CN112546039A - 芹菜素在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用 - Google Patents

芹菜素在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了芹菜素在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。本发明应用MDCK囊泡模型证明芹菜素能够抑制囊泡的形成和生长，并通过胚胎肾囊泡模型确定芹菜素的肾内药理学活性，在不影响肾脏正常生长情况下显著抑制肾脏囊泡的发展。最后在Pkd1基因敲除的多囊肾小鼠模型中进一步证明，芹菜素在小鼠体内可以有效抑制肾脏囊泡的发生、发展。本发明还表明芹菜素无细胞毒性，对肾脏细胞活力没有显著影响，即芹菜素抑制囊泡的作用与细胞毒性无关；同时，芹菜素可以抑制肾脏细胞内增殖相关的信号通路，是其抑制肾脏囊泡发生发展的重要机制之一。以上结果表明：芹菜素可以用于治疗常染色体显性遗传性多囊肾病。

Description

芹菜素在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病 药物中的应用
技术领域
本发明属于芹菜素新的医药用途技术领域，特别涉及芹菜素在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
背景技术
芹菜素(apigenin)(4,5,7-三羟基黄酮)是天然黄酮，广泛存在于蔬菜水果中，是芹菜(Apium graueolens)、欧芹(Petroselinum cripspum)和洋甘菊(Matricariachamomilla)中主要的黄酮类成分。其具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、心脑血管保护等作用。历史研究结果表明，芹菜素可以通过激活外源性及内源性细胞凋亡信号通路，诱导多种肿瘤细胞的凋亡，对多种恶性肿瘤细胞(如胰腺癌CD44+干细胞,HCC,MDA-MB-231,CAL62 ATC)的发展和侵袭具有显著的抑制作用。同时，其也可以通过减少神经毒性物质，如活性氧(ROS)及炎症反应，发挥神经保护的作用。芹菜素的化学结构如下：
Figure BDA0002844224280000011
常染色体显性遗传性多囊肾病(Autosomal dominant polycystic kidneydisease，简称ADPKD)是常见的单基因常染色体显性遗传性肾病，其全球发病率约为1/1000～1/400。约有50％的患者在60岁后会发展为终末期肾病(End-stage renal disease，简称ESRD)。其主要病理学特征是双侧进行性增大的充液囊泡。随着肾小管/集合管源性的囊泡上皮细胞的异常增殖，囊液不断分泌且囊泡逐渐增大，破坏周围正常肾单位，并出现间质纤维化，最终导致肾功能丧失，甚至肾衰竭。目前临床上ADPKD的治疗主要是对症治疗、血液透析或者是肾移植。目前可使用的治疗药物托伐普坦为抗利尿激素2型受体(V2R)阻断剂，通过降低细胞内cAMP水平及下调PKA信号通路，抑制囊泡的发展。但有研究结果表示，其仅对集合管源性的囊泡具有抑制作用，而对近曲小管细胞源性的囊泡无明显影响，且其具有的一系列副作用，如多尿、肝毒性等限制了其临床应用。因此，根据ADPKD的发病机制，筛选抑制囊泡形成和生长的小分子，研发治疗ADPKD的新型药物至关重要，且为多囊肾病领域的研究热点。
发明内容
发明目的：针对现有技术中的缺陷，本发明提供了芹菜素在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
芹菜素在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
所述芹菜素在制备治疗和/或预防Pkd1基因突变引发的常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
所述芹菜素在制备抑制MDCK细胞囊泡和胚胎肾囊泡形成及发展的药物中的应用。
所述芹菜素在制备抑制肾脏囊泡生成和生长的药物中的应用。
所述芹菜素在制备抑制囊泡上皮细胞增殖信号通路药物中的应用。
本发明还提供了一种用于治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病的组合物，所述组合物中包括芹菜素或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料，例如载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂等。
