； 圖9顯示在開始投藥之後的第25天結束之時，從各組裸鼠的腹部取出的腫瘤之體積，其中實驗組的裸鼠被口服投藥以本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物；正對照組的裸鼠被腹膜內注射以順鉑；病理對照組的裸鼠則是被腹膜內注射以PBS；以及“＊＊＊”表示當與病理對照組作比較， p＜0.001； 圖10顯示在開始投藥之後的第25天結束之時，從各組裸鼠的腹部取出的腫瘤之重量，其中實驗組的裸鼠被口服投藥以本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物；病理對照組的裸鼠則是被腹膜內注射以PBS；以及“＊＊”表示 p＜0.01； 圖11顯示人類肝細胞癌細胞株Huh7細胞在分別以不同的溶液予以處理後所形成的細胞群落形成百分比，其中“＊”表示 p＜0.05；以及“＊＊”表示 p＜0.01； 圖12顯示在開始投藥之後的第46天結束之時，從各組裸鼠的腹部取出的腫瘤之體積，其中順鉑組的裸鼠被腹膜內注射以順鉑；協同組的裸鼠被腹膜內注射以順鉑並口服投藥以本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物；以及“＊＊”表示 p＜0.01；以及 圖13顯示在開始投藥之後的第46天結束之時，從各組裸鼠的腹部取出的腫瘤之重量，其中順鉑組的裸鼠被腹膜內注射以順鉑；協同組的裸鼠被腹膜內注射以順鉑並口服投藥以本發明的台灣白鳳菜之經水萃取的產物；以及“＊”表示 p＜0.05。

Claims (10)

1. 一種台灣白鳳菜之經水萃取的產物供應用於製備一用來治療肝細胞癌之醫藥品的用途。
2. 一種台灣白鳳菜之經水萃取的產物供應用於製備一用來抑制肝細胞癌幹細胞的生長之醫藥品的用途。
3. 如請求項1或2的用途，其中該台灣白鳳菜之經水萃取的產物實質上不含有黃酮類化合物。
4. 如請求項3的用途，其中該台灣白鳳菜之經水萃取的產物實質上不含有槲皮素、堪非黃酮醇以及綠原酸。
5. 如請求項1或2的用途，其中該醫藥品可與一化學治療藥物一起合併使用。
6. 如請求項5的用途，其中該化學治療藥物是選自於由下列所構成的群組：順鉑、阿黴素、5-氟脲嘧啶、卡培他濱、依託泊苷、愛萊諾迪肯、米托蒽醌、諾拉曲特，以及它們的組合。
7. 如請求項1或2的用途，其中該醫藥品進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
8. 如請求項7的用途，其中該藥學上可接受的載劑包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體。
9. 如請求項1或2的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。
10. 如請求項1或2的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。