本发明最后提供了包含芹菜素的组合物在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
优选的，所述常染色体显性遗传性多囊肾病为Pkd1基因突变引发的常染色体显性遗传性多囊肾病。
以上应用，在Pkd1基因敲除小鼠中给药剂量为100mg/kg/day，离体实验剂量为0.4～20μM，优选剂量为0.4μM、2μM和10μM。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明应用MDCK囊泡模型证明芹菜素能够抑制囊泡的形成和生长，并通过胚胎肾囊泡模型确定芹菜素的肾内药理学活性，在不影响肾脏正常生长情况下显著抑制肾脏囊泡的发展。最后在Pkd1基因敲除的多囊肾小鼠模型中进一步证明，芹菜素在小鼠体内可以有效抑制肾脏囊泡的发生、发展，且呈现剂量效应关系。
本发明还表明芹菜素无细胞毒性，对肾脏细胞活力没有显著影响，即芹菜素抑制囊泡的作用与细胞毒性无关；同时，芹菜素可以抑制肾脏细胞内增殖相关的信号通路，是其抑制肾脏囊泡发生发展的重要机制之一。
以上结果表明：芹菜素可以用于治疗常染色体显性遗传性多囊肾病。
附图说明
图1为MDCK细胞集落与囊泡示意图。
图2为芹菜素抑制MDCK囊泡作用的生长图及统计图；其中，上图为芹菜素抑制MDCK囊泡形成及生长的统计图，下图为芹菜素对囊泡生长的抑制图。
图3为小鼠胚胎肾囊泡模型示意图。
图4为芹菜素抑制小鼠胚胎肾囊泡作用的生长图及统计图；其中，上图为芹菜素抑制小鼠胚胎肾囊泡作用的生长图，下图为不同剂量的芹菜素对小鼠胚胎肾囊泡生长的抑制作用图。
图5为Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片及肾重指数统计图；其中，左图为Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片，右侧为肾重指数统计图。
图6为Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠模型给药后肾脏组织切片HE染色图及肾脏的囊性指数图。
图7为Pkd1flox/flox；AQP2-Cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片及肾重指数统计图；其中，左图为Pkd1flox/flox；AQP2-Cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片，右侧为肾重指数统计图。
图8为Pkd1flox/flox；AQP2-Cre小鼠模型给药后肾脏组织切片HE染色图及肾脏的囊性指数图。
图9为芹菜素对mIMCD细胞活力的影响示意图。
图10为芹菜素对小鼠肾脏增殖信号的影响示意图；其中，上图为芹菜素抑制Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠增殖信号的Western blot图，下图为芹菜素抑制Pkd1flox/flox；AQP2-Cre小鼠增殖信号的Western blot图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下面描述的实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂、仪器等，若无特殊说明，均可从商业途径得到；所用的定量实验，均设置三次重复，结果取平均值。
下述实例中的犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cells,MDCK)从ATCC细胞库中购得，编号为CCL-34。其中MDCK囊泡和胚胎肾囊泡实验分别采用三个剂量0.4μM、2μM和10μM的芹菜素。小鼠肾髓质集合管细胞(Mouse inner medulla collecting duct cells,mIMCD)从ATCC细胞库中购得，编号为CRL-2123。其中细胞毒性实验所用剂量为0.5μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM和80μM。
实施例1芹菜素对囊泡生长的抑制
体外在三维基质胶(Purecol Collagen,Inamed Biomaterials Fremont公司，货号5409)中培养MDCK细胞。如图1，培养液A为在10xMEM培养液中添加三维基质胶混合物，其中三维基质胶浓度为2.9mg/ml、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)浓度为10mM、青霉素浓度为100U/ml、链霉素浓度为100μg/ml，pH为7.4。培养液B为含有FBS和毛喉素(FSK，Sigma公司，货号F6886)的DMEM/F12培养液。其中FBS浓度为10％、毛喉素浓度为10μM。DMEM/F12培养液为由DMEM培养基(美国Invitrogen公司，商品目录号12100-046)和F12培养基(美国Invitrogen公司，商品目录号21700-075)等体积混合得到的液体。
将MDCK细胞混匀于400μl的培养液A中，加入24孔板的孔中，每孔细胞数相同，为800个/孔。将24孔板置于37℃、5％CO2细胞培养箱中约90分钟，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml培养液B，置于培养箱中培养，培养4天左右即可在显微镜下观察到单层上皮细胞包被的囊泡。此时在细胞培养孔中加入终浓度分别为0.4μM、2μM和10μM的芹菜素继续培养，每个剂量重复3个孔。每12小时更换新鲜的含有芹菜素和10μM毛喉素的培养液，每两天拍照记录每孔至少20个囊泡直径以评价不同浓度的芹菜素对囊泡生长的抑制作用，共观察8天，培养12天时停止，作囊泡生长曲线。芹菜素抑制囊泡形成实验中，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml含有10μM毛喉素的培养液，其中芹菜素浓度分别为0.4μM、2μM和10μM，每个剂量重复3个孔。每12小时更换新鲜的含有芹菜素和10μM毛喉素的培养液，培养至第6天时，统计每孔囊泡数目，统计囊泡形成率。
芹菜素对囊泡生长的抑制作用结果如图2所示。
上图为芹菜素抑制MDCK囊泡作用的生长图：对照组为不加芹菜素的处理组。其中，第一排表示第5～12天用仅含毛喉素的培养液培养，第二排表示第5～12天用含有10μM的芹菜素和毛喉素的培养液培养。可以看出，芹菜素可以显著抑制囊泡的生长。
下图左边为芹菜素对囊泡形成的统计图，右边为芹菜素对囊泡生长的抑制曲线图：实心圆曲线代表第5～12天用只含有毛喉素的培养液培养，空心圆曲线代表第5～12天用含有0.4μM的芹菜素和毛喉素的培养液培养，倒三角曲线代表第5～12天用含有2μM的芹菜素和毛喉素的培养液培养，正三角曲线代表第5～12天用含有10μM的芹菜素和毛喉素的培养液培养。
实施例2芹菜素对小鼠胚胎肾囊泡生长的抑制
将6周龄以上的C57BL/6小鼠(北京大学医学部实验动物中心)按照1∶1的数量进行雌雄同笼交配，第2天早上观察雌鼠是否有阴栓，若有阴栓则表示雌鼠已怀孕0.5天；若无阴栓，则先分笼，晚上再合笼，第二日再观察。将怀孕雌鼠继续单独喂养13天，第13天取胚胎肾置于transwell板(Corning公司，货号3401)的上层小室中培养。下层培养孔中加入含有终浓度为100μM的8-Br-cAMP(Sigma公司，货号B-5386)的DMEM培养液进行培养，在8-Br-cAMP的作用下，肾组织内会形成多发进行性生长的囊泡，可以作为评价芹菜素预防和/或治疗ADPKD的体外整体器官水平筛药模型。
芹菜素抑制小鼠胚胎肾囊泡作用结果见图4。
其中，上图为芹菜素抑制小鼠胚胎肾囊泡作用的生长图，第一列为胚胎肾在加入100μM 8-Br-cAMP的培养液中持续培养到第6天，第二、三、四列为胚胎肾在含有100μM8-Br-cAMP的培养液的基础上，加入终浓度为0.4μM、2μM、10μM的芹菜素进行培养，培养至第6天，每12h更换新鲜的相应的培养液。第五列为胚胎肾在100μM 8-Br-cAMP刺激的基础上，在培养液中加入10μM的芹菜素进行处理，培养至第4天，第5～6天在仅含有8-Br-cAMP的培养液中培养，每天跟踪拍照记录肾脏的状况，实验重复三次。下图左边为不同剂量的芹菜素对小鼠胚胎肾囊泡的抑制作用。下图右边为芹菜素对胚胎肾囊泡抑制生长作用具有可逆性。
结果发现，芹菜素明显抑制了胚胎肾囊泡的发展，并且其对胚胎肾囊泡的抑制作用呈剂量依赖关系。并且当第5～6天药物被去除后，囊泡又重新恢复生长。
实施例3体内实验
所用小鼠按照如下方法得到：将Pkd1flox/flox小鼠和Ksp-Cre小鼠交配得到子一代Pkd1+/-；Ksp-Cre小鼠，将Pkd1+/-；Ksp-Cre小鼠的公鼠和母鼠交配，得到野生型小鼠Pkd1+/+；Ksp-Cre和Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠(kPKD小鼠)。其中，Pkd1flox/flox小鼠和Ksp-Cre小鼠的遗传背景均为C57BL/6小鼠，见文献(Wang W,Li F,Sun Y,et al.Aquaporin-1retardsrenal cyst development in polycystic kidney disease by inhibition of Wntsignaling.FASEB J.2015；29(4):1551-1563.)。Pkd1flox/flox小鼠为在C57BL/6小鼠背景下全肾特异性敲除Pkd1基因的小鼠，其出生后即发生快速进行性发展的ADPKD，在出生后第一天即可观察到肾脏囊泡，可存活10天左右。在小鼠出生后第一天进行基因鉴定，确定小鼠的基因型。Pkd1flox/flox小鼠对应的野生型C57BL/6小鼠记为Pkd1+/+小鼠。
将野生型小鼠(Pkd1+/+；Ksp-Cre)和kPKD小鼠(Pkd1flox/flox；Ksp-Cre)均随机分为两组，空白对照组(Ctrl)(空溶剂组，即注射生理盐水)及给药组(Api)(小鼠每千克体重每天给药剂量为100mg的芹菜素)，每组小鼠大于等于5只。每只小鼠从出生后第1天开始，每24小时使用胰岛素注射器皮下注射给药(每次注射量均为20μl)，空白对照组(Ctrl)每只小鼠每次注射20μl的生理盐水，给药组(Api)每只小鼠每次注射20μl的芹菜素溶液(芹菜素与生理盐水混合物100mg/ml，调节pH至7.0)，持续给药至出生后第5天。称重，处死，取组织。
根据小鼠的肾脏大小及体重如图5，左图为Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠模型给药后小鼠大体及肾脏照片，各组之间没有显著性差异。从肾脏大小来看，出生后第5天，基因敲除PKD小鼠中，肾脏明显有充液囊泡，体积变大，给予芹菜素治疗以后，肾脏体积明显变小。而芹菜素在此剂量对正常肾脏大小无明显影响。芹菜素治疗显著降低了多囊肾小鼠的肾重指数(双侧肾重/体重)(图5右图)。小鼠肾脏切片H&E染色的结果显示，在PKD小鼠中，小鼠肾脏中有大量囊泡，给予芹菜素后，小鼠肾脏囊泡明显减少变小，肾脏组织结构改善(图6)。
所用集合管特异性Pkd1基因敲除小鼠按照如下方法得到：将Pkd1flox/flox小鼠和AQP2-Cre小鼠交配得到子一代Pkd1+/-；AQP2-Cre小鼠，将Pkd1+/-；AQP2-Cre小鼠的公鼠和母鼠交配，得到野生型小鼠Pkd1+/+；AQP2-Cre和Pkd1flox/flox；AQP2-Cre小鼠(cPKD小鼠)。其中，Pkd1flox/flox小鼠和AQP2-Cre小鼠的遗传背景均为C57BL/6小鼠，见文献(Limin Su,LiyingLiu,Yingli Jia,et al.Ganoderma triterpenes retard renal cyst development bydownregulating Ras/MAPK signaling and promoting cell differentiation.KidneyInt.2017；92(6):1404-1418.)。Pkd1flox/flox小鼠为在C57BL/6小鼠背景下集合管特异性敲除Pkd1基因的小鼠，其出生后即发生快速进行性发展的ADPKD，可存活20天左右。在小鼠出生后第一天进行基因鉴定，确定小鼠的基因型。Pkd1flox/flox小鼠对应的野生型C57BL/6小鼠记为Pkd1+/+小鼠。
将野生型小鼠(Pkd1+/+；AQP2-Cre)和cPKD小鼠(Pkd1flox/flox；AQP2-Cre)均随机分为两组，空白对照组(Ctrl)(空溶剂组，即注射生理盐水)及给药组(Api)(小鼠每千克体重每天给药剂量为100mg的芹菜素)，每组小鼠大于等于5只。每只小鼠从出生后第1天开始，每24小时使用胰岛素注射器皮下注射给药(每次注射量均为20μl)，空白对照组(Ctrl)每只小鼠每次注射20μl的生理盐水，给药组(Api)每只小鼠每次注射20μl的芹菜素溶液(芹菜素与生理盐水混合物100mg/ml，调节pH至7.0)，持续给药至出生后第7天。称重，处死，取组织。
根据小鼠的肾脏大小及体重，如图7，左图为Pkd1flox/flox；AQP2-Cre小鼠模型给药后小鼠大体及肾脏照片，各组之间没有显著性差异。从肾脏大小来看，出生后第7天，基因敲除PKD小鼠中，肾脏明显有充液囊泡，体积变大，给予芹菜素治疗以后，肾脏体积明显变小。而芹菜素在此剂量对正常肾脏大小无明显影响。芹菜素治疗显著降低了多囊肾小鼠的肾重指数(双侧肾重/体重)(图7右图)。小鼠肾脏切片H&E染色的结果显示，在cPKD小鼠中，小鼠肾脏中有大量囊泡，给予芹菜素后，小鼠肾脏囊泡明显减少变小，肾脏组织结构改善(图8)。
实施例4细胞毒性实验
通过MTT法确定芹菜素的细胞毒性
将对数期的小鼠内髓集合管上皮细胞(mouse inner medulla collecting ductcells,mIMCD cells)细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔含有1×104个细胞，每孔给予100μl含有7.5％胎牛血清(FBS，荷兰Gibco Fisher Scientific公司)的DMEM培养基(美国Invitrogen公司,商品目录号12100-046)，置于37℃的5％CO2培养箱中培养24小时。去除培养液，加上无FBS的DMEM培养液，血清饥饿24小时后，向细胞培养孔(给药孔)中加入含有不同浓度的芹菜素的DMEM培养，每孔加入的体积均为100ul，芹菜素的浓度分别为0μM、0.5μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM和80μM。每个浓度有5个重复孔，培养24小时后除去上清液，每孔加入80μl不含有血清的DMEM培养液及20μl的5mg/ml的MTT溶液，置于培养箱中继续培养3小时，然后移除上清液，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，置于培养箱中15分钟，待紫色结晶全部溶解，将96孔板置于酶标仪中，检测各孔OD值(检测波长490nm)。实验设置调零孔(含有等量的培养基、MTT和DMSO，不含有芹菜素，无细胞)和对照孔(含有等量的细胞、培养基、MTT和DMSO，不含有芹菜素，即芹菜素为0μM的给药孔)。按照下述公式计算细胞活力，细胞活力＝(给药孔-调零孔)/(对照孔-调零孔)×100％。实验重复3次。
图9为MTT为芹菜素对mIMCD细胞的细胞毒性实验结果图，结果显示:20μM及以下的芹菜素给药组与对照组的OD值之间无明显差异,不抑制mIMCD细胞的细胞活力，对mIMCD细胞无毒性作用，说明芹菜素在有效剂量10μM及以下浓度抑制囊泡生长的作用与其细胞毒性无关。
实施例5 Western Blot实验
实验方法：分别取kPkd1(-/-)、kPkd1(+/+)、cPkd1(-/-)、cPkd1(+/+)对照及给芹菜素注射小鼠全肾组织，提取蛋白，用Western blot研究芹菜素对肾脏增殖信号表达水平的影响。
Western blot方法:用RIPA裂解液处理肾脏组织，收取蛋白，用BCA法进行蛋白定量。调整样品的蛋白量进行SDS-PAGE，将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上。PBST洗膜3次，每次5min。室温下用5％脱脂奶粉(PBST溶解)封闭PVDF膜1h。随后加入抗增殖和纤维化等信号分子抗体，4℃孵育过夜。第二天PBST洗脱3次，每次5分钟，加入相应的二抗，室温孵育1h，PBST漂洗3次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，Bio-Rad凝胶成像胶采集图像，用ImageJ对图像进行灰度分析。上述实验均重复3～5次。
实验结果:图10为芹菜素对小鼠肾脏增殖信号的影响示意图，结果表明:芹菜素可以明显抑制肾脏增殖信号分子的表达水平，包括ERK1/2、S6等。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.芹菜素在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芹菜素在制备治疗和/或预防Pkd1基因突变引发的常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芹菜素在制备抑制MDCK细胞囊泡和胚胎肾囊泡形成和发展的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芹菜素在制备抑制肾脏囊泡生成和生长的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芹菜素在制备抑制囊泡上皮细胞增殖信号通路的药物中的应用。
6.一种用于治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病的组合物，所述组合物中包括芹菜素或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料。
7.包含芹菜素的组合物在制备治疗和/或预防常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述常染色体显性遗传性多囊肾病为Pkd1基因突变引发的常染色体显性遗传性多囊肾病。
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CN106377522A (zh) * 2016-08-18 2017-02-08 天承南运(天津)科技有限公司 芹菜素用于制备肝癌上皮细胞‑间充质转化抑制药物的应用

